Ezrin介導(dǎo)中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶誘導(dǎo)的人氣道上皮細(xì)胞株分泌黏蛋白增加

李 琪，李 娜，尤列．皮爾曼，維克多．科羅索夫，周向東*

(1．重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶400010;2.俄羅斯醫(yī)學(xué)科學(xué)院遠(yuǎn)東呼吸生理與病理研究中心，布拉戈維申斯克675000)

慢性阻塞性肺疾病急性加重期及哮喘重度發(fā)作尤其是致死性哮喘發(fā)作的患者，中性粒細(xì)胞在氣道大量募集，氣道黏液常呈“爆發(fā)式”分泌狀態(tài)，短時(shí)期內(nèi)急劇增多的黏液致廣泛黏液栓形成，出現(xiàn)嚴(yán)重氣道阻塞、導(dǎo)致窒息甚至死亡。此現(xiàn)象與細(xì)胞的胞吐行為密切相關(guān)。胞吐行為主要?dú)w因于細(xì)胞的極性活動(dòng)。Ezrin 作為膜連接蛋白(ezrin/radixin/moesin，ERM)家族的一員，是膜蛋白和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架間確切的連接分子，存在于富含肌動(dòng)蛋白的表面結(jié)構(gòu)，在肺組織里也有明顯表達(dá)，其能參與細(xì)胞的多種功能活動(dòng)如細(xì)胞黏附、遷移以及細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的組裝，與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)及極性分泌有關(guān)［1］。故此推測(cè)，Ezrin 是否與氣道上皮細(xì)胞的極性分泌有關(guān)?是否參與氣道的黏液分泌過(guò)程?本研究以中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elatase，NE)作為氣道黏蛋白(mucin，MUC)主要病理性表型MUC5AC 分泌的誘導(dǎo)因素，對(duì)Ezrin 在其中的作用作一探討，以期明確氣道炎性反應(yīng)時(shí)黏蛋白胞吐的潛在動(dòng)力機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人氣道上皮HBE16 細(xì)胞株(上海復(fù)祥生物科技有限公司);pEGFP-N1-Ezrin-Wt、pEGFP-N1-Ezrin-T567D 和 pEGFP-N1-Ezrin-T567A (法國(guó) Monique Arpin 教授饋贈(zèng));pEGFP-N1 空載體(Clontech 公司);DEME/Ham's F12 培養(yǎng)基、HEPES、Trizol 和小牛血清(Sigma 公司);NE(Calbiochem 公司);兔抗Ezrin(H-276)多克隆抗體、HRP-羊抗兔抗體、HRP-兔抗鼠抗體(Santa Cruz 公司);小鼠抗MUC5AC 45M1 單克隆抗體(Neomarkers 公司);OPTI-MEM 無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)(Invitrogen 公司);X-treme GENE9DNA 轉(zhuǎn)染試劑(Roche 公司);MMLV(重組鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶)第一鏈cDNA 合成試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定:提取純化各組質(zhì)粒，分別以限制性內(nèi)切酶Xho Ⅰ及BamH Ⅰ各0.5 μL加入反應(yīng)體系進(jìn)行酶切，37 ℃水浴酶切反應(yīng)2 h。酶切完成后進(jìn)行電泳分析。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞數(shù)調(diào)整濃度至每孔(1 ～2)×105個(gè)/mL，細(xì)胞匯合達(dá)30% ～50%左右，以O(shè)PTI-MEM 無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入4 μL X-treme GENE9DNA 轉(zhuǎn)染試劑混勻，加入重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按操作說(shuō)明進(jìn)行。于37 ℃、5% CO2濕度培養(yǎng)箱孵育，4 ～6 h 換液1 次，24 h 后進(jìn)行細(xì)胞處理并行相關(guān)檢測(cè)。

