氫氣能減少人肺上皮細胞系缺氧/復氧損傷后炎性因子釋放

劉軍肖，韓晨燕，付國俊

(1.河北省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北石家莊050051;2.河北省直機關第一門診部保健科，河北石家莊050051;3.滄州市人民醫(yī)院皮膚科，河北滄州061000)

肺部良好的血液循環(huán)是組織細胞攝取氧及保證細胞生存的基本條件，肺部缺血、缺氧誘發(fā)過度的炎性反應，是肺損傷重要病理過程［1］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)氫氣具有抗炎作用，減輕缺血再灌注損傷等炎性因子過量釋放［2］。本實驗擬探討氫氣對肺細胞缺氧復氧損傷后炎性反應的影響，進一步證明氫氣對肺細胞缺氧復氧后炎性因子的作用。

1 材料與方法

1.1 材料:BEAS-2B 人正常肺上皮細胞(中國科學院細胞庫)。缺氧培養(yǎng)箱為長沙華曦電子科技有限公司生產(chǎn)的YCP-50S 三氣培養(yǎng)箱，使用99.9 % N2。ELISA 試劑盒(R＆D公司)。肺細胞系A549(ATCC 公司)。DMEM(Invitrogen 公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組:細胞應用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)。當細胞匯合后，消化、傳代，細胞傳代3 次后，用于實驗。富氫液的制備:將含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基置于高純氫氣環(huán)境中，0.4 MPa 壓力下加壓暴露4 h，至氫氣溶解于培養(yǎng)基達到飽和狀態(tài)，放于4 ℃貯存?zhèn)溆?。實驗開始后，將H/R 和H/R+H2組細胞于缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min，后于正常培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30 min。分為4 組:Con:對照組;Con +H2:對照+氫氣組;H/R:缺氧/復氧損傷組;H/R+H2:缺氧/復氧損傷+氫氣組。實驗結束后，收集細胞及培養(yǎng)液備用。

1.3 檢測指標:MTT 法檢測細胞活力:將細胞接種于96 孔板，應用MTT 和DMSO，在酶聯(lián)免疫檢測490 nm 處吸光度值。炎性因子濃度的測定:采用ELISA 法，檢測TNF-α、IL-1β 和HMGB1 濃度，嚴格按照說明書要求進行。用Western blot 法測定NF-κB 的表達:收集細胞蛋白，進行凝膠電泳、轉膜、封閉后，用NF-κB 單克隆抗體及二抗進行孵育。然后顯色、曝光，以獲得蛋白表達量。

1.4 統(tǒng)計學分析:所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS18.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，測定結果以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較。

2 結果

與Con 和Con+H2組相比，H/R 組缺氧/復氧后MTT 檢測細胞活力值降低(P＜0.05)，早期炎性因子TNF-α、IL-1β和NF-κB 蛋白表達明顯增加(P＜0.05)，晚期炎性因子HMGB1 無明顯變化;與H/R 組缺氧/復氧損傷后相比，給予氫氣處理的H/R +H2組MTT 值明顯增加(P＜0.05)，早期炎性因子TNF-α、IL-1β 和NF-κB 蛋白表達明顯減少(P＜0.05)，晚期炎性因子HMGB1 無明顯變化(圖1，2，3)。

圖1 氫氣對肺細胞缺氧/復氧后細胞活力的影響Fig 1 The effect of hydrogen on cell-activity after H/R of cell

3 討論

肺損傷導致的缺血對機體影響主要是由于缺血導致組織氧攝入不足，使細胞內(nèi)大量有害物質聚集，如炎性因子、趨化因子等，引起細胞生長受限，甚至死亡，對機體造成不可逆轉損傷。從本實驗結果顯示，給予肺細胞缺氧處理后，細胞生長受到明顯抑制，說明肺細胞攝入氧不足，導致大量有害代謝產(chǎn)物堆積，致使細胞不能正常增殖、生長。

圖2 氫氣對肺細胞缺氧/復氧后NF-κB 表達的影響Fig 2 The effect of hydrogen on the NF-κB expression after H/R of cell

圖3 氫氣對肺細胞缺氧/復氧后早、晚期炎性因子表達的影響Fig 3 The effect of hydrogen on the expression of early and late inflammatory factors after H/R of cell

氫氣具有抗炎作用，可以減輕多種疾病的炎性因子過量釋放?？梢悦黠@減輕肺移植后的炎性因子釋放，對移植肺具有明顯保護作用［3］。

TNF-α 和IL-1β 作為早期炎性介質，可迅速誘發(fā)細胞損傷、死亡，進而引起機體損害。HMGB1 具有晚期炎性介質作用，可以誘發(fā)有害物質釋放，而過量的早期炎性因子可誘發(fā)HMGB1 大量釋放。NF-κB 是調節(jié)炎性介質和細胞因子釋放的核轉錄因子。本實驗結果提示，缺氧可誘發(fā)肺細胞釋放大量的早期炎性因子TNF-α 和IL-1β，可增強NF-κB 表達，對晚期炎性介質無明顯影響。氫分子處理后，炎性因子釋放減少，NF-κB 表達減少。

綜上所述，氫氣可以減輕缺氧誘發(fā)的肺細胞炎性反應，可以減輕早期炎性介質的釋放，機制可能與調節(jié)轉錄因子NF-κB 的表達有關。

［1］De Perrot M，Liu M，Waddell TK，et al．Ischemia-reperfusion-induced lung injury［J］．Am J Respir Crit Care Med，2003，167:490-511．

［2］Xie KL，Yu YH，Zhang ZS，et al．Hydrogen gas iproves survival rate and organ damage in zymosan-induced generalized inflammation model［J］．Shock，2010，34:495-501．

［3］Mao YF，Zheng XF，Cai JM，et al．Hydrogen-rich saline reduces lung injury induced by intestinal ischemia/reperfusion in rats［J］．Biochem Biophy Res Commun，2009，381:602-605．