白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α對(duì)人正常髓核細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-28轉(zhuǎn)錄影響的研究

2014-03-15 02:22:30張偉軍丁亞軍蔣允昌章浩杰

脊柱外科雜志 2014年4期

張偉軍，馮虎，丁亞軍，鄧斌，蔣允昌，章浩杰，夏震

下腰痛是一種很常見的疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)超過一半的人，在一生中的某個(gè)階段都會(huì)出現(xiàn)下腰痛[1]，研究顯示基質(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases,MMPs)與椎間盤退變之間關(guān)系密切，是導(dǎo)致椎間盤退變的主要原因之一，MMPs是參與降解包括骨在內(nèi)的全身各種組織細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶家族，包括基質(zhì)中以及整合于質(zhì)膜中的各種膠原酶和彈性蛋白酶等，因其需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名[2]，基質(zhì)金屬蛋白酶-28(matrix metalloproteinase-28,MMP-28)是MMPs的最新成員，最新研究發(fā)現(xiàn)其與髓核細(xì)胞退變密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)通過炎性介質(zhì)白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)刺激體外培養(yǎng)人體髓核細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(real time-polymerase chain reaction,RT-PCR)技術(shù)檢測髓核細(xì)胞MMP-28 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，探討MMP-28的調(diào)控因素及炎性介質(zhì)和MMP-28與髓核細(xì)胞退變之間的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 主要資料和試劑

人體髓核原代細(xì)胞株(美國Sciencell公司)，重組人IL-1β(美國Perprotech公司)，重組人TNF-α(美國Perprotech公司)，DNA Marker 1(北京天根公司)，Trizol法總RNA提取試劑盒(北京天根公司)，cDNA第一鏈合成試劑盒(北京天根公司)，PCR試劑盒(北京天根公司)，焦碳酸二乙酯 (diethy pyrocarbonate,DEPC，上海浩然公司)，溴化乙錠(ethidium bromide,ED)染料(北京天根公司)，瓊脂糖(Agarose，LMP，美國Promega公司)異丙醇(上?；瘜W(xué)試劑公司)，氯仿(上?；瘜W(xué)試劑公司)，無水乙醇(上?；瘜W(xué)試劑總廠)，TBE電泳緩沖液(上?；瘜W(xué)試劑公司)，胰蛋白酶(南通碧云天公司)引物(上海捷瑞生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞因子模型

髓核細(xì)胞培養(yǎng)至第2代，當(dāng)達(dá)90%融合時(shí)，常規(guī)消化、離心、制成細(xì)胞懸液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后接種于六孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔內(nèi)約有2.5×105個(gè)細(xì)胞。空白對(duì)照組：不加任何致炎因子，只加培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組：配制不同濃度的致炎因子加入培養(yǎng)孔內(nèi)作為實(shí)驗(yàn)組，即10 ng/mL IL-1β組、50 ng/mL IL-1β組、50 ng/mL TNF-α組、100 ng/mL TNF-α組。每個(gè)濃度組設(shè)立三復(fù)孔。每隔24 h更換空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞因子濃度保持不變。常規(guī)培養(yǎng)72 h。

1.2.2 髓核細(xì)胞RNA提取

吸去培養(yǎng)孔的上清，加入1 mL Trizol裂解液，收集至離心管，加入氯仿?lián)u勻，離心后轉(zhuǎn)移水相至新的離心管，加入異丙醇，離心后棄上清，加入乙醇，振蕩混勻，離心后吸去上清后空氣中干燥5～10 min，加入30 μL DEPC水溶解RNA。計(jì)算RNA樣本的純度，達(dá)1.8后進(jìn)行下一步。

1.2.3 RT-PCR反應(yīng)

MMP-28及內(nèi)參(β-肌動(dòng)蛋白)引物見表1，RT-PCR步驟具體見試劑盒說明。

1.2.4 PCR產(chǎn)物觀察

取PCR產(chǎn)物3 μL加3 μL的DNA電泳上樣緩沖液上樣，同時(shí)取DNA Marker 6 μL上樣，電壓110 V，電流50 mA電泳30～40min，擴(kuò)增得到相應(yīng)的目的產(chǎn)物片段，用凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)掃描分析擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，分別測定各擴(kuò)增帶灰度值，以各自目的基因擴(kuò)增帶灰度值與內(nèi)參擴(kuò)增帶的灰度值比，作為其mRNA水平的指標(biāo)。

