急性出血壞死性胰腺炎大鼠循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞與胰腺病理損傷的關(guān)系

張保剛，王曉曄，崔華雷

急性出血壞死性胰腺炎大鼠循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞與胰腺病理損傷的關(guān)系

張保剛1，王曉曄2，崔華雷2

目的：探討急性出血壞死性胰腺炎大鼠循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞、血清淀粉酶與胰腺病理損傷的關(guān)系。方法：采用膽胰管逆行注射5%?；悄懰徕c制備急性出血壞死性胰腺炎的大鼠模型，于造模成功后3 h、6 h、12 h處死并取血，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)查淀粉酶活性，取胰腺病理評(píng)分，進(jìn)行血淀粉酶與病理評(píng)分、脫落細(xì)胞與病理評(píng)分之間的相關(guān)性分析。結(jié)果：造模成功后3 h血清淀粉酶為（5431.3±758.5）U/L，病理評(píng)分為3.3±0.8，脫落細(xì)胞計(jì)數(shù)為（35.4± 3.1）%；6 h血清淀粉酶為（6450.5±669.8）U/L，病理評(píng)分為4.7±0.8，脫落細(xì)胞計(jì)數(shù)為（43.3±2.7）%；12 h血清淀粉酶為（7934.2± 667.9）U/L，病理評(píng)分，6.3±0.9，脫落細(xì)胞計(jì)數(shù)為（54.8±3.8）%。血清淀粉酶與病理損傷評(píng)分之間的相關(guān)系數(shù)r=0.351，P＜0.01，關(guān)系式為Y=292.7X+5098，循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞與病理損傷評(píng)分的相關(guān)系數(shù)r=0.842，P＜0.01，關(guān)系方程為Y=21.227+4.837X。結(jié)論：血清淀粉酶及血循環(huán)內(nèi)脫落內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量與急性出血壞死性胰腺炎時(shí)機(jī)體的損傷程度均呈正相關(guān)，但后者的相關(guān)性更強(qiáng)，更能反映多臟器損傷的程度。

脫落細(xì)胞；淀粉酶水平；病理分型；相關(guān)性

近年來兒童急性重癥胰腺炎發(fā)病率逐年上升，因兒童具有年齡、體重、發(fā)育程度等方面的特殊性，治療方法、用藥劑量與成人有所不同。全身炎癥反應(yīng)綜合征引起血管內(nèi)皮細(xì)胞壞死，并脫落入血循環(huán)，可以通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)[1-2]。脫落的細(xì)胞越多，血管內(nèi)皮受到損傷越重。因此，除血胰淀粉酶外，可通過分析血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落情況間接了解胰腺及受波及器官損害程度。本研究旨在通過復(fù)制大鼠模型，探討血循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞（circulating endothelial cells，CEC），淀粉酶與胰腺病理損傷的關(guān)系，找到臨床化驗(yàn)指標(biāo)與疾病程度之間的量化關(guān)系，推斷個(gè)體化用藥的可能。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠90只，雄性，體質(zhì)量230～250 g，周齡16～18周的SD大鼠，這個(gè)生存期的大鼠正處于成年前期，各器官功能逐漸成熟，與兒童的生理功能相似。用這個(gè)周齡的大鼠能較準(zhǔn)確的復(fù)制兒童出血壞死性胰腺炎的病理過程。大鼠由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供（許可證號(hào)：SCXK（京）2011-0012），大鼠于實(shí)驗(yàn)前在天津市兒童醫(yī)院外科實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，飼養(yǎng)溫度22℃～25℃，相對(duì)濕度40%～60%。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 5%?；悄懰徕c，10%水合氯醛。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備和處理 查隨機(jī)數(shù)字表法將90只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為：假手術(shù)組（SO組）和模型組（SAP組），每組45只，再隨機(jī)分為3 h、6 h、12 h共3個(gè)時(shí)間點(diǎn)組，每時(shí)間點(diǎn)組15只，于各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死相應(yīng)大鼠并收集標(biāo)本。術(shù)前大鼠禁食12 h，自由飲水。SAP組用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠[3]，固定于手術(shù)臺(tái)，安爾碘消毒腹部三遍，行上腹部劍突下正中切口（1～2 cm）、進(jìn)腹，提起十二指腸，辨認(rèn)胰膽管及肝門部膽總管，用動(dòng)脈夾夾閉膽總管近肝門處，于十二指腸降部找到胰膽管開口，用靜脈留置針在對(duì)側(cè)腸壁上選一無血管區(qū)進(jìn)針，找到并進(jìn)入十二指腸大乳頭，緩慢推進(jìn)4～5 mm，確定針頭在胰膽管內(nèi)后，拔出針芯，輕壓十二指腸大乳頭，注入5%?；悄懰徕c（0.1 mL/100 g，0.2 mL/min）[4]，注射完畢后用手壓迫進(jìn)針處3 min。去除動(dòng)脈夾，將腸管復(fù)位，分層關(guān)腹。SO組僅找到十二指腸及胰腺翻動(dòng)幾次后關(guān)腹。實(shí)驗(yàn)大鼠手術(shù)后均禁食禁飲，背部皮下注射生理鹽水補(bǔ)液(40 mL/kg體質(zhì)量)[5]。

