腫瘤標(biāo)志物的應(yīng)用及其篩選技術(shù)研究進(jìn)展

李策，聶彩輝，張力君，徐寒梅

(中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009)

·前沿與進(jìn)展· ADVANCES IN PHARMACEUTICAL SCIENCES

腫瘤標(biāo)志物的應(yīng)用及其篩選技術(shù)研究進(jìn)展

李策，聶彩輝，張力君，徐寒梅*

(中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009)

編者按：惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類生命安全及身心健康，而早期診斷是治愈腫瘤的關(guān)鍵。目前臨床應(yīng)用的X線檢查、超聲檢查、CT檢查、核磁共振檢查、內(nèi)腔鏡檢查等手段能從不同角度對腫瘤進(jìn)行診斷，可在一定程度上提高腫瘤的早期診斷率，但又各有其局限性；腫瘤標(biāo)志物的出現(xiàn)則為腫瘤的早期診斷帶來了更多的希望。腫瘤標(biāo)志物是腫瘤細(xì)胞通過基因表達(dá)而合成、分泌，或是機(jī)體對腫瘤反應(yīng)而異常產(chǎn)生或表達(dá)水平異常的一類物質(zhì)，其對腫瘤輔助診斷以及腫瘤預(yù)后、藥物療效的評價均具有重要意義。隨著分子生物學(xué)和人類基因組計劃的進(jìn)展，越來越多的新型腫瘤標(biāo)志物被相繼發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用于臨床，其篩選技術(shù)也發(fā)生了巨大的革新。在本期的“前沿與進(jìn)展”欄目，特邀中國藥科大學(xué)徐寒梅教授對腫瘤標(biāo)志物的應(yīng)用及其篩選技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行介紹，為腫瘤標(biāo)志物的深入研發(fā)提供思路。

腫瘤標(biāo)志物是腫瘤細(xì)胞通過基因表達(dá)而合成、分泌，或是機(jī)體對腫瘤反應(yīng)而異常產(chǎn)生或表達(dá)水平異常的一類物質(zhì)，在腫瘤早期發(fā)現(xiàn)、診斷及預(yù)后中均起到重要作用。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，新型腫瘤標(biāo)志物不斷被發(fā)現(xiàn)，腫瘤標(biāo)志物的篩選方法也發(fā)生了根本性的變革。對新型腫瘤標(biāo)志物及其篩選技術(shù)進(jìn)行匯總和介紹，旨在為腫瘤標(biāo)志物的臨床應(yīng)用與深入研究提供參考。

腫瘤標(biāo)志物；聯(lián)合診斷；檢測技術(shù)；篩選

腫瘤標(biāo)志物（tumor marker，TM）是指在惡性腫瘤的發(fā)生和增殖過程中，因腫瘤細(xì)胞的相關(guān)基因表達(dá)或機(jī)體對腫瘤產(chǎn)生反應(yīng)而異常變化的一類物質(zhì)[1]。腫瘤標(biāo)志物自發(fā)現(xiàn)至今已有100多年歷史，從20世紀(jì)60年代開始，其在臨床上開始被廣泛應(yīng)用，在腫瘤的發(fā)現(xiàn)和治療中發(fā)揮了重

1 腫瘤標(biāo)志物概述

腫瘤標(biāo)志物在臨床上主要用于原發(fā)腫瘤的發(fā)現(xiàn)、腫瘤高危人群的篩選、良性和惡性腫瘤的鑒別診斷、腫瘤類別和發(fā)展程度的判斷、腫瘤治療效果的觀察和評價以及腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后的預(yù)測等。

1.1 腫瘤標(biāo)志物的主要特征及評價標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)臨床評價標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤標(biāo)志物應(yīng)具備以下特征：1）必須由惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，并可在血液、組織液、分泌液或腫瘤組織中檢測到；2）在正常組織或良性腫瘤中含量較低；3）某一腫瘤的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)該能在罹患該腫瘤的大多數(shù)患者中檢測出來；4）臨床上尚無明確腫瘤診斷證據(jù)之前就能測出；5）腫瘤標(biāo)志物的量最好能反映腫瘤的大??；6）在一定程度上能有助于估計治療效果、預(yù)測腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[2]。

