FISH檢測(cè)宮頸上皮內(nèi)瘤變及其旁組織中hTERC基因表達(dá)的變化及意義*

曹志星呂威趙曄莫海波謝亞峰吳曉媚李玉梅周賓范思格陳細(xì)妹

FISH檢測(cè)宮頸上皮內(nèi)瘤變及其旁組織中hTERC基因表達(dá)的變化及意義*

曹志星①呂威①趙曄①莫海波①謝亞峰①吳曉媚①李玉梅①周賓①范思格①陳細(xì)妹①

目的：檢測(cè)宮頸活檢組織中上皮內(nèi)瘤變（CIN）及其旁組織中hTERC基因的表達(dá)情況，對(duì)比分析其陽(yáng)性率的變化，試圖找到基因水平上CIN手術(shù)治療范圍。方法：采用熒光原位雜交技術(shù)（FISH）檢測(cè)63例宮頸活檢標(biāo)本中hTERC基因的表達(dá)變化情況。結(jié)果：宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（HSIL）區(qū)、瘤變邊緣≤1 mm、1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm、2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm以及3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm的hTERC基因陽(yáng)性率分別為100%、92.31%、87.18%、64.10%和30.77%，其中，HSIL與瘤變邊緣2 mm以內(nèi)范圍各點(diǎn)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；HSIL與瘤變邊緣2 mm以外范圍各點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；宮頸低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（LSIL）區(qū)、瘤變邊緣≤1 mm范圍、1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm、2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm以及3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm的hTERC基因陽(yáng)性率分別為41.67%、25.00%、4.17%、4.17%和4.17%，其中，LSIL與瘤變邊緣1 mm以內(nèi)范圍各點(diǎn)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而LSIL與瘤變邊緣1 mm以外范圍點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：活檢標(biāo)本中，隨著距瘤變區(qū)范圍的增加，hTERC基因的陽(yáng)性率明顯下降，其中，距瘤變邊緣＞2 mm和＞1 mm或許可以分別作為HSIL和LSIL基因水平上（更精確意義上的）CIN的手術(shù)治療范圍。

熒光原位雜交； 宮頸上皮內(nèi)瘤變； hTERC基因； 宮頸活檢組織； 手術(shù)治療范圍

在世界范圍內(nèi)，女性宮頸癌發(fā)病率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第2位[1]。近年來，其發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)，但因?qū)m頸癌有較長(zhǎng)的癌前病變期，早期診斷及合理治療便成為改善預(yù)后的關(guān)鍵[2]。目前研究得知，宮頸細(xì)胞由非典型性異常病變細(xì)胞轉(zhuǎn)化成癌細(xì)胞的過程中幾乎都伴有3號(hào)染色體長(zhǎng)臂的擴(kuò)增，其中涉及到的最重要的基因可能是人染色體末端酶基因（human telomerase gene，hTERC），它有望成為非典型細(xì)胞癌變的基因[3]。Heselmeyer-haddad等[4]研究認(rèn)為hTERC基因可以作為預(yù)測(cè)高度病變（HSIL）的指標(biāo)，隨訪這些病例1～3年后，hTERC基因擴(kuò)增病例中CINⅠ/Ⅱ進(jìn)展到CINⅢ多于hTERC基因不擴(kuò)增病例，表明特異的基因組改變是CIN發(fā)展到宮頸癌所必需的[5]。同時(shí)，多項(xiàng)研究表明，采用FISH技術(shù)檢測(cè)宮頸細(xì)胞hTERC基因的陽(yáng)性率，可作為宮頸上皮內(nèi)瘤變由低級(jí)別進(jìn)展到高級(jí)別的指標(biāo)，還可以提高宮頸癌前病變的篩查幾率，是一種損傷較小的、比較可靠的檢測(cè)手段[6-10]。有研究報(bào)道不同制片方法中，hTERC基因雜交成功率石蠟包埋組織切片為85.7%，其熒光信號(hào)滿意率也最高，且在指導(dǎo)宮頸病變及宮頸癌的治療中，石蠟包埋組織切片法的染色體破壞最小，實(shí)際意義更大。因而，不同于以往的使用脫落細(xì)胞進(jìn)行的研究，本實(shí)驗(yàn)全部采用組織活檢標(biāo)本。同時(shí)，除檢測(cè)CIN處的hTERC基因陽(yáng)性率外，還對(duì)病變旁組織做不同范圍的hTERC基因表達(dá)研究，試圖找到規(guī)律性變化，探討基因水平上CIN的手術(shù)治療范圍。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2013年10月-2014年7月本院宮頸組織活檢標(biāo)本63例，每例均完整包含連續(xù)的瘤變組織及其旁組織（距瘤變邊緣≥4 mm）。其中，低級(jí)別病變24例，高級(jí)別病變39例，年齡22～62歲，取標(biāo)本前所有患者均未進(jìn)行放療、化療及其他特殊治療。另外選取20例正常宮頸組織活檢標(biāo)本建立閾值。

