單層組織工程纖維環(huán)取向納米纖維支架的構(gòu)建和初步驗(yàn)證

楊成偉，鄧國(guó)英，楊 洋，莫秀梅，葉曉健

椎間盤的纖維環(huán)由15～25層同心膠原纖維板層構(gòu)成，每個(gè)板層膠原纖維具有高度的取向性，而且每個(gè)板層之間膠原纖維方向相反[1-3]。組成纖維環(huán)細(xì)胞外基質(zhì)的膠原纖維和蛋白聚糖所形成的特殊三維結(jié)構(gòu)對(duì)于承擔(dān)并分解椎間盤所承擔(dān)的巨大軸向壓力具有重要作用[4]。退變、外傷等原因都可以引起的纖維環(huán)的退變、撕裂、破損，均可引起髓核突出導(dǎo)致局部炎癥和神經(jīng)根機(jī)械壓迫進(jìn)而導(dǎo)致肢體疼痛和功能障礙。盡管目前主流的腰椎間盤切除手術(shù)可獲得很好的臨床療效[5]，但該手術(shù)僅能解除壓迫因素并不能修復(fù)纖維環(huán)。如能對(duì)破損的纖維環(huán)進(jìn)行有效的生物學(xué)修復(fù)不但可提高手術(shù)療效，還能延緩椎間盤進(jìn)一步退變。通過(guò)組織工程方法構(gòu)建功能性纖維環(huán)修復(fù)材料為椎間盤疾病的治療提供了新的方向，而構(gòu)建滿足力學(xué)和生物學(xué)要求的組織工程支架是制備組織工程纖維環(huán)的關(guān)鍵。

組織工程纖維環(huán)支架的構(gòu)建應(yīng)當(dāng)盡量模擬纖維環(huán)的細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，通過(guò)選用適當(dāng)?shù)闹苽浞椒ê驮希瑯?gòu)建兼具力學(xué)強(qiáng)度和良好組織相容性的生物材料。本實(shí)驗(yàn)采用靜電紡絲的方法，使用力學(xué)性能和組織相容性較好的聚左旋乳酸聚己內(nèi)酯[poly(lactic acid-co-caprolactone, P(LLA-CL)]模擬單層纖維環(huán)組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，構(gòu)建了取向納米纖維支架，并以無(wú)規(guī)納米纖維支架為對(duì)照，進(jìn)行力學(xué)和生物學(xué)評(píng)估，探討其作為組織工程纖維環(huán)支架材料的可行性。

1 材料和方法

1.1 原料

P(LLA-CL)(聚乳酸∶聚己內(nèi)酯=75∶25，分子量：3.4×105)購(gòu)自日本GUNZE公司。六氟異丙醇(HFIP)購(gòu)自上海達(dá)瑞精細(xì)化學(xué)品有限公司。以上原料使用時(shí)均不再需要純化。

1.2 支架制備

將P(LLA-CL)按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%溶解于HFIP溶劑中，密封后置于磁力攪拌器上，在室溫下攪拌至成為完全透明的溶液。將配制好的P(LLA-CL)溶液注入注射器中，注射器針頭通過(guò)導(dǎo)線與直流電高壓發(fā)生器相連，電壓設(shè)定為12 KV。P(LLA-CL)溶液的推進(jìn)速度由微量注射泵控制，流速為1.5 mL/h。制備無(wú)規(guī)則納米纖維支架時(shí)，使用固定的平板接地鋁箔收集納米纖維，針頭距鋁箔15 cm。制備取向納米纖維支架時(shí)，使用直徑為5 cm的接地金屬滾筒收集納米纖維，針頭距滾筒上表面15 cm，滾筒轉(zhuǎn)速為8.3 m/s。制備好的電紡納米纖維支架置于真空干燥箱內(nèi)保存，備用。

1.3 支架的形貌觀測(cè)

支架的表面形態(tài)使用掃面電鏡(JSM-5600，日本JEOL公司)進(jìn)行觀察。將制備的納米纖維支架噴金后，使用掃面電鏡觀察支架表面的納米纖維形態(tài)。使用圖像分析軟件Image J分析纖維的直徑、角度分布以及支架孔徑。隨機(jī)選取掃描電鏡圖片上的100根納米纖維，測(cè)量其直徑和角度。隨機(jī)選取掃描電鏡圖片上的100個(gè)孔，測(cè)量孔徑。