理想的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)具有高度的腫瘤特異性（即在良性疾病時該標(biāo)志物水平不應(yīng)升高）、器官特異性，以及敏感性（能提示微量瘤細(xì)胞的存在）。評價腫瘤標(biāo)志物的指標(biāo)如表1所示。

表1 評價腫瘤標(biāo)志物的指標(biāo)Table 1 The evaluation indexes of tumor markers

1.2 臨床主要腫瘤標(biāo)志物

總的來說，臨床腫瘤標(biāo)志物主要可分為以下幾類：1）腫瘤胚胎性抗原，如CEA、AFP；2）異位激素，如HCG；3）酶和同工酶，如LDH、PAP；4）血漿蛋白，如β22M；5）腫瘤抗原，如CA19-9、CA125[3]。目前已命名的腫瘤標(biāo)志物有100多種，臨床常用的腫瘤標(biāo)志物及其主診的腫瘤類型見表2[4]。

表2 臨床主要腫瘤標(biāo)志物Table 2 The main clinical tumor markers

續(xù)表2

除了臨床主要腫瘤標(biāo)志物外，還有一些常見的標(biāo)志物， 它們對于某些類型腫瘤的診斷起到重要作用（見表3）[4]。

表3 常見的其他臨床腫瘤標(biāo)志物Table 3 The other common clinical tumor markers

1.3 腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合診斷

單一腫瘤標(biāo)志物監(jiān)測診斷某一種惡性腫瘤的準(zhǔn)確率不是很高，一般不會超過60%；特異性也會受到一定的限制。不同類型的腫瘤釋放標(biāo)志物濃度不同，且在腫瘤發(fā)展的不同時期其釋放標(biāo)志物濃度也不一樣，故在臨床上多采用多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合診斷和動態(tài)觀察的方法，以達(dá)到提高腫瘤診斷陽性率的目的。目前臨床聯(lián)合診斷的腫瘤標(biāo)志物及診斷的腫瘤類型見表4。

表4 腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測項(xiàng)目Table 4 The combined detection items of tumor markers

相比于單一腫瘤標(biāo)志物檢測，腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測具有更佳的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確率。以肺癌為例，NSE與ProGRP聯(lián)合對小細(xì)胞肺癌診斷的敏感度和特異度分別為88.90%和72.82%。TSGF、SCCAg、CYFRA21-1三者聯(lián)合對鱗癌診斷的敏感度和特異度分別為95.3%和74.2%；CA153、Ferrtin、CEA三者聯(lián)合對肺癌診斷的敏感度和特異度分別為91.90%和44.00%，均遠(yuǎn)高于單一標(biāo)志物的診斷效果[5]。Moore等[6]利用HE4和CD125聯(lián)合診斷530例卵巢上皮癌（EOC）患者，其有效率高達(dá)93.8%，檢出率大大提高；且該手段可用于診斷各個分期的卵巢癌。

C12多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測是目前國際上受到廣泛公認(rèn)的應(yīng)用于癌癥早期篩查的先進(jìn)技術(shù)。其可一次性對12種腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測，包括AFP、CA125、CA199、CEA、CA153、CA242、Ferritin、β-HCG、 NSE、HGH、f-PSA、PSA?？梢栽缙诎l(fā)現(xiàn)9種最常見、最高發(fā)的惡性腫瘤，包括：肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌[7]。其檢出率達(dá)90%以上，而常規(guī)查體癌癥的檢出率只有0.2%。目前C12多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片檢測技術(shù)既可用于腫瘤的早期篩查，亦可用于治療監(jiān)測及預(yù)后評估。

1.4 腫瘤標(biāo)志物的篩選

腫瘤標(biāo)志物開發(fā)分為5個階段：1）臨床前實(shí)驗(yàn)室研究階段；2）臨床驗(yàn)證階段；3）驗(yàn)證標(biāo)志物是否可以作為一種篩檢指標(biāo)并確定其診斷標(biāo)準(zhǔn)；4）進(jìn)一步驗(yàn)證其對疾病的篩檢效果，確定假陽性率；5）設(shè)計隨機(jī)對照試驗(yàn)來評價這種篩檢手段在人群中應(yīng)用的價值。詳細(xì)過程見表5[8]。