1.2 FISH探針 北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的TERC/CSP3 DNA雙色探針。TERC基因標(biāo)記在3q26.3位點(diǎn)，CSP3 DNA標(biāo)記在3號(hào)染色體著絲粒處（3q11.1-q11.1），分別用紅色和綠色熒光信號(hào)標(biāo)記，以CSP3探針作為對(duì)照。

1.3 方法

1.3.1 樣本制備 將普通載玻片清洗干凈后，涂多聚賴氨酸以防脫片，自然晾干備用。將預(yù)先篩選出的石蠟包埋組織做2 μm連續(xù)切片，展開后撈片，置70 ℃烤箱中2 h。

1.3.2 樣本預(yù)處理 將玻片置于二甲苯中脫蠟，兩缸，各10 min，依次經(jīng)100%乙醇、85%乙醇、75%乙醇至去離子水，各1缸，各2 min，然后置于火力60的微波爐內(nèi)水煮20 min，在2×SSC溶液中浸泡5 min后晾干，加胃蛋白酶20 μL（20 mg/mL），消化5 min左右，室溫下2×SSC溶液中漂洗2次，5 min/次。最后將玻片依次置于75%乙醇、85%乙醇、100%乙醇各2 min脫水，烤片至56 ℃，干燥備用。

1.3.3 雜交 避光環(huán)境中，將探針混合液10 μL（2 μL探針，8 μL雜交緩沖液）滴于玻片雜交區(qū)域，加上蓋玻片，封膠；83 ℃水浴中變性5 min，將玻片置于預(yù)熱的濕盒中，42 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜雜交。

1.3.4 洗片 第2天在暗處移去蓋玻片，依次經(jīng)46 ℃預(yù)熱的2×SSC溶液和NP40溶液（40 mL 2×SSC溶液，40μL NP40洗滌液）洗滌，各1缸，分別為10 min和5 min，70%乙醇浸泡3 min，自然干燥，滴加15 μL DAPI（聯(lián)咪二苯吲哚）復(fù)染劑，加蓋玻片，分析。

1.4 FISH信號(hào)分析 復(fù)染后的玻片用OLYMPUS B×51熒光顯微鏡在DAPI/FIFC/RHOD三色濾光鏡激發(fā)下，觀察間期細(xì)胞的熒光雜交信號(hào)。

1.5 閾值建立 20例正常宮頸組織活檢標(biāo)本，在100×10油鏡下觀察，每例隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。單個(gè)間期細(xì)胞核中紅綠信號(hào)比2：2為正常細(xì)胞；紅色信號(hào)＞2個(gè)，綠色信號(hào)≥2個(gè)判斷為陽(yáng)性細(xì)胞。計(jì)算每例出現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，建立閾值，閾值=平均數(shù)（x）+3×標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。本例閾值為8.66%，取整數(shù)9。

1.6 結(jié)果判定 100×10倍油鏡下觀察，每例隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)間期細(xì)胞，單個(gè)間期細(xì)胞核中紅綠信號(hào)比2∶2為正常細(xì)胞；紅色信號(hào)＞2個(gè)，綠色信號(hào)≥2個(gè)判斷為陽(yáng)性細(xì)胞。記錄紅綠信號(hào)數(shù)hTERC：CSP3，陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)≥閾值（本實(shí)驗(yàn)為9個(gè)）為hTERC基因擴(kuò)增陽(yáng)性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料比較采用 χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸活檢正常組織中hTERC基因的擴(kuò)增情況 宮頸活檢正常組織中hTERC基因偶爾可見擴(kuò)增情況，大部分hTERC：CSP3呈2：2狀態(tài)，見圖1。