1.4 支架的拉伸力學(xué)測(cè)試

將制備好的納米纖維支架裁剪成5 mm×20 mm的長(zhǎng)條形，測(cè)量支架的厚度。將裁剪好的樣品固定于材料力學(xué)測(cè)試機(jī)上，使用材料力學(xué)性能顯微測(cè)試系統(tǒng)[6]，根據(jù)Nerurkar等[7]介紹的測(cè)試方法進(jìn)行測(cè)試。通過(guò)測(cè)量結(jié)果計(jì)算支架的斷裂強(qiáng)度、彈性模量和斷裂伸長(zhǎng)率3個(gè)力學(xué)指標(biāo)。

1.5 在支架上種植并培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells， MSCs)

參考Tan等[8]描述的方法，提取原代SD大鼠MSCs。將2種支架分別裁剪成1.2 cm×1.2 cm大小的方形。裁剪后的支架材料通過(guò)紫外線照射2 h進(jìn)行消毒，并將支架浸沒(méi)于70%的酒精溶液4 h中增加支架的親水性。消毒處理后的支架置于24孔板中使用干細(xì)胞專用培養(yǎng)基(美國(guó)Sciencell公司)孵育過(guò)夜。每個(gè)支架表面種植MSCs的數(shù)目為5×104，置于37℃，5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)基隔天換液。

1.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8, CCK-8，日本Dojindo研究所)對(duì)MSCs在2種支架上的增殖情況進(jìn)行評(píng)估。細(xì)胞增殖測(cè)試選擇接種細(xì)胞的第1天和第7天進(jìn)行。分別提取24孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，并加入含有10%的CCK-8試劑，避光孵育2 h后，使用Model 550型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)于450 nm進(jìn)行度數(shù)。根據(jù)前期繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出每個(gè)支架上的細(xì)胞量。

1.7 細(xì)胞形態(tài)觀察

細(xì)胞種植培養(yǎng)后7 d，取出種有細(xì)胞的納米纖維支架，使用PBS沖洗3次，使用4%多聚甲醛固定30 min，以Triton X通透5 min后，使用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，美國(guó)Invitrogen公司)和鬼筆環(huán)肽(美國(guó)Invitrogen公司)分別對(duì)細(xì)胞核和細(xì)胞骨架進(jìn)行染色。使用共聚焦顯微鏡(TCS SP5，德國(guó)Leica公司)對(duì)支架表面的細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 靜電紡絲納米纖維支架的表面形態(tài)

無(wú)規(guī)納米纖維支架和取向納米纖維支架表面形態(tài)、纖維直徑分布和角度分布見(jiàn)圖1。無(wú)規(guī)納米纖維支架中的納米纖維無(wú)序分布，而取向納米纖維支架的大部分納米纖維分布于0°～30°的角度區(qū)間內(nèi)。無(wú)規(guī)納米纖維支架的納米纖維直徑(996.14 nm±137.76 nm)略大于取向納米纖維支架(963.32 nm±158.13 nm)，但兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。無(wú)規(guī)納米纖維支架的孔徑(72.8 μm2±52.6 μm2)明顯大于取向納米纖維支架(16.7 μm2±11.9 μm2)，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，這一結(jié)果和Koepsell等[9]的研究結(jié)果一致。

a: 無(wú)規(guī)納米纖維支架的電鏡掃描 b: 無(wú)規(guī)納米纖維支架纖維角度分布 c: 取向納米纖維支架的電鏡掃描 d: 取向納米纖維支架纖維角度分布
a: Scanning electron microscopy image of electrospun P(LLA-CL) random nanofibrous scaffold b: Angular distributions of nanofibers in random nanofibrous scaffold c: Scanning electron microscopy image of aligned nanofibrous scaffold d: Angular distributions of nanofibers in aligned nanofibrous scaffold
圖12種支架的表面形態(tài)
Fig.1Surfaces of 2 kinds of nanofibrous scaffolds