1.2.3 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理:于6 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)HBE16 氣道上皮細(xì)胞每孔5 ×105個(gè)/mL，加入2 mL DMEM/Ham's F12 培養(yǎng)液(含10% 小牛血清)，37 ℃、5% CO2濕度培養(yǎng)箱孵育，常規(guī)換液培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)70% ～80%時(shí)傳代，調(diào)整細(xì)胞濃度至2 ×105個(gè)/mL并分組:1)空白對(duì)照組:無(wú)血清DMEM/Ham's F12 液中繼續(xù)培養(yǎng);2)NE 刺激組:培養(yǎng)液中加入NE 0.5 μmol/L;3)pEGFP-N1 組:細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-N1 后，無(wú)血清DMEM/Ham's F12 液中常規(guī)換液培養(yǎng)，不予其他處理;4)pEGFP-N1-Ezrin-Wt組:細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型pEGFP-N1-Ezrin-Wt 后，無(wú)血清DMEM/Ham's F12 液中常規(guī)換液培養(yǎng)，不予其他處理;5)NE + pEGFP-N1-Ezrin-Wt 組:以pEGFP-N1-Ezrin-Wt 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后再加入NE 0.5 μmol/L;6)NE+pEGFP-N1-Ezrin-T567D 組:pEGFP-N1-Ezrin-T567D 中Ezrin 蘇氨酸Thr567 定點(diǎn)突變?yōu)樘於彼酇sp，模擬永久磷酸化Ezrin。以其轉(zhuǎn)染細(xì)胞后再加入NE 0.5 μmol/L;7)NE + pEGFP-N1-Ezrin-T567A 組:pEGFPN1-Ezrin-T567A 中Ezrin 蘇氨酸Thr567 定點(diǎn)突變?yōu)楸彼酇la，模擬被遏制磷酸化的Ezrin。以其轉(zhuǎn)染細(xì)胞后再加入NE 0.5 μmol/L。由NE 作用的劑量、時(shí)間曲線分析選擇濃度為0.5 μmol/L作用30 min(表1)。各組均3 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)30 min 后分別收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞行相關(guān)檢測(cè)，每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.2.4 MTT 檢測(cè)各組細(xì)胞的活力:96 孔板中每孔按濃度1×104個(gè)/mL加入200 μL 細(xì)胞懸液，以上處理組各6 個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5% CO2濕度培養(yǎng)箱孵育，分別取10、20、30 和60 min 時(shí)間點(diǎn)行MTT 測(cè)定。吸除各孔舊培養(yǎng)液，加入200 μL/孔無(wú)血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液及20 μL/孔MTT 液(5 g/L)，放入37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，吸除各孔原液后加入150 μL/孔二甲基亞砜(DMSO)，微量振蕩器振蕩15 min，自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀(TECAN sunrise remote 奧地利)以570 nm 波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度(A)值。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)MUC5AC mRNA水平:Trizol 法分別提取各組細(xì)胞內(nèi)總RNA，經(jīng)鑒定，樣品A260/A280比值均介于1.8 ～2.0，初步定量后保存于－20℃?zhèn)溆?。兩步法行RT-PCR。cDNA 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按PrimeScript 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。MUC5AC上游引物:5'-CAGCCACGTCCCCTTCAATA-3'，下游引物:5'-ACCGCATTTGGGCATCC-3'。GAPDH 上游引物:5'-GGGAAGGTGAAGGTGGGAGTG-3'，下游引物:5'-AGC AGAGGGGGCAGAGATGAT-3'。反應(yīng)參數(shù):94 ℃預(yù)變性3 min，后緊隨35 個(gè)循環(huán)，循環(huán)參數(shù):94 ℃45 s，58 ℃30 s，70 ℃60 s，后72 ℃延伸5 min采用2－△△CT方法分析目的基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量。CT 是熒光達(dá)到熒光閾值的循環(huán)數(shù)，△△CT=(CT 目的基因－CT 管家基因)實(shí)驗(yàn)組－(CT 目的基因－CT 管家基因)對(duì)照組。