圖1 正常組織中hTERC基因的擴(kuò)增情況

2.2 宮頸活檢高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（HSIL）區(qū)及其旁組織中hTERC基因的擴(kuò)增情況 宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（HSIL）區(qū)、瘤變邊緣≤1 mm、1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm、2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm以及3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm的hTERC基因陽(yáng)性率分別為100%、92.31%、87.18%、64.10%和30.77%，其中，HSIL與瘤變邊緣≤1 mm、1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.10，P＞0.05；χ2=3.20，P＞0.05）；HSIL與2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm、HSIL與3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm、1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm范圍與2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm、2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm與3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm范圍的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（χ2=17.06，P＜0.05； χ2=41.29，P＜0.05； χ2=5.64，P＜0.05； χ2=8.69，P＜0.05），見表1及圖2～11。

表1 宮頸活檢高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（HSIL）區(qū)及其旁組織中hTERC基因的陽(yáng)性率比較

圖2 宮頸活檢HSIL區(qū)hTERC基因的擴(kuò)增情況（FISH 100×10倍油鏡）

圖3 宮頸活檢HSIL區(qū)與其旁組織交界hTERC基因的擴(kuò)增情況（HE 40×10）

圖4 宮頸活檢HSIL瘤變邊緣≤1 mm hTERC基因的擴(kuò)增情況（FISH 100×10倍油鏡）

圖5 宮頸活檢HSIL瘤變邊緣≤1 mm hTERC基因的擴(kuò)增情況（HE 40×10）

圖6 宮頸活檢HSIL區(qū)1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm hTERC基因的擴(kuò)增情況（FISH 100×10倍油鏡）

圖7 宮頸活檢HSIL區(qū)1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm hTERC基因的擴(kuò)增情況（HE 40×10）

2.3 宮頸活檢低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（LSIL）區(qū)及其旁組織中hTERC基因的擴(kuò)增情況 宮頸低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（LSIL）區(qū)、瘤變邊緣≤1 mm、1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm、2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm以及3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm范圍的hTERC基因陽(yáng)性率分別為41.67%、25.00%、4.17%、4.17%和 4.17%， 其 中，LSIL與瘤變邊緣≤1 mm、1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm與2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm、2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm 與3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.50，P＞0.05； χ2=0，P＞0.05； χ2=0，P＞0.05）， 而LSIL與1 mm＜瘤變邊緣≤2mm、LSIL與2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm、LSIL與3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm、瘤變邊緣≤1 mm與1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.55，P＜0.05； χ2=9.55，P＜0.05；χ2=9.55，P＜0.05； χ2=4.18，P＜0.05），見表2及圖12～21。

圖8 宮頸活檢HSIL區(qū)2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm hTERC基因的擴(kuò)增情況（FISH 100×10倍油鏡）

圖9 宮頸活檢HSIL區(qū)2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm hTERC基因的擴(kuò)增情況（HE 40×10）

圖10 宮頸活檢HSIL區(qū)3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm hTERC基因的擴(kuò)增情況（FISH 100×10倍油鏡）

圖11 宮頸活檢HSIL區(qū)3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm hTERC基因的擴(kuò)增情況（HE 40×10）

表2 宮頸活檢低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（LSIL）區(qū)及其旁組織中hTERC基因的陽(yáng)性率的比較

圖12 宮頸活檢LSIL區(qū)hTERC基因的表達(dá)情況（FISH 100×10倍油鏡）

圖13 宮頸活檢LSIL區(qū)與其旁組織交界hTERC基因的表達(dá)情況（HE 40×10）

圖14 宮頸活檢LSIL區(qū)瘤變邊緣≤1 mm hTERC基因的表達(dá)情況（FISH 100×10倍油鏡）

3 討論

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素參與的、漫長(zhǎng)而又復(fù)雜的過程，歷經(jīng)鱗狀上皮不典型增生、宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）等癌前病變過程。因此，對(duì)CIN進(jìn)行有效的早期篩查、診治，是非常有必要的[12]。