2.2 納米纖維支架的拉伸力學(xué)結(jié)果

納米纖維排列的方向性對(duì)支架的力學(xué)性能影響很大(見(jiàn)圖2)。取向納米纖維支架的3個(gè)主要力學(xué)指標(biāo)(斷裂強(qiáng)度、彈性模量和斷裂伸長(zhǎng)率)在平行和垂直于纖維方向的2種情況下差異明顯，表明取向納米纖維支架具有各向異性的力學(xué)特點(diǎn)。無(wú)規(guī)納米纖維支架的力學(xué)特點(diǎn)為各項(xiàng)同性，其斷裂強(qiáng)度和彈性模量分別為(6.30±0.42)Mpa和(110.73±11.11)MPa均低于取向納米纖維支架在平行于纖維方向上所測(cè)得的結(jié)果；而無(wú)規(guī)納米纖維支架的斷裂伸長(zhǎng)率(111.23±16.51)%要高于取向納米纖維支架在取向方向上的結(jié)果(75.70±5.43)%。與Bosworth等[10]的研究結(jié)果相似，取向納米纖維支架在取向方向的斷裂強(qiáng)度(21.90±2.01)MPa和彈性模量(385.85±17.46)MPa大約為無(wú)規(guī)納米纖維支架的4倍?？梢?jiàn)在平行于納米纖維的方向上，取向納米纖維支架的力學(xué)強(qiáng)度得到了明顯的增強(qiáng)。

2.3 細(xì)胞增殖情況

CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況的結(jié)果(見(jiàn)圖3)顯示，在第1和7天，2種支架表面的MSCs均快速增殖，2種支架上第7天的細(xì)胞數(shù)目均較第1天時(shí)明顯增加，但是2種支架上的細(xì)胞數(shù)目在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 納米纖維支架表面的細(xì)胞形態(tài)

MSCs種植于2種納米纖維支架培養(yǎng)7 d后的共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果如圖4所示。MSCs在無(wú)規(guī)納米纖維支架上無(wú)序分布，細(xì)胞骨架也呈無(wú)序狀態(tài)。而細(xì)胞在取向納米纖維支架上的排列卻具有明顯的方向性，所有細(xì)胞均平行于納米纖維方向定向排列，細(xì)胞伸展并呈紡錘形，細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白的排列和細(xì)胞排列方向相一致?？梢?jiàn)支架中納米纖維的排列方向?qū)χЪ鼙砻婕?xì)胞的排列和形態(tài)具有明顯的誘導(dǎo)作用。

3 討 論

3.1 取向納米纖維支架的制備

近10年來(lái)，靜電紡絲技術(shù)[11]作為一種通過(guò)電場(chǎng)力制造納米至微米級(jí)極細(xì)纖維絲的方法，因其相對(duì)簡(jiǎn)單的技術(shù)流程和相對(duì)廣泛的原材料選擇，在組織工程支架構(gòu)建方面得到了廣泛關(guān)注并取得了長(zhǎng)足的發(fā)展。靜電紡絲纖維具有極高的表面體積比、可調(diào)節(jié)的孔隙率及延展性，且靜電紡絲纖維直徑數(shù)量級(jí)和細(xì)胞外基質(zhì)纖維相似，因此靜電紡絲組織工程支架能夠模擬細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞和基質(zhì)及細(xì)胞間的相互作用。經(jīng)典的靜電紡絲技術(shù)通過(guò)平板來(lái)收集納米纖維，所得到的支架中納米纖維絲隨機(jī)排列，因而該支架具有各項(xiàng)同性的結(jié)構(gòu)和力學(xué)特點(diǎn)。但是纖維環(huán)組織具有復(fù)雜的板層結(jié)構(gòu)，每個(gè)板層中所含的膠原纖維又具有高度的取向性，因此如模擬纖維環(huán)細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，就需要獲得纖維排列方向一致的納米纖維支架，最常用辦法是通過(guò)高速滾軸來(lái)收集電紡纖維。Koepsell等[9]和Nerurkar等[12]研究了不同速度滾軸收集的納米纖維制備取向納米纖維支架的特點(diǎn)，其使用聚己內(nèi)酯構(gòu)建取向納米纖維支架，發(fā)現(xiàn)滾軸轉(zhuǎn)速越快，所構(gòu)建支架中的納米纖維取向性越強(qiáng)，平行于纖維方向的力學(xué)強(qiáng)度也越高。本研究以P(LLA-CL)為原料，使用高速滾軸(8.3 m/s)制備取向納米纖維支架，獲得的支架取向性較高，有87%的納米纖維的角度分布于0°～30°；使用平板接收納米纖維的無(wú)規(guī)納米纖維支架纖維方向在各個(gè)角度范圍內(nèi)均勻分布。本研究中發(fā)現(xiàn)取向納米纖維支架的纖維直徑略小于無(wú)規(guī)納米纖維支架，盡管這一結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是這一現(xiàn)在也在國(guó)外報(bào)道中[9]出現(xiàn)過(guò)。導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是滾軸在高速旋轉(zhuǎn)的情況下表面的離心力較大，可能將靜電黏附于滾軸表面的納米纖維拉伸，纖維直徑就會(huì)減小。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)取向納米纖維支架的孔徑較無(wú)規(guī)納米纖維支架明顯縮小，這一結(jié)果和Koepsell等[9]的研究結(jié)果相一致，取向度越高則孔徑越小。由于支架的孔徑對(duì)于細(xì)胞的黏附和增殖具有重要的作用，大孔徑更有利于細(xì)胞獲得更充足的養(yǎng)分，因此取向支架的小孔徑可能是后期進(jìn)一步研究所面臨的主要困難。