表5 腫瘤標(biāo)志物篩選流程Table 5 The screening process of tumor markers

續(xù)表5

腫瘤標(biāo)志物篩選研究樣本有腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞株、腫瘤患者的血液及分泌物等。目前的常用方法有：組織芯片、基因芯片、蛋白質(zhì)差異表達(dá)比較、單克隆抗體技術(shù)等。利用組織芯片和基因芯片篩選腫瘤標(biāo)志物是通過對比檢測腫瘤組織和非腫瘤組織中蛋白質(zhì)和核苷酸的表達(dá)，篩選有差異表達(dá)的蛋白和核苷酸的方法；蛋白質(zhì)差異表達(dá)比較是利用二維電泳和質(zhì)譜等手段檢測腫瘤組織與正常組織的蛋白表達(dá)差異；利用單克隆抗體技術(shù)篩選腫瘤抗原是指使用腫瘤細(xì)胞免疫動物，利用細(xì)胞融合的方法得到單克隆抗體，并用其篩選表達(dá)異常的腫瘤抗原。

2 腫瘤標(biāo)志物研究近況及發(fā)展方向

理想的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)具有以下特點(diǎn)：1）較高的敏感性；2）較高的特異性；3）易于檢出；4）良好的指示性，能較快地反映體內(nèi)腫瘤隨治療或干預(yù)的實(shí)際變化；5）可靠的預(yù)測性。未來腫瘤標(biāo)志物的發(fā)展方向主要是提高特異性和敏感性[9]。目前腫瘤標(biāo)志物的發(fā)展方向可以概括為以下幾類。

2.1 癌基因、抑癌基因及其產(chǎn)物

癌基因是指在自然或?qū)嶒?yàn)條件下，具有潛在的誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化能力的基因。抑癌基因是機(jī)體中一類對正常細(xì)胞增殖起負(fù)調(diào)節(jié)作用的基因。當(dāng)抑癌基因丟失、失活或變異時，往往會促使細(xì)胞增殖失控而呈惡性生長。在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，癌基因和抑癌基因的變化一直是研究的重點(diǎn)，各種腫瘤中基本上都能發(fā)現(xiàn)癌基因和抑癌基因的改變。因此，檢測癌基因和抑癌基因的變化或其產(chǎn)物的變化也就成為早期診斷腫瘤的一個有效途徑。常見的癌基因見表6，抑癌基因見表7[10]。

表6 常見癌基因類腫瘤標(biāo)志物Table 6 The common tumor markers of cancer genes

表7 常見抑癌基因類腫瘤標(biāo)志物Table 7 The common tumor markers of tumor suppressor genes

正常的p53基因編碼相對分子質(zhì)量為53 000的蛋白，在細(xì)胞周期中起重要的調(diào)節(jié)作用，對細(xì)胞癌變有抑制作用，當(dāng)該基因發(fā)生點(diǎn)突變、缺失或滅活時，即由野生型轉(zhuǎn)變?yōu)橥蛔冃?，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。p53基因檢測的臨床意義在于：1）90%的小細(xì)胞肺癌（SCLC）患者組織標(biāo)本中可檢測到p53基因突變，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者中突變率約為60%；2）突變者多對放化療反應(yīng)差，也容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，p53基因可作為療效和預(yù)后判定的指標(biāo)；3）p53基因常在腫瘤發(fā)生的早期發(fā)生突變，有助于腫瘤的早期診斷。Ras基因家族與人類腫瘤相關(guān)的有3種，分別是H-Ras、K-Ras和N-Ras，分別定位在11、12和1號染色體上。K-Ras與表皮生長因子受體（EGFR）之間關(guān)系密切。《美國國立癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)（NCCN）結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南》指出：所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者都應(yīng)檢測K-Ras基因狀態(tài)；只有K-Ras野生型患者才建議接受EGFR抑制劑如西妥昔單抗和帕尼單抗（包括單藥或與化療聯(lián)合）治療。Ratner等[11]研究發(fā)現(xiàn)，K-Ras的3’端非編碼區(qū)發(fā)生突變的卵巢癌病人，相比于未發(fā)生突變的病人預(yù)后較差。myc基因家族共有6成員：c-myc、N-myc、L-myc、P-myc、R-myc及B-myc。其中c-myc、N-myc及L-myc與某些人類腫瘤相關(guān)。當(dāng)機(jī)體發(fā)生腫瘤時，myc基因家族成員可以發(fā)生染色體基因易位、基因擴(kuò)增及過度表達(dá)。幾乎100%的Burkitt淋巴瘤病人均有c-myc基因易位，在部分小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、乳腺癌患者中存在c-myc基因過度表達(dá)的現(xiàn)象。Albasri等[12]發(fā)現(xiàn)，C末端類張力蛋白（C-terminal tensinlike，C-TEN）基因是一種新型的癌基因，高表達(dá)于預(yù)后不良的浸潤性乳腺癌。Torti等[13]證實(shí)Met癌基因在胃癌中高表達(dá)，并推測Met癌基因的過度表達(dá)是癌細(xì)胞生長和存活的必要條件。