1.2.2 血清淀粉酶檢測(cè) 兩組于造模成功后3 h、6 h、12 h各取相應(yīng)組大鼠，用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠至相關(guān)時(shí)間點(diǎn)，經(jīng)大鼠股靜脈取血2～3 mL（3000 r/min，離心8 min），用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清淀粉酶。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù) 經(jīng)股靜脈取血1 mL置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)脫落血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)。流式細(xì)胞儀Cellquest獲取及分析數(shù)據(jù)。根據(jù)前向散射光(FSC)及側(cè)向散射光(SSC)設(shè)門將目的細(xì)胞與血小板及細(xì)胞碎片分開，每例標(biāo)本收集20 000個(gè)細(xì)胞。根據(jù)陰性對(duì)照設(shè)定CD31陽性界限，檢測(cè)目的細(xì)胞群內(nèi)CD31陽性細(xì)胞的百分比。選取有代表性的CD31高表達(dá)及低表達(dá)模式圖。

1.2.4 胰腺病變觀察及組織病理學(xué)觀察評(píng)分 取胰腺組織，10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色。分別用低倍鏡（100倍）和高倍鏡（200倍）觀察，每個(gè)器官取2張切片，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野。胰腺病理學(xué)評(píng)分參照Schmidt[6]評(píng)分。由兩名病理專業(yè)醫(yī)師行雙盲法按標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各項(xiàng)指標(biāo)使用單變量重復(fù)測(cè)量方差分析進(jìn)行計(jì)算，SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，取P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 淀粉酶變化 SAP組大鼠術(shù)后3 h、6 h、12 h血清淀粉酶水平均高于SO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。SAP組血淀粉酶水平在術(shù)后出現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。

表1 兩組大鼠血清淀粉酶水平變化（±s，U/L）

表1 兩組大鼠血清淀粉酶水平變化（±s，U/L）

注：與SO組比較，aP＜0.01

組別SO組SAP組3 h 6 h 12 h n 15 13淀粉酶1572.3±114.9 5431.3±758.5an 15 12淀粉酶1737.94±91.1 6450.5±669.8an 15 11淀粉酶1683.21±104.7 7934.2±667.9a

2.2 胰腺病理評(píng)分 SAP組大鼠術(shù)后3 h、6 h、12 h胰腺病理評(píng)分與SO組大鼠相比顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01。見表2。病理變化見圖1。

表2 兩組大鼠胰腺病理Schmidt評(píng)分（±s）

表2 兩組大鼠胰腺病理Schmidt評(píng)分（±s）

注：與SO組比較，aP＜0.01

組別SO組SAP組3 h 6 h 12 h n 15 13 Schmidt評(píng)分0.3±0.1 3.3±0.8an 15 12 Schmidt評(píng)分0.5±0.1 4.7±0.8an 15 11 Schmidt評(píng)分0.7±0.2 6.3±0.9a

圖1 胰腺組織病理變化（HE×200）

2.3 循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞相對(duì)計(jì)數(shù) SAP組大鼠術(shù)后3 h、6 h、12 h靜脈血血管內(nèi)皮細(xì)胞相對(duì)數(shù)與SO組對(duì)比明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表3。

表3 兩組大鼠脫落血管內(nèi)皮細(xì)胞相對(duì)計(jì)數(shù)（±s，100%）

表3 兩組大鼠脫落血管內(nèi)皮細(xì)胞相對(duì)計(jì)數(shù)（±s，100%）

注：與SO組比較，aP＜0.01

組別SO組SAP組3 h 6 h 12 h n 15 13 VEC相對(duì)計(jì)數(shù)28.2±1.3 35.4±3.1an 15 12 VEC相對(duì)計(jì)數(shù)29.1±1.1 43.3±2.7an 15 11 VEC相對(duì)計(jì)數(shù)29.2±1.4 54.8±3.8a