a: 拉伸強(qiáng)度 b: 楊氏模量 c: 斷裂伸長(zhǎng)率 ‖: 平行于取向納米纖維的纖維方向 ⊥: 垂直于取向納米纖維的纖維方向
a: Tensile strength b: Young’s modulus c: Elongation at break ‖: Parallel presumed fiber direction ⊥: Perpendicular presumed fiber direction
圖22種支架的力學(xué)性能
Fig.2Mechanical properties of 2 kinds of nanofibrous scaffolds

圖32種支架的細(xì)胞增殖情況
Fig.3Cell proliferation on 2 kinds of nanofibrous scaffolds

a: 無(wú)規(guī)納米纖維支架 b: 取向納米纖維支架 藍(lán)色:細(xì)胞核 紅色:細(xì)胞骨架蛋白
a: Random nanofibrous scaffold b: Aligned nanofibous scaffold Blue: Nuclei Red: Cytoskeletal protein
圖42種支架表面MSCs的生長(zhǎng)情況(共焦顯微鏡，×400)
Fig.4MSCs on 2 kinds of nanofibrous scaffolds(confocal microscopy，×400)

3.2 取向納米纖維支架的力學(xué)分析

無(wú)規(guī)納米纖維支架在力學(xué)上表現(xiàn)為各項(xiàng)同性，各個(gè)方向上的力學(xué)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單層纖維環(huán)具有明顯的各向異性力學(xué)特點(diǎn)，拉伸力學(xué)測(cè)試結(jié)果提示，取向納米纖維支架正好能模擬這一特點(diǎn)。對(duì)于纖維環(huán)組織工程而言，較強(qiáng)的強(qiáng)度和剛度是對(duì)支架材料極為重要的要求。研究已經(jīng)證實(shí)，單層人體纖維環(huán)在纖維方向上的拉伸彈性模量為80～120 MPa[3]。國(guó)外的研究者[9, 12-13]多使用聚己內(nèi)酯進(jìn)行支架構(gòu)建，聚己內(nèi)酯雖然具有良好的組織相融性和延展性，但其強(qiáng)度和剛度較差，國(guó)外研究者構(gòu)建的聚己內(nèi)酯納米纖維支架彈性模量為50 MPa，尚不能達(dá)到纖維環(huán)的力學(xué)要求。本研究使用P(LLA-CL)作為原料構(gòu)建納米纖維支架，該材料的強(qiáng)度和剛度都比聚己內(nèi)酯強(qiáng)很多，拉伸力學(xué)結(jié)果提示P(LLA-CL)構(gòu)建的取向納米纖維支架平行于纖維方向的彈性模量為240 MPa，完全滿足纖維環(huán)組織工程的力學(xué)要求。