2.2 腫瘤DNA生物標(biāo)志物

腫瘤的發(fā)生會導(dǎo)致細(xì)胞某些DNA水平的改變，而這些變化可以被檢測到，該類DNA被稱之為腫瘤DNA生物標(biāo)志物，腫瘤DNA生物標(biāo)志物相對常規(guī)標(biāo)志物具有以下優(yōu)勢：1）易于檢出；2）檢測時間短；3）費(fèi)用低。常見的腫瘤DNA生物標(biāo)志物見表8[8]。

表8 常見的腫瘤DNA生物標(biāo)志物Table 8 The common DNA tumor biomarkers

DNA腫瘤標(biāo)志物?？捎糜谂袛嗍欠衲苁褂媚撤N單抗類或酶抑制劑類藥物進(jìn)行治療，例如表皮生長因子受體（EGFR）可作為是否能使用一線EGFR酪氨酸激酶抑制劑類藥物的標(biāo)志物[18]。某些DNA腫瘤標(biāo)志物已經(jīng)通過了FDA認(rèn)證，更多的DNA腫瘤標(biāo)志物處于臨床研究階段。Reinert等[19]發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者中存在某些基因組的甲基化，推測甲基化的基因可以作為腫瘤早期診斷的標(biāo)志物。

2.3 細(xì)胞因子及其受體類腫瘤標(biāo)志物

細(xì)胞因子及其受體在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的增殖和分化過程中起著重要作用，在腫瘤細(xì)胞的快速增殖過程中，必然引起細(xì)胞因子及其受體表達(dá)和分布的變化。在腫瘤免疫過程中，免疫有關(guān)的因子也會發(fā)生量的變化。因此通過檢測細(xì)胞因子及其受體的變化可以發(fā)現(xiàn)潛在的腫瘤標(biāo)志物。

Hayashi等[20]發(fā)現(xiàn)荷有惡性子宮平滑肌瘤（UT-LMS）的小鼠其子宮組織上LMP2/β1i的表達(dá)量只有普通正常小鼠的40%，并在臨床上發(fā)現(xiàn)LMP2/β1i在良性子宮平滑肌瘤中并沒有降低表達(dá)水平，而只在UT-LMS中降低，推測LMP2/β1i可以作為UT-LMS的腫瘤標(biāo)志物。Petrovici等[21]通過檢測70例急性髓細(xì)胞白血病（AML）患者的骨髓樣品，發(fā)現(xiàn)NG2表達(dá)量高于10%的患者平均生存率只有7個月，而NG2表達(dá)量低于10%的患者平均生存率達(dá)17個月，推測NG2表達(dá)量低的患者可能有更長的生存期，故NG2可以作為判斷AML患者預(yù)后的指標(biāo)。Bharti等[22]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)合珠蛋白亞基和肝細(xì)胞生長因子可作為小細(xì)胞肺癌的血清腫瘤生物標(biāo)志物，當(dāng)患者血清珠蛋白亞基水平高于1.9 U·L-1，或HGF水平高于500 ng·L-1時，預(yù)后會相對較差。Won等[23]發(fā)現(xiàn)，人腎損傷分子-1（HKIM-1）在正常腎組織中的含量低于檢測限，但在腎癌組織腎小管上皮細(xì)胞中高表達(dá)，推測人腎癌組織產(chǎn)生并釋放了HKIM-1，故其可作為腎細(xì)胞癌的標(biāo)志物。Park等[24]發(fā)現(xiàn)，EGFR、γ-干擾素、白細(xì)胞介素6、腫瘤壞死因子-α可作為多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤的血清標(biāo)志物。細(xì)胞因子也可作為衡量藥效的指標(biāo)。例如，DePrimo等[25]利用舒尼替尼治療腎細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移患者，發(fā)現(xiàn)給藥后，患者體內(nèi)VEGF、sVEGFR-2、sVEGFR-3表達(dá)量降低了20%～30%，從而認(rèn)為血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其相關(guān)蛋白可作為衡量舒尼替尼藥效的生物標(biāo)志物。