目前宮頸癌的早期篩查主要依靠TCT和HPV檢測(cè)，但兩者的臨床應(yīng)用有一定局限性。細(xì)胞學(xué)檢查（TCT）是一種形態(tài)學(xué)檢查，受觀察者主觀因素的影響，有時(shí)難以做出正確診斷[13]；而針對(duì)HPV DNA的實(shí)驗(yàn)也只能測(cè)出當(dāng)時(shí)HPV的狀態(tài)，大多數(shù)婦女特別是性生活活躍的年輕女性，HPV感染是暫時(shí)的，且HPV陽(yáng)性不能反映細(xì)胞變異的狀態(tài)，使HPV陽(yáng)性的預(yù)測(cè)意義較低，事實(shí)上ASCUS和輕度細(xì)胞學(xué)異常在年輕女性中很常見，但低度病變發(fā)展到宮頸癌的比率并不高。因此需要尋找其他檢測(cè)指標(biāo)以彌補(bǔ)這些檢測(cè)方法的不足。

圖15 宮頸活檢LSIL區(qū)瘤變邊緣≤1 mm hTERC基因的表達(dá)情況（HE 40×10）

圖16 宮頸活檢LSIL區(qū)1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm hTERC基因的表達(dá)情況（FISH 100×10倍油鏡）

圖17 宮頸活檢LSIL區(qū)1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm hTERC基因的表達(dá)情況（HE 40×10）

圖18 宮頸活檢LSIL區(qū)2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm hTERC基因的表達(dá)情況（FISH 100×10倍油鏡）

圖19 宮頸活檢LSIL區(qū)2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm hTERC基因的表達(dá)情況（HE 40×10）

圖20 宮頸活檢LSIL區(qū)3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm hTERC基因的表達(dá)情況（FISH 100×10倍油鏡）

圖21 宮頸活檢LSIL區(qū)3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm hTERC基因的表達(dá)情況（HE 40×10）

近幾年，大量針對(duì)宮頸癌的研究表明，宮頸細(xì)胞癌變的過程中幾乎都伴有3號(hào)染色體3q26～3q27區(qū)域的擴(kuò)增，而hTERC基因定位于該區(qū)域，提示，hTERC基因是與宮頸癌相關(guān)的一個(gè)重要基因[14]。熒光原位雜交（FISH）技術(shù)是一項(xiàng)分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，采用標(biāo)記單鏈核苷酸為探針，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，與待測(cè)未知單鏈核苷酸雜交，形成熒光顯微鏡下可見的熒光信號(hào)，近年來應(yīng)用日益廣泛[15-16]。FISH技術(shù)敏感性高、特異性好、定位準(zhǔn)確、結(jié)果直接清晰，是一項(xiàng)客觀有效的指標(biāo)，已被用于膀胱癌、乳腺浸潤(rùn)癌等的基因檢測(cè)中。利用FISH技術(shù)來檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞和石蠟包埋組織細(xì)胞中hTERC基因的擴(kuò)增也已被證實(shí)可行，且其陽(yáng)性率隨宮頸病變分級(jí)的上升而逐漸增高[17-21]。

本研究應(yīng)用FISH技術(shù)檢測(cè)宮頸活檢組織細(xì)胞中hTERC基因的表達(dá)情況，不僅檢測(cè)病變部位組織的hTERC基因表達(dá)情況，而且利用測(cè)微尺，連續(xù)觀測(cè)及檢測(cè)距病變部位不同距離的組織中hTERC基因表達(dá)情況，以期證實(shí)：（1）隨著距瘤變部位的距離增加，hTERC基因的擴(kuò)增是突然降低還是逐漸降低；（2）如果是隨著距瘤變區(qū)距離的增加，hTERC基因擴(kuò)增逐漸減少，那么距瘤變區(qū)多少的距離處，hTERC基因表達(dá)降至與正常鱗狀上皮一致。