3.3 取向納米纖維支架對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

人體纖維環(huán)組織中膠原蛋白均呈束狀分布并具有高度的取向性，同時(shí)纖維環(huán)細(xì)胞也是沿著膠原束的方向拉伸并定向分布。本研究所制備的取向納米纖維支架具有高度的取向性，細(xì)胞能夠在取向納米纖維的影響下沿著納米纖維的方向拉伸并按照纖維方向進(jìn)行排列。納米纖維對(duì)于細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞骨架的作用已經(jīng)在許多研究中[10, 14]得到了證實(shí)。納米纖維通過(guò)控制細(xì)胞黏附點(diǎn)面積，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附斑構(gòu)型從而對(duì)張力絲的結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)節(jié)。與Li等[15]的研究結(jié)果相似，本實(shí)驗(yàn)共聚焦顯微鏡可觀察到MSCs在取向納米纖維支架上取向排列且明顯伸長(zhǎng)，細(xì)胞骨架也具有明顯的取向性，和無(wú)規(guī)納米纖維支架上MSCs的形態(tài)具有明顯的差異。細(xì)胞形態(tài)改變和對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的分泌具有重要的影響，在取向納米纖維支架上，細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)同樣具有取向性，而無(wú)規(guī)納米纖維支架上的細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)則是無(wú)序的。本研究中取向納米纖維支架對(duì)細(xì)胞形態(tài)和分布的序列化作用進(jìn)一步提示其作為纖維環(huán)組織工程支架的可能性。

綜上所述，使用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建的P(LLA-CL)取向納米纖維支架能夠模擬單層纖維環(huán)細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，滿足纖維環(huán)組織工程對(duì)支架的力學(xué)要求，促進(jìn)細(xì)胞定向拉伸排列，可用于進(jìn)一步的纖維環(huán)組織工程研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Marchand F, Ahmed AM. Investigation of the laminate structure of lumbar disc anulus fibrosus[J]. Spine (Phila Pa 1976), 1990, 15(5):402-410.

[2] Cassidy JJ, Hiltner A, Baer E. Hierarchical structure of the intervertebral disc[J]. Connect Tissue Res, 1989, 23(1):75-88.

[3] Holzapfel GA, Schulze-Bauer CA, Feigl G, et al. Single lamellar mechanics of the human lumbar anulus fibrosus[J]. Biomech Model Mechanobiol, 2005, 3(3):125-140.

[4] Guterl CC, See EY, Blanquer SB, et al. Challenges and strategies in the repair of ruptured annulus fibrosus[J]. Eur Cell Mater, 2013, 25:1-21.

[5] 馬學(xué)曉, 岳彬, 陳伯華, 等. 單純髓核摘除術(shù)治療腰椎椎間盤突出癥的長(zhǎng)期療效觀察[J]. 脊柱外科雜志, 2012, 10(5):293-295.

[6] 張東升, 羅淼, 韓永勝. 材料力學(xué)性能顯微測(cè)試系統(tǒng)[J]. 實(shí)驗(yàn)力學(xué), 2006, 21(5):651-654.

[7] Nerurkar NL, Elliott DM, Mauck RL. Mechanics of oriented electrospun nanofibrous scaffolds for annulus fibrosus tissue engineering[J]. J Orthop Res, 2007, 25(8):1018-1028.

[8] Tan Q, Lui PP, Rui YF, et al. Comparison of potentials of stem cells isolated from tendon and bone marrow for musculoskeletal tissue engineering[J]. Tissue Eng Part A, 2012, 18(7-8):840-851.

[9] Koepsell L, Remund T, Bao J, et al. Tissue engineering of annulus fibrosus using electrospun fibrous scaffolds with aligned polycaprolactone fibers[J]. J Biomed Mater Res A, 2011, 99(4):564-575.

[10] Bosworth LA, Alam N, Wong JK, et al. Investigation of 2D and 3D electrospun scaffolds intended for tendon repair[J]. J Mater Sci Mater Med, 2013, 24(6):1605-1614.

[11] Liu W, Thomopoulos S, Xia Y. Electrospun nanofibers for regenerative medicine[J]. Adv Healthc Mater, 2012, 1(1):10-25.

[12] Nerurkar NL, Mauck RL, Elliott DM. ISSLS prize winner: integrating theoretical and experimental methods for functional tissue engineering of the annulus fibrosus[J]. Spine (Phila Pa 1976), 2008, 33(25):2691-2701.

[13] Han WM, Nerurkar NL, Smith LJ, et al. Multi-scale structural and tensile mechanical response of annulus fibrosus to osmotic loading[J]. Ann Biomed Eng, 2012, 40(7):1610-1621.

[14] Baker BM, Handorf AM, Ionescu LC, et al. New directions in nanofibrous scaffolds for soft tissue engineering and regeneration[J]. Expert Rev Med Devices, 2009, 6(5):515-532.

[15] Li WJ, Mauck RL, Cooper JA, et al. Engineering controllable anisotropy in electrospun biodegradable nanofibrous scaffolds for musculoskeletal tissue engineering[J]. J Biomech, 2007, 40(8):1686-1693.