2.4 血清淀粉酶與胰腺病理評(píng)分的相關(guān)性及回歸分析 將SAP組各時(shí)間點(diǎn)胰腺病理評(píng)分（表2）與血清淀粉酶分別作為X變量和Y變量，繪制散點(diǎn)圖，兩者之間有明顯的正相關(guān)，見圖2。用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件Spearman相關(guān)分析的相關(guān)系數(shù)r=0.351，P＜0.01。用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件行直線回歸分析得直線回歸方程Y=292.7X+5098，F(xiàn)=4.224，P＜0.01。2.5 循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞與胰腺病理評(píng)分的相關(guān)性及回歸分析 將SAP組各時(shí)間點(diǎn)胰腺病理評(píng)分（表2）與脫落血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)分別作為X變量和Y變量，繪制散點(diǎn)圖，兩者之間有明顯的正相關(guān)，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件Spearman相關(guān)分析的相關(guān)系數(shù)r=0.842，P＜0.01，散點(diǎn)圖如圖3所示。用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件行直線回歸分析得直線回歸方程Y=21.227+ 4.837X，F(xiàn)=82.843，P＜0.01。

圖2 SAP組各時(shí)間點(diǎn)胰腺病理評(píng)分與AMY散點(diǎn)圖

圖3 SAP組大鼠各時(shí)間點(diǎn)胰腺病理評(píng)分與脫落血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)散點(diǎn)圖

3 討論

急性胰腺炎(AP)是指多種病因引起的胰酶激活，以胰腺局部炎性反應(yīng)為主要特征，伴或不伴其他器官功能改變的疾病。其中急性出血壞死性胰腺炎為胰腺存在炎癥、出血、壞死、感染等局部病變，在此基礎(chǔ)上迅速發(fā)展并表現(xiàn)為機(jī)體各系統(tǒng)功能損害的嚴(yán)重疾病[7]。當(dāng)出血壞死性胰腺炎發(fā)生時(shí)，胰酶激活并釋放入血，造成血胰淀粉酶升高，同時(shí)胰腺自身及肺、肝、消化道等器官的血管系統(tǒng)在炎癥因子的作用下，內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死，并經(jīng)血液循環(huán)代謝，以上兩個(gè)指標(biāo)升高的程度均與胰腺本身損傷程度有關(guān)。

成人因各系統(tǒng)發(fā)育成熟，不同機(jī)體對(duì)疾病的反應(yīng)相似，容易評(píng)估病情并針對(duì)性用藥，因此AP臨床診治方面在近年獲顯著進(jìn)展，我國(guó)多次修訂中國(guó)AP診治指南，細(xì)化該病的診療。兒童因個(gè)體差異較大，兒童的臨床體征因患兒表述能力、機(jī)體耐受力不同，常與病情不符。即使是同年齡組的患兒，體重、機(jī)體對(duì)抗應(yīng)激的反應(yīng)也存在差異，影響了AP時(shí)病情的評(píng)估及診療，目前的治療包括補(bǔ)充體液、維持水電解質(zhì)平衡、緩解疼痛、胰腺休息、支持治療、調(diào)節(jié)血脂、血糖及血鈣代謝、防止局部及全身并發(fā)癥的發(fā)生、加強(qiáng)監(jiān)護(hù)并反復(fù)評(píng)估疾病程度。通過多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，我們總結(jié)出治療胰腺炎“金標(biāo)準(zhǔn)”藥物善寧的給藥方程為：先由公式m2=0.035×kg+0.1得出體表面積，再根據(jù)公式100μg×m2/1.73 m2計(jì)算出第1個(gè)小時(shí)的輸入量，后每小時(shí)按照劑量25μg×m2/1.73 m2輸入，最少維持48～76 h，建議使用不超過7 d[8]。烏司他丁可以抑制壞死細(xì)胞釋放出炎癥因子造成的炎癥反應(yīng)，白蛋白競(jìng)爭(zhēng)性抑制胰酶消化自體蛋白并幫助修復(fù)受破壞組織，均是兒童胰腺炎的必用藥。在治療過程中我們發(fā)現(xiàn)，單純?cè)u(píng)估血胰淀粉酶升高水平、下降曲線不能及時(shí)、準(zhǔn)確地反映體內(nèi)炎癥反應(yīng)的程度及轉(zhuǎn)歸。不能為烏司他丁的應(yīng)用劑量、給藥頻度提供精確參考。特別是白蛋白的應(yīng)用指征、計(jì)量、用藥時(shí)間都尚待商榷。這也是近年來我們?cè)谂R床工作中遇到的難題之一。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了周齡16～18周的SD大鼠，這個(gè)生存期的大鼠正處于成年前期，各器官功能逐漸成熟，與兒童的生理功能相似。用這個(gè)周齡的大鼠能較準(zhǔn)確的復(fù)制兒童出血壞死性胰腺炎的病理過程。在試驗(yàn)中，SAP大鼠血清淀粉酶水平與病理損傷程度之間存在正相關(guān)，計(jì)算出他們之間的相關(guān)系數(shù)r=0.351，P＜0.01，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行直線回歸分析得直線回歸方程Y=292.7X+5098，F(xiàn)= 4.224，P＜0.01。同樣病理損傷程度與脫落細(xì)胞間也是正相關(guān)關(guān)系，他們之間的相關(guān)系數(shù)r=0.842，P＜0.01，直線方程為Y=21.227+4.837X，F(xiàn)=82.843，P＜0.01。說明脫落細(xì)胞數(shù)量與病理損傷程度相關(guān)性更強(qiáng)。