1.2.6 ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞及培養(yǎng)上清MUC5AC 蛋白含量:RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定并調(diào)整蛋白濃度備用;收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液并測(cè)定蛋白含量備用。以提取的細(xì)胞蛋白或培養(yǎng)上清液于40 ℃包被96 孔酶標(biāo)反應(yīng)板，干燥，以PBS 清洗酶標(biāo)板3 次，2%小牛血清室溫封閉1 h;再次PBS洗滌3 次，加入小鼠抗MUC5AC 單克隆抗體45M1(1∶100，用含0.05%吐溫20 (Tween-20)的PBS 稀釋至50 μL)，孵育1 h;洗滌3 次，加入100 μL 辣根過(guò)氧化物酶－羊抗小鼠IgG(1∶10 000)孵育1 h;四甲基聯(lián)苯胺過(guò)氧化物酶溶液顯色，終止反應(yīng)后測(cè)各孔吸光度A 值(λ =450 nm)，與標(biāo)準(zhǔn)品比較而得到MUC5AC 的相對(duì)值。

1.2.7 免疫熒光觀察Ezrin 在HBE16 氣道上皮細(xì)胞的表達(dá):貼壁生長(zhǎng)良好的HBE16 氣道上皮細(xì)胞經(jīng)消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×105個(gè)/mL，接種于24孔板中8 mm×8 mm 小玻片進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞匯合約70%左右后，換用無(wú)血清培養(yǎng)液維持24 h，分組進(jìn)行不同處理。吸棄培養(yǎng)液，PBS 漂洗。4%多聚甲醛室溫下固定30 min，PBS 漂洗后以0.4%聚乙二醇辛基苯基醚Triton-X 100 作用20 min，PBS 沖洗加5%羊血清封閉30 min。傾去血清后滴加兔抗Ezrin 多克隆抗體(1∶500;1 mg/L)，置濕盒內(nèi)4 ℃過(guò)夜。PBS 漂洗后加FITC 標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶500)，置濕盒內(nèi)室溫下孵育30 min，PBS 清洗后滴加5 g/mL PI，孵育5 min 后PBS 漂洗5 min ×3 次。50%的甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察，以QuantReport 軟件分析細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1 各組MTT 吸光度(A)值Table 1 MTT absorbance value in different cell groups (±s，n=6)

表1 各組MTT 吸光度(A)值Table 1 MTT absorbance value in different cell groups (±s，n=6)

group5 min10 min15 min20 min30 min control0.187 ±0.0030.279 ±0.0080.325 ±0.0100.453 ±0.0070.789 ±0.011 0.01 μmol/L NE0.187 ±0.0040.271 ±0.0030.303 ±0.0080.405 ±0.0030.659 ±0.007 0.1 μmol/L NE0.181 ±0.0030.264 ±0.0070.298 ±0.0050.396 ±0.0120.636 ±0.009 0.5 μmol/L NE0.180 ±0.0050.258 ±0.0040.289 ±0.0060.388 ±0.0080.643 ±0.007 1 μmol/L NE0.179 ±0.0020.253 ±0.0060.271 ±0.00 90.393 ±0.0110.404 ±0.009

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果

分別在4 700 bp、1 801 bp 左右出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期的pEGFP-N1 和Ezrin 目的基因片段長(zhǎng)度一致(圖1)。

2.2 各組中細(xì)胞增殖的變化

各處理因素對(duì)細(xì)胞的增殖活力無(wú)明顯影響(表2)。

圖1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果Fig 1 Indentification of recombinant constructs by restriction enzyme

2.3 pEGFP-N1-Ezrin 各突變體對(duì)MUC5AC 蛋白及MUC5AC mRNA 含量的影響

轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Ezrin-T567D 的細(xì)胞經(jīng)NE 刺激后，分泌至上清液的MUC5AC 蛋白含量較單純NE 刺激組有明顯上升(P＜0.01)，但細(xì)胞內(nèi)MUC5AC 蛋白含量及MUC5AC mRNA 水平則無(wú)明顯變化。而pEGFP-N1-Ezrin-T567A 轉(zhuǎn)染組在NE刺激后，上清液中MUC5AC 蛋白含量與單純NE組相比有明顯下降(P＜0.05)，胞漿MUC5AC 蛋白含量卻較單純NE 刺激組有所升高(P＜0.05);而MUC5AC mRNA 水平與單純NE 刺激組相比無(wú)差別(表3)。