2.4 miRNA類腫瘤標(biāo)志物

MicroRNA（miRNA）是一類小分子非編碼RNA，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白合成，幾乎參與了調(diào)控細(xì)胞活動的各個環(huán)節(jié)。miRNA參與調(diào)控PI3K/Akt、NF-ΚB、MAPK、JAK/STAT3等多個腫瘤相關(guān)的信號通路（見圖1）[26]。

與腫瘤特異性相關(guān)的miRNA見表9[27]。

圖1 miRNA參與調(diào)控腫瘤相關(guān)信號通路的示意圖Figure 1 The schematic diagram of tumor-associated signal pathways mediated by miRNAs

表9 與腫瘤特異性相關(guān)的miRNATable 9 The miRNAs associated with tumor-specificity

miRNA可作為多種腫瘤的檢測或潛在診斷標(biāo)志物，以肝癌和宮頸癌為例，目前已發(fā)現(xiàn)在肝癌中表達(dá)水平上調(diào)的miRNA有miRNA-21、miRNA-34a、miRNA-221/222、miRNA-101和miRNA-224等；表達(dá)顯著下調(diào)的miRNA有miRNA-122、miRNA-145和miRNA-99a等[28]。miRNA表達(dá)譜在肝癌與肝膽管細(xì)胞癌之間存在明顯的差異。這些研究都表明miRNA可用于肝癌臨床表型的檢測或作為潛在的分子診斷標(biāo)志物[29]。與正常宮頸組織相比，宮頸癌組織中有97種miRNA表達(dá)上調(diào)，47種miRNA表達(dá)降低或沉默。Wang等[30]研究發(fā)現(xiàn)，miR21、miR24、miR27a和miR205在宮頸癌或?qū)m頸上皮內(nèi)發(fā)生癌變的細(xì)胞中的異常表達(dá)較為常見，提示miRNA可用于宮頸癌的診斷。

2.5 腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物

腫瘤干細(xì)胞（CSC/TSC）的概念于2001年被正式提出，其具有以下4個重要特征：1）自我更新的能力；2）多分化潛能；3）高增殖能力；4）耐藥性。除了與干細(xì)胞擁有許多共同的細(xì)胞表面抗原標(biāo)記外，腫瘤干細(xì)胞還有一些特異的細(xì)胞表面抗原標(biāo)記，這些表面標(biāo)記猶如腫瘤干細(xì)胞的“指紋”，可以通過識別和利用這些表面標(biāo)記來準(zhǔn)確地篩選與分離腫瘤干細(xì)胞；此外，這些標(biāo)記大多與惡性腫瘤中致癌、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)的標(biāo)記相似，證明腫瘤干細(xì)胞與腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)有關(guān)[31]。常見的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物見表10[32]。

表10 常見腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物Table 10 The common tumor stem cells markers

CD34抗原是一種階段特異性白細(xì)胞分化抗原，選擇性地表達(dá)于人類造血干細(xì)胞（human stem cells，HSC）、祖細(xì)胞（progenitor cell，PC）和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面。利用CD34抗體對腫瘤內(nèi)微血管密度（microvesseldensity，MVD）進(jìn)行免疫組化染色分析，可以估計腫瘤患者的預(yù)后，目前已應(yīng)用于乳腺、結(jié)腸、直腸、卵巢、肝臟、前列腺和膀胱等部位腫瘤的檢測[33]。