經(jīng)過此次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可以大致估算：血淀粉酶升高3倍時(shí)[正常大鼠血淀粉酶為(1572.3±114.91)U/L，造膜3 h為(5431.25±758.47)U/L]病理損傷已經(jīng)開始出現(xiàn)。此時(shí)烏司他丁給與量應(yīng)較淀粉酶水平低于正常值3倍的加倍，并增加給藥頻率。白蛋白在應(yīng)用指征、治療劑量、給藥時(shí)間等方面存在異議。目前一般掌握在胰腺周圍出現(xiàn)滲液時(shí)給藥。通過本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，可以推斷出血淀粉酶升高到正常值3倍時(shí)，多器官的功能損傷已經(jīng)出現(xiàn)。那么，可以確認(rèn)臨床上血淀粉酶升高超過正常值3倍即為給與白蛋白的指征。至于白蛋白輸注量目前1 d不超過0.5g/kg，是否能滿足高消耗性疾病的需要并修復(fù)機(jī)體完整性，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。

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（收稿：2014-04-06 修回：2014-07-06）

（責(zé)任編輯 張淑坤 屈振亮）

·作者須知·

計(jì)量單位的具體要求

組合單位符號(hào)中表示相除的斜線多于1條時(shí)應(yīng)采用負(fù)數(shù)冪的形式表示，組合單位中斜線和負(fù)數(shù)冪亦不可混用，如ng/kg/min應(yīng)采用ng·kg-1·min-1的形式，不宜采用ng/kg-1·min-1的形式。量的符號(hào)一律用斜體字，如吸光度（舊稱光密度）的符號(hào)為斜體字“A”。在敘述中應(yīng)先列出法定計(jì)量單位數(shù)值，括號(hào)內(nèi)寫舊制單位數(shù)值；如果同一計(jì)量單位反復(fù)出現(xiàn)，可在首次出現(xiàn)時(shí)注出法定與舊制單位換算系數(shù)，然后只列法定計(jì)量單位數(shù)值。血壓仍以mmHg表示。參量及其公差均需附單位，當(dāng)參量與其公差的單位相同時(shí)，單位只寫一次，如：“750.4 ng/L±18.2 ng/L”可以寫作“(750.4±18.2)ng/L”。

Relationship between Rat Circulating Endothelial Cells and Pancreatic Pathology Injury in Acute Hem-orrhagic Necrotizing Pancreatitis

ZHANG Bao-gang,WANG Xiao-ye,CUI Hua-lei.
Graduate School of Tianjin Medical University,Tianjin(300100),Chian

Objective To explore the relationship between rat circulating endothelial cells,serum amylase and pancreatic pathology injury in acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis.MethodsThe acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis models in rats were established by retrograding cholangiopancreatography injection of 5%sodium taurocholate.After the models were manufactured successfully,the rats were executed at 3 h,6 h, 12 h time points and the blood samples collected,the circulating endothelial cells were detected by flow cytometry,the activity of the amylase was checked by automatic biochemical analyzery.Then the correlation between pancreas pathology score and amylase levels was analyzed.ResultsAt 3 hours after successful modeling,the serum amylase was（5431.3±758.5）U/L,the pathological score was 3.3±0.8,the circulating endothelial cell count was 35.4±3.1%;and at 6 hours after successful modeling,the serum amylase was（6450.5±669.8）U/L, the pathological score was 6.3±0.9,the circulating endothelial cell count was 43.3±2.7;at 12 hours after successful modeling,the serum amylase was（7934.2±667.9）U/L,the pathological score was 3.3±0.8,and the circulating endothelial cell count was 54.8±3.8%.The correlation coefficient between serum amylase and pathological injury score was r=0.351,P＜0.01,the relationship equation was Y=292.7X+5098,the correlation coefficient between circulating endothelial cells and pathological injury score was r=0.842,P＜0.01,the rela-tionship equation was Y=21.227+4.837x.ConclusionThe amylase levels and the number of circulating endothelial exfoliated cells are positively correlated with the extent of damage when the body suffers in acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis,but the latter is more relevant that can reflect the degree of multi-organ damage better.

Exfoliated cells;amylase level;pathological type;correlation

Q95-33;R657.5+1

A

1007-6948(2014)04-0400-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2014.04.020

天津市衛(wèi)生局科技基金（2013K2036）

1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院（天津 300074）

2.天津市兒童醫(yī)院（天津 300074）

王曉曄，E-mail：wxygege@sina.com