表1 MMP-28、β-肌動(dòng)蛋白上下游引物序列Tab.1 MMP-28,β-actin upstream and downstream primer sequences

2 結(jié) 果

不同濃度的IL-β刺激人體髓核細(xì)胞(見表2，圖1)。各組數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)性和方差齊性，采用單因素方差分析，F(xiàn)=1.253，P>0.05，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未發(fā)現(xiàn)IL-1β影響人體正常髓核細(xì)胞MMP-28mRNA轉(zhuǎn)錄。

表2 IL-1β刺激人正常髓核細(xì)胞72 h后MMP-28 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平Tab.2 MMP-28 mRNA transcriptional level in human nucleus pulposus cells after 72 h IL-1β stimulation

不同濃度的TNF-α刺激人體髓核細(xì)胞(見表3，圖2)。各組數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)性和方差齊性，采用單因素方差分析，F(xiàn)=279.510，P<0.05，總體之間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可進(jìn)行組間比較：低濃度與空白對(duì)照組相比，P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；高濃度與低濃度組相比，P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TNF-α對(duì)髓核細(xì)胞MMP-28 mRNA轉(zhuǎn)錄具有刺激作用，且高濃度上調(diào)作用更明顯。

a,b：空白對(duì)照組(0 ng/mL) c,d:低濃度組(10 ng/mL) e,f：高濃度組(50 ng/mL)
a,b：Control group (0 ng/mL) c,d: Low concentration group (10 ng/mL) e,f：High concentration group (50 ng/mL)
圖1 不同濃度的IL-1β刺激髓核細(xì)胞72 h后MMP-28 mRNA轉(zhuǎn)錄水平
Fig.1 MMP-28 mRNA transcriptional level in human nucleus pulposus cells after 72 h different IL-1β stimulation

表3 TNF-α刺激人正常髓核細(xì)胞72 h后MMP-28mRNA的轉(zhuǎn)錄水平Tab.3 MMP-28 mRNA transcriptional level in human nucleus pulposus cells after 72 h TNF-α stimulation

注： *與空白對(duì)照組相比，P<0.05；**與另2組比較，P<0.01
Note: *Compared with control group,P<0.05；**compared with other groups,P<0.01

3 討論

MMP-28是MMPs的最新成員，MMP-28又名上皮水解素(epilysin),最初克隆自人的角質(zhì)形成細(xì)胞、睪丸和混合性腫瘤cDNA文庫[3-4]。重組體MMP-28在體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)可以降解酪蛋白，一種非特異性、很多酶都可以水解的蛋白，然而在體內(nèi)其作用底物仍不詳，Gruber等[5]首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)MMP-28同樣存在于人體椎間盤組織，并認(rèn)為MMP-28與人體椎間盤退變密切相關(guān)。

退變椎間盤組織內(nèi)檢測到大量炎性因子，學(xué)者們就MMPs、炎性因子、椎間盤退變之間做了大量研究，Le Maitre等[6]研究發(fā)現(xiàn)IL-1表達(dá)量增加，可誘發(fā)椎間盤細(xì)胞基質(zhì)降解酶如MMP-1、3、7、13和含凝血酶敏感素4型基序的解聚素樣金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4,ADAMTS-4)表達(dá)量增加，致使基質(zhì)蛋白合成減少，降解增加，導(dǎo)致相應(yīng)細(xì)胞生化特性改變，最終發(fā)生退變。Séguin等[7]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可以下調(diào)蛋白聚糖和Ⅱ型膠原基因表達(dá)，減少蛋白聚糖和膠原的合成，并且還可以增加MMP-1，MMP-3，MMP-13，ADAMTS-4及ADAMTS-5，從而降解椎間盤基質(zhì)，由此可見TNF-α能夠促進(jìn)椎間盤退變。

a,b：空白對(duì)照組(0 ng/mL) c,d:低濃度組(50 ng/mL) e,f：高濃度組(100 ng/mL)
a,b： Control group (0 ng/mL) c,d: Low concentration group (50 ng/mL) e,f：High concentration group (100 ng/mL)
圖2 不同濃度的TNF-α刺激髓核細(xì)胞72h后MMP-28 mRNA轉(zhuǎn)錄水平
Fig.2 MMP-28 mRNA transcriptional level in human nucleus pulposus cells after 72 h different TNF-α stimulation