CD133蛋白是Miraglia等[34]于1997年發(fā)現(xiàn)的一種跨膜糖蛋白，最初被認(rèn)定為造血干細(xì)胞的特異性標(biāo)志，近年研究發(fā)現(xiàn)，CD133在白血病干細(xì)胞以及腦腫瘤干細(xì)胞、大腸癌干細(xì)胞、前列腺癌干細(xì)胞、肝癌干細(xì)胞等多種實(shí)體腫瘤干細(xì)胞中均有表達(dá)，提示CD133可能是腫瘤干細(xì)胞的一種廣譜標(biāo)志物，在腫瘤干細(xì)胞的分選和鑒定中具有一定的參考價值[35]。

3 腫瘤生物標(biāo)志物的篩選手段

目前腫瘤標(biāo)志物的檢驗(yàn)技術(shù)有三大類：生物化學(xué)方法、免疫學(xué)方法及分子生物學(xué)方法，其中免疫學(xué)方法在臨床中最常用，主要包括放射免疫測定（RIA）、酶聯(lián)免疫測定（ELISA）和免疫熒光測定（IFA）。此外，近年來雙向電泳（2-DE）、PCR、生物芯片、熒光原位雜交（FISH）、表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS）、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）等各項(xiàng)新技術(shù)發(fā)展迅猛，也逐漸應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)中，以下分類介紹腫瘤標(biāo)志物的篩選手段。

3.1 蛋白組學(xué)在腫瘤標(biāo)志物篩選中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)組（proteome）最早由澳大利亞Macquarie大學(xué)的WilkinsWilliams提出，其定義是指一個基因組、一個細(xì)胞或組織所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)以及它們的表達(dá)模式[36]。應(yīng)用雙向電泳聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)規(guī)模化地尋找多個與腫瘤相關(guān)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)群，并對其進(jìn)行定性、定量分析，從整體網(wǎng)絡(luò)水平了解細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可以提示腫瘤發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)腫瘤早期篩選檢測和治療的標(biāo)志物[37]。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在腫瘤研究方面已應(yīng)用于卵巢癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、肝癌、結(jié)直腸癌、白血病、胃癌、胰腺癌、腎癌、膀胱癌、骨癌、腦癌和喉癌等的臨床診斷研究[38]。

3.2 表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜在腫瘤標(biāo)志物篩選中的應(yīng)用

SELDI-TOF-MS的原理是利用激光脈沖輻射使芯池中的分析物解吸形成荷電離子，根據(jù)不同質(zhì)荷比，這些離子在儀器場中飛行的時間長短不一，由此繪制出一張質(zhì)譜圖。該圖經(jīng)計算機(jī)軟件處理還可形成模擬譜圖，同時直接顯示樣品中各種蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量、含量等信息[39]。若將它與常人或某種疾病病人的譜圖，甚至基因庫中的譜圖進(jìn)行對照，能夠從中發(fā)現(xiàn)和捕獲新的異性蛋白及其特征。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)為：待測樣本不需要特殊處理，可直接點(diǎn)樣檢測；用量小、檢測快速。其缺點(diǎn)是不能獲得差異蛋白質(zhì)的定性信息，同時實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性也會因人而異。Vlahou等[40]利用SELDI-TOF-MS技術(shù)檢測了來自轉(zhuǎn)移性膀胱癌病人的尿液，并將其與對照組（健康者的尿液）進(jìn)行了比較，結(jié)果在患者尿中檢測到新的蛋白質(zhì)峰，檢測率達(dá)到78%，與傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)方法檢測率（33%）相比有明顯提高，從而證明SELDI-TOF-MS技術(shù)可以有效地用于膀胱癌的早期診斷。SELDI-TOF-MS技術(shù)還可用于免疫測定法，在蛋白質(zhì)芯片上以特異抗體修飾，研究者由此可捕獲和檢測到特異的蛋白質(zhì)。

3.3 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜在腫瘤標(biāo)志物篩選中的應(yīng)用

