新疆漢族、維吾爾族HPV16E6基因變異與子宮頸癌及宮頸病變的關(guān)系

古麗娜爾·阿不拉，朱開春，瑪依努爾·尼牙孜*，馬正海

(1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院婦科，新疆烏魯木齊830001;2.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046)

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，大量流行病學(xué)資料顯示，在99%以上的宮頸癌組織中存在人乳頭瘤病毒(human Papillomavirus，HPV)DNA，HPV感染是宮頸癌發(fā)生的主要并且為始動(dòng)因素［1］。HPV存在100 多種亞型，其中HPV16 與宮頸癌發(fā)病密切相關(guān)［2］。HPV16 早期基因區(qū)(early region，E 區(qū))、由6 個(gè)開放讀碼框架(open reading frame，ORF)組成，其中E6 是HPV16 主要致癌基因之一。E6 蛋白與抑癌基因P53 結(jié)合導(dǎo)致P53 蛋白降解以及生物學(xué)功能喪失，從而引起細(xì)胞周期紊亂，DNA 損傷積累，最終引起細(xì)胞癌變。

將世界范圍不同種族，不同人群中分離的HPV16區(qū)分為5 種主要的種系發(fā)生群［3］。有研究表明［4］，HPV16E6 基因及其編碼蛋白的變異與宮頸癌發(fā)生有關(guān)，不同地區(qū)宮頸癌組織中E6 變異株的分布不一致。前期研究指出，新疆維吾爾族婦女宮頸癌組織中HPV16E6 基因存在突變［5］，本研究在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測(cè)新疆漢族、維吾爾族宮頸癌及宮頸病變細(xì)胞中HPV16E6 變異株的分布，探討隨病變的加重HPV16E6 變異的變化規(guī)律及其在兩個(gè)民族間的差異。

1 材料與方法

1.1 病例收集

收集從2011年9月至2012年3月在新疆自治區(qū)人民醫(yī)院住院或門診就診的漢族、維吾爾族婦女宮頸癌及宮頸病變標(biāo)本244 例進(jìn)行凱普基因芯片檢測(cè)，篩選出HPVl6 陽性病例140 例(漢族65例，維吾爾族75 例)為研究對(duì)象?；颊吣挲g22 ～78 歲，中位年齡45 歲。所有標(biāo)本收集均經(jīng)患者本人知情同意。

1.2 主要試劑和引物的設(shè)計(jì)和合成

TaqDNA 聚合酶、dNTP 和DNA marker DL2000(上海生工生物工程技術(shù)有限公司)根據(jù)HPV16DNA全長(zhǎng)序列，利用primer express 軟件PE 公司設(shè)計(jì)跨HPV16E6 整個(gè)閱讀框的一對(duì)HPV16E6 P1:5'-CGT AACCGAAATCGGTTGAAC-3'，P2:5'-GCTCATAACA GTAGAGATC-3'引物，上述引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 HPV16E6 基因PCR 擴(kuò)增和序列測(cè)定及分析

通過凱普基因芯片技術(shù)進(jìn)行HPV 基因分型，篩選HPV16 陽性標(biāo)本，用HPV16 陽性細(xì)胞DNA 為模板，擴(kuò)增HPV16E6 基因，PCR 反應(yīng)條件如下:95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃30 s，51 ℃30 s，72 ℃60 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃7 min。

1.4 HPV16 E6 基因測(cè)序及分析

PCR 產(chǎn)物純化后，利用HPV16 E6 P1/P2 引物，正反向?qū)CR 產(chǎn)物直接測(cè)序。純化和測(cè)序服務(wù)由英濰捷基生物工程有限公司提供。測(cè)序結(jié)果用DNAMAN(6 .0.3.48)軟件進(jìn)行比對(duì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，基因突變率比較均采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.2 HPV16 陽性標(biāo)本中HPV16 E6 基因擴(kuò)增結(jié)果

以HPV16 陽性細(xì)胞 DNA 為模板，利用跨HPV16E6 整個(gè)閱讀框引物擴(kuò)增E6 基因，陽性結(jié)果在550 bp處呈現(xiàn)一亮帶。140 例HPV16 陽性標(biāo)本中有129 例擴(kuò)增出E6 基因11 例未擴(kuò)增出(圖1)。

2.2 HPV16E6 基因測(cè)序結(jié)果及分析

HPV16E6 基因PCR 產(chǎn)物經(jīng)過純化后直接進(jìn)行雙向測(cè)序，得到清晰的測(cè)序結(jié)果123 份(漢族57 份、維吾爾族66 份)，另外6 個(gè)樣品信號(hào)較差，未進(jìn)行突變分析。將所測(cè)序列與HPV16 標(biāo)準(zhǔn)株E6 基因序列進(jìn)行比較，漢族、維吾爾族宮頸癌及宮頸病變標(biāo)本HPV16E6 突變率分別為:47.37%(27/57)和50%(33/66)，兩個(gè)民族標(biāo)本中共發(fā)現(xiàn)8 個(gè)基因突變位點(diǎn):178:T→G(25:D→E)、256:T→C(同義突變)、295:T→G(64:D→E)、320:A→G(73:I→V)、335:C→T(78:H→Y)、350:T→G (83:L→V)、430:A→G(同義突變)、442:A→C(113:E→D)(數(shù)字代表堿基在HPV16 全基因序列中的位置)，E6 變異株在新疆漢族、維吾爾族中的分布以亞洲株和歐洲株為主(表1，圖2)。