2.4 pEGFP-N1-Ezrin 各突變體對(duì)Ezrin 蛋白細(xì)胞內(nèi)表達(dá)及分布的影響

轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Ezrin-T567D 的細(xì)胞經(jīng)NE 刺激后，細(xì)胞內(nèi)Ezrin 表達(dá)較野生型pEGFP-N1-Ezrin-Wt轉(zhuǎn)染組及NE 刺激組明顯增強(qiáng)，且胞膜分布增多(P＜0.05)。pEGFP-N1-Ezrin-T567A 轉(zhuǎn)染組在NE刺激后，Ezrin 蛋白表達(dá)較野生型pEGFP-N1-Ezrin-Wt 轉(zhuǎn)染組無(wú)明顯變化;而與pEGFP-N1-Ezrin-T567D組相比，表達(dá)有明顯減少，且未出現(xiàn)向胞膜聚集的趨勢(shì)(P＜0.05)(圖2，表4)。

表2 各組MTT 吸光度(A)值Table 2 MTT absorbance value in different cell groups(±s，n=6)

表2 各組MTT 吸光度(A)值Table 2 MTT absorbance value in different cell groups(±s，n=6)

group10 min20 min30 min60 min control0.134 ±0.0040.153 ±0.0130.331 ±0.0150.357 ±0.019 NE0.139 ±0.0090.148 ±0.0110.327 ±0.0120.391 ±0.012 pEGFP-N10.133 ±0.0110.152 ±0.0130.382 ±0.0080.401 ±0.014 pEGFP-N1-Ezrin-Wt0.151 ±0.0080.161 ±0.0110.391 ±0.0130.421 ±0.018 NE+pEGFP-N1-Ezrin-Wt0.132 ±0.0100.181 ±0.0190.422 ±0.0150.405 ±0.021 NE+pEGFP-N1-T567D0.173 ±0.0120.178 ±0.0180.398 ±0.0130.385 ±0.017 NE+pEGFP-N1-T567A0.142 ±0.0080.193 ±0.107 0.394 ±0.0130.407 ±0.018

Table 表33T h各e l組ev細(xì)els胞 of中 M黏U蛋C5白AC5AiCn e含ac量h 檢gr測(cè)ou結(jié)p 果(x比±較s，n=3)

圖2 免疫熒光檢測(cè)各組Ezrin 蛋白的表達(dá)Fig 2 Expression of Ezrin protein detected by immunofluorescence (×100)

表4 各組細(xì)胞中Ezrin 蛋白表達(dá)相對(duì)熒光強(qiáng)度Table 4 The Ezrin protein expression in each group(±s，n=3)

表4 各組細(xì)胞中Ezrin 蛋白表達(dá)相對(duì)熒光強(qiáng)度Table 4 The Ezrin protein expression in each group(±s，n=3)

#P＜0.01，*P＜0.01 compared with pEGFP-N1 group;*P＜0.05 compared with NE+pEGFP-N1-Ezrin-Wt group．

groupfluorescence intensity pEGFP-N128.97 ±5.36 NE+pEGFP-N140.64 ±7.05 NE+pEGFP-N1-Ezrin-Wt48.85 ±9.32#NE+pEGFP-N1-Ezrin-T567D59.43 ±8.41*NE+pEGFP-N1-Ezrin-T567A41.82 ±4.16

3 討論

氣道黏液的基礎(chǔ)性分泌是呼吸系統(tǒng)的重要屏障，具有異物清除、氣道微環(huán)境保護(hù)等功能。而病原體、炎性介質(zhì)、蛋白酶等可誘導(dǎo)細(xì)胞胞吐動(dòng)作的發(fā)生，使黏液呈“爆發(fā)式”分泌狀態(tài)［2－3］。細(xì)胞黏液胞吐分泌是一復(fù)雜的生物動(dòng)力學(xué)過(guò)程，有眾多分子參與。研究發(fā)現(xiàn)，膜骨架相關(guān)蛋白ERM 家族中的Ezrin 具有連接膜蛋白和細(xì)胞骨架的作用，與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及極性分泌有關(guān)［4］。Ezrin 蛋白是多種氨基酸激酶的底物，磷酸化是Ezrin 蛋白活性的重要調(diào)節(jié)方式［5］。Ezrin 的保守磷酸化位點(diǎn)位于Ezrin Thr 567和Thr564［6］。其中EzrinThr567 還參與胃壁細(xì)胞的極性形成［7］、細(xì)胞表面膜皺褶及微絨毛的形成［8］。

既往研究證實(shí)，NE 是一極強(qiáng)的黏液促動(dòng)劑，能通過(guò)促進(jìn)黏蛋白表達(dá)及胞吐增加使氣道呈現(xiàn)黏液高分泌狀態(tài)［9］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)NE 刺激及轉(zhuǎn)染野生型pEGFP-N1-Ezrin-Wt 后，細(xì)胞中Ezrin 蛋白表達(dá)明顯增加，在胞膜的聚集亦明顯增多;而模擬Ezrin 永久磷酸化的載體pEGFP-N1-Ezrin-T567D 轉(zhuǎn)染組，Ezrin 蛋白表達(dá)增加更為顯著，主要積聚于胞膜。細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染模擬被遏制磷酸化Ezrin 的載體pEGFP-N1-Ezrin-T567A 后，Ezrin 在胞膜的表達(dá)明顯減少，散在分布于胞質(zhì)。說(shuō)明NE 能誘導(dǎo)細(xì)胞中Ezrin 向細(xì)胞頂膜定位，而在磷酸化載體pEGFP-N1-Ezrin-T567D 轉(zhuǎn)染組中，該引導(dǎo)作用更為顯著。

pEGFP-N1-Ezrin-T567D 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清中MUC5AC 的蛋白水平較單純NE 組及pEGFP-N1-Ezrin-Wt 組有明顯增加。但胞質(zhì)中MUC5AC 蛋白水平卻顯示有減少，表明Thr567 永久磷酸化的Ezrin 與野生型Ezrin 相比，更能增加黏蛋白MUC5AC 的胞吐外分泌，使得胞內(nèi)貯存的MUC5AC相對(duì)減少。但就胞內(nèi)胞外分泌的蛋白總量而言，野生型Ezrin 載體組和磷酸化Ezrin 載體組并無(wú)顯著差異。提示Ezrin Thr567 磷酸化對(duì)MUC5AC 蛋白的合成并無(wú)顯著影響，但在MUC5AC 從胞質(zhì)向胞外分泌的過(guò)程中起著積極推動(dòng)作用。

此外，pEGFP-N1-Ezrin-T567A 組中，分泌至培養(yǎng)上清的MUC5AC 蛋白較對(duì)照組相比，有明顯減少，而胞質(zhì)中MUC5AC 蛋白含量則高于對(duì)照組。表明若EzrinTh567 位點(diǎn)喪失磷酸化功能，NE 尚能刺激MUC5AC 蛋白合成，但其的胞外分泌過(guò)程則較EzrinThr567 磷酸化功能正常的野生型載體組明顯減少，導(dǎo)致胞內(nèi)貯存的MUC5AC 蛋白含量相對(duì)增高。

綜上，本實(shí)驗(yàn)表明，Ezrin 是NE 誘導(dǎo)的氣道黏蛋白分泌的重要促動(dòng)因子，其Thr567 位點(diǎn)磷酸化可能起著關(guān)鍵作用。

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