MALDI-TOF-MS是近年發(fā)展起來的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，主要由兩部分組成：基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源（MALDI）和飛行時間質(zhì)量分析器（TOF）。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質(zhì)，形成共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過程。因此它是一種軟電離技術(shù)，適用于混合物及生物大分子的測定。劉麗華等[41]采用MALDI-TOF-MS技術(shù)檢測32例食管癌患者樣本和28例健康對照樣本的血清蛋白質(zhì)譜圖，經(jīng)數(shù)據(jù)分析找到44個有顯著性差異的質(zhì)荷比峰，篩選出6個蛋白質(zhì)峰并建立食管癌診斷預(yù)測模型，該診斷模型檢測食管癌的特異度88.9%，敏感度100%。

3.4 代謝組學(xué)在腫瘤標(biāo)志物篩選中的應(yīng)用

代謝組學(xué)（metabonomics）的概念最早于1999年由Nicholson等提出，是系統(tǒng)生物學(xué)中與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)并行存在的一種組學(xué)技術(shù)。代謝組學(xué)通過將模式識別方法和生物信息學(xué)聯(lián)合起來，對生物體內(nèi)小分子內(nèi)源性代謝產(chǎn)物進(jìn)行高通量的定性、定量分析，追蹤其在生物液體和組織內(nèi)的動態(tài)變化，可從整體分析基因調(diào)節(jié)、酶動力學(xué)、代謝反應(yīng)的介質(zhì)環(huán)境改變等因素對細(xì)胞狀態(tài)的影響。常用代謝組學(xué)分析方法的優(yōu)缺點(diǎn)如表11所示[42]。

表11 代謝組學(xué)主要分析方法的優(yōu)缺點(diǎn)Table 11 The advantages and disadvantages of the main metabolomics analysis methods

Sreekumar等[43]采用GC-MS和LC-MS相結(jié)合的方法分析了42例前列腺癌組織標(biāo)本以及相對應(yīng)的220例血、尿標(biāo)本中的1 126種代謝產(chǎn)物。通過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，與正常前列腺組織相比，60種代謝產(chǎn)物為原位和轉(zhuǎn)移的前列腺癌組織所特有，其中肌氨酸、尿嘧啶、犬尿氨酸、3-磷酸甘油、亮氨酸、脯氨酸隨疾病進(jìn)展在腫瘤原發(fā)部位和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位中呈逐漸增高趨勢。課題組進(jìn)一步結(jié)合分子生物學(xué)研究方法證實(shí)：肌氨酸能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的浸潤和遷移，可能為早期診斷前列腺癌的標(biāo)志物，提示預(yù)后不良。Feng等[44]對52例經(jīng)結(jié)腸鏡病理活檢證實(shí)的結(jié)腸癌（CRC）患者和62名健康受試者進(jìn)行尿液代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)假尿嘧啶核苷（Pseu）和1-甲基鳥苷（m1G）濃度在CRC組織中相對較高，與腫瘤大小和病理分期相關(guān)，且用于診斷CRC的敏感性高于CEA、CA19和CA125等傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物。MacIntyre等[45]采用1H-NMR為基礎(chǔ)的代謝組學(xué)方法對初發(fā)未治的、根據(jù)免疫球蛋白重鏈可變區(qū)（IgHV）突變位點(diǎn)進(jìn)行分期的29例慢性粒細(xì)胞白血?。–LL）患者的血清代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：與9例正常對照相比，CLL患者丙酮酸、谷氨酸濃度升高，異亮氨酸濃度降低；10例IgHV未突變患者較19例IgHV突變患者其膽固醇、乳酸、尿苷、延胡索酸水平升高，VitB6、甘油、甲硫氨酸水平降低，表明IgHV的突變位點(diǎn)與疾病相關(guān)代謝產(chǎn)物密切相關(guān)。由此可見，代謝組學(xué)技術(shù)可作為非侵入性檢測工具，用于腫瘤遺傳學(xué)標(biāo)志物的檢測。

4 結(jié)語

腫瘤標(biāo)志物因其在腫瘤早期診斷、預(yù)防、藥效評價、預(yù)后評價等方面發(fā)揮著極為重要的作用，現(xiàn)已成為21世紀(jì)腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。目前腫