圖1 HPV16E6 PCR 電泳結(jié)果圖Fig 1 PCR amplification of HPV16E6 gene

2.3 HPV16E6 突變?cè)跐h族、維吾爾族各級(jí)別宮頸病變之間的分布

發(fā)生變異的27 例漢族宮頸癌及宮頸病變標(biāo)本中主要突變位點(diǎn)分別為178:T→G(25:D→E)、320:A→G(73:I→V)、335:C→T(78:H→Y)、350:T→G(83:L→V)、442:A→C(113:E→D)，在33 例維吾爾族宮頸癌及宮頸病變標(biāo)本中，主要突變位點(diǎn)分別為350:T→G(83:L→V)、295:T→G(64:D→E)、178:T→G(25:D→E)、320:A→G (73:I→V)、335:C→T(78:H→Y)、442:A→C(113:E→D)，其中L83V 變異株在漢族、維吾爾族突變中占的比例均最高，漢族L83V 突變頻率為29.82%(17/57)顯著低于維吾爾族的40.90%(27/66)(P＜0.05)，而漢族D25E 突變頻率為19.30%(11/57)顯著高于維吾爾族的7.58%(5/66)(P＜0.05)。D64E 變異株在維吾爾族中突變頻率為6.1%(4/66)，而漢族標(biāo)本中未檢出。E6 基因突變率隨宮頸病變的加重均具有增加趨勢(shì)，在漢族各級(jí)別宮頸病變之間無差異，在維吾爾族各級(jí)別宮頸病變之間也無差異(表2)。

3 討論

宮頸癌是嚴(yán)重威脅婦女生命健康的疾病之一，在維吾爾族人群中發(fā)病率和死亡率均較高并有年輕化趨勢(shì)。高危型HPV 持續(xù)性感染與宮頸癌發(fā)病密切相關(guān)，大多數(shù)宮頸癌組織中可檢測(cè)到HPV16 和HPV18，所以HPV16 和HPV18 感染被認(rèn)為是宮頸癌的主要病因［6］。大多數(shù)研究顯示，某些特定的HPV16 變異株的感染增加宮頸病變的風(fēng)險(xiǎn)，或其感染與宮頸病變程度有關(guān)，相同的變異株在不同地區(qū)、不同種族的致癌危險(xiǎn)性也存在明顯的差異［4］。

表1 HPV16E6 堿基及氨基酸變異Table 1 HPV16E6 nucleotide and amino acid mutation of HPV16E6

圖2 新疆漢族、維吾爾族婦女宮頸癌及宮頸病變標(biāo)本HPV16E6 變異株與參考株E6 蛋白氨基酸序列比較Fig 2 The specimen mutant and reference strains of HPV16E6 amino acid sequence of cervical cancer and cervical lesions in Han，Uygur women

表2 HPV16E6 突變?cè)跐h族、維吾爾族各級(jí)別宮頸病變之間的分布Table 2 HPV16E6 mutation distribution of cervical cancer and cervical lesions in Han，Uygur

HPV 的基因變異、病毒持續(xù)和反復(fù)感染及宿主免疫狀態(tài)等因素與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，其中HPV 病毒持續(xù)和反復(fù)感染可由基因的變異所引起，所以干擾致癌基因E6 的型內(nèi)變異使P53 蛋白的穩(wěn)定性增強(qiáng)，具預(yù)防宮頸癌的作用［7］。HPV16 E6 基因常發(fā)生變異，不同地區(qū)流行的變異株也有差異。歐美地區(qū)流行的HPV16E6 變異株主要是G350(L83V)，而東亞地區(qū)主要是G178(D25E)［8］。研究發(fā)現(xiàn)，中國廣東地區(qū)宮頸癌中HPV16E6 突變株以D25E 為主，還有E113D、H78Y、L83V、F69L［9］。前期研究指出新疆維吾爾族宮頸癌組織中存在HPV16E6 基因突變，突變株以L83V 為主，也有D25E、D64E［5，10］。本研究中，新疆漢族、維吾爾族宮頸癌及宮頸病變標(biāo)本中HPV16E6 變異株均以L83V為主，漢族L83V 突變頻率顯著低于維吾爾族中的突變頻率，還存在D25E、I73V、D64E、H78Y、E113D的變異株，漢族D25E 突變頻率顯著高于維吾爾族，漢族標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)D64E 變異株，同時(shí)本組漢族、維吾爾族婦女宮頸癌及宮頸病變標(biāo)本中還存在非洲亞型H78Y 變異株和亞洲亞型E113D，這在前期文獻(xiàn)中未報(bào)道。在我國新疆地區(qū)除了有亞洲型E6 突變外，還有歐洲型和非洲型突變類型，這可能與新疆漢族、維吾爾族種族特異性有關(guān)。

目前HPV16 基因突變與宮頸癌的相關(guān)性報(bào)道，國外研究結(jié)論不一，國內(nèi)報(bào)道較少。有研究報(bào)道，HPV16 基因350 位T 到G 的突變是宮頸癌的高危因素［11］。本研究結(jié)果顯示，350 nt、178 nt等位點(diǎn)的E6 基因突變率在兩個(gè)民族中隨宮頸病變的加重均具有增加趨勢(shì)，但無顯著性差異。此結(jié)果與一些研究結(jié)果不一致［12］。

本研究結(jié)果提示，在新疆漢族、維吾爾族婦女宮頸癌及宮頸病變標(biāo)本中均存在較多的HPV16E6變異株，各變異株在兩個(gè)民族病樣中的分布有差異，維吾爾族標(biāo)本中L83V 變異株比漢族多并隨病變的加重具增加趨勢(shì)，漢族標(biāo)本中檢出的D25E 變異株多于維吾爾族，漢族標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)D64E 變異株，可能是維吾爾族特異變異株，此結(jié)果將為我國不同民族宮頸癌及宮頸病變患者組織中HPV16E6基因變異特點(diǎn)積累流行病學(xué)資料，對(duì)闡明該區(qū)宮頸癌高發(fā)原因有一定的意義。

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