然而關(guān)于炎性因子調(diào)控MMP-28的報(bào)道甚少，Saarialho-Kere等[8]報(bào)道TNF-α可以在體外誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞MMP-28表達(dá)增加。本研究通過體外培養(yǎng)正常人體髓核細(xì)胞，用不同濃度的IL-1β(0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL)和TNF-α(0 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL)刺激髓核細(xì)胞，72 h后檢測細(xì)胞中MMP-28 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。IL-1β刺激72 h后發(fā)現(xiàn)低濃度組(0.343±0.018)、高濃度組(0.343±0.018)與空白對(duì)照組(0.325±0.019)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，未發(fā)現(xiàn)IL-1β對(duì)MMP-28 mRNA轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用，但是低濃度TNF-α(50ng/mL)刺激后即發(fā)現(xiàn)MMP-28 mRNA轉(zhuǎn)錄水平(0.515±0.029)明顯上調(diào)(P<0.01)，隨著TNF-α濃度增加(100 ng/mL)MMP-28 mRNA轉(zhuǎn)錄水平(0.610±0.012)繼續(xù)上調(diào)(P<0.01)。TNF-α對(duì)MMP-28具有調(diào)控作用，且呈濃度依賴性。結(jié)合Séguin等[7]結(jié)果，推測MMP-28可能是TNF-α參與椎間盤退變的介質(zhì)之一。IL-1β不能影響髓核細(xì)胞MMP-28 mRNA轉(zhuǎn)錄，而TNF-α對(duì)MMP-28 mRNA轉(zhuǎn)錄有刺激作用，且呈濃度依賴性，這與Saarialho-Kere等[8]報(bào)道類似。也有研究表明，TNF-α對(duì)髓核細(xì)胞MMP-28的表達(dá)無明顯調(diào)控作用，但其實(shí)驗(yàn)對(duì)象是退變髓核細(xì)胞，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測TNF-α可能只在早期參與調(diào)控正常髓核細(xì)胞MMP-28表達(dá)，當(dāng)髓核細(xì)胞發(fā)生退變后，可能對(duì)TNF-α反應(yīng)降低，從而出現(xiàn)TNF-α不能有效刺激退變髓核細(xì)胞表達(dá)MMP-28的現(xiàn)象。

本研究僅建立單一炎癥因子刺激的體外細(xì)胞培養(yǎng)模型，不能完全代表人體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境，由于多種炎癥因子參與椎間盤退變，且細(xì)胞因子之間是相互影響、相互依賴的，關(guān)于炎癥因子與MMP-28之間的相互作用及如何影響椎間盤退變還需要更深入的研究。

椎間盤不僅是椎體間強(qiáng)有力的連接結(jié)構(gòu)，同時(shí)也是很好的震蕩吸收裝置，施加于脊柱的各種不同載荷，引起椎間盤的相應(yīng)變形，使力得到重新分布及部分吸收，此生物學(xué)功能主要依賴椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)完成，一旦基質(zhì)破壞將導(dǎo)致椎間盤不能有效的、均勻的重新分布及吸收載荷，出現(xiàn)應(yīng)力集中，最終將發(fā)生椎間盤突出。椎間盤突出的治療，不論是非手術(shù)還是手術(shù)，都各有利弊，采用分子生物學(xué)途徑抑制椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)降解，阻止椎間盤退變才是最有效的治療，本實(shí)驗(yàn)試圖探討MMP-28與椎間盤的退變的關(guān)系，為椎間盤退變的靶向治療提供思考。

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