本研究中，應(yīng)用FISH技術(shù)檢測(cè)宮頸活檢組織細(xì)胞中hTERC基因的表達(dá)情況，利用測(cè)微尺連續(xù)觀察宮頸活檢高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（HSIL）區(qū)及其旁組織中hTERC基因的擴(kuò)增情況，發(fā)現(xiàn)：（1）隨著距瘤變部位距離的增加，hTERC基因的擴(kuò)增表達(dá)是逐漸下降的，即病變處hTERC基因的擴(kuò)增100%表達(dá)，距病變區(qū)越遠(yuǎn)該基因的擴(kuò)增率越小并逐漸達(dá)到正常，說明hTERC基因的擴(kuò)增率與距瘤變部位的距離有相關(guān)性；（2）HSIL在距瘤變邊緣約2 mm處以外hTERC基因的表達(dá)下降至接近正常鱗狀上皮水平，其各范圍陽(yáng)性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明2 mm以內(nèi)雖然HE染色鏡下觀察細(xì)胞已無明顯異型性，但是2 mm及以外是基因水平上較正常上皮，是否可以在HSIL術(shù)中將距病變2 mm作為安全的手術(shù)范圍仍是值得探討的問題；（3）對(duì)LSIL區(qū)及其旁組織中hTERC基因擴(kuò)增情況的觀察表明，病變旁1 mm處兩側(cè)的組織中hTERC基因表達(dá)率有差異，即距病變部位邊緣約1 mm處該基因的表達(dá)率可能降至正常鱗狀上皮表達(dá)水平，其各范圍陽(yáng)性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。雖然對(duì)LSIL患者不主張手術(shù)治療，但在臨床上常遇到患者h(yuǎn)TERC基因檢測(cè)表達(dá)率升高，患者因過分緊張、擔(dān)心而要求手術(shù)者，在這種情況下，將距病變1 mm作為安全的手術(shù)范圍也是值得探討的。

本實(shí)驗(yàn)希望能為今后CIN手術(shù)在保證治療安全的前提下最大可能減少創(chuàng)傷，起到拋磚引玉的作用，為宮頸癌前病變的篩查、早期診斷及治療提供新的途徑。

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Expression Change and Significance of hTERC Gene by FISH Detection in CervicaI IntraepitheIiaI NeopIasia and Its Adjacent Tissues

/CAO Zhi-xing，LYU Wei，ZHAO Ye，et aI.//MedicaI Innovation of China，2014，11（23）：001-006

Objective：To detect the expression of the human telomerase （hTERC） gene of cervical intraepithelial neoplasia （CIN） and its adjacent tissues in cervical biopsy samples， to contrast and analyze the change of positive rate， to try to find the scope of surgical treatment on the CIN gene level.Method：The expression of hTERC gene was detected by FISH from 63 cases cervical biopsy specimen.ResuIt：Positive rate of expression of hTERC gene in high-grade squamous intraepithelial lesion （HSIL）， the range from the edge of neoplasia to ≤1 mm， 1 mm＜edge of neoplasia≤2 mm， 2 mm＜dge of neoplasia≤3 mm， 3 mm＜edge of neoplasia≤4 mm were 100%， 92.31%， 87.18%，64.10% and 30.77% respectively. Among them， the difference of HSIL and the range from the edge of neoplasia to ≤2 mm was not statistically significant（P＞0.05）. But the difference of HSIL and the range from the edge of neoplasia to ＞2 mm was statistically significant （ P＜0.05）.Positive rate of expression of hTERC gene in low-grade squamous intraepithelial lesion （LSIL）， the range from the edge of neoplasia to ≤ 1 mm， 1 mm＜edge of neoplasia≤ 2 mm，2 mm＜edge of neoplasia≤ 3 mm， 3 mm＜edge of neoplasia≤ 4 mm were 41.67%， 25.00%， 4.17%， 4.17% and 4.17% respectively. Among them， the difference of LSIL and the range from the edge of neoplasia to ≤1 mm was not statistically significant（ P＞0.05）. But the difference of LSIL and the range from the edge of neoplasia to ＞1 mm was statistically significant （P＜0.05）.ConcIusion：With the increase of range from the area of neoplasia， the positive rate of hTERC gene decreases obviously. The range from HSIL edge＞2 mm and LSIL edge＞1 mm may be the scope of surgical treatment on the CIN gene level， respectively（a more precise sense）.

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.23.001

2014-07-16） （本文編輯：蔡元元）

珠海市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011B040102003）

①?gòu)V東省珠海市第二人民醫(yī)院 廣東 珠海 519020

曹志星

【Key words】Fluorescence in situ hybridization； Cervical intraepithelial neoplasia； HTERC gene； Cervical biopsy samples； The scope of surgical treatment

First-author’s address：The Second PeopIe’s HospitaI of Zhuhai，Zhuhai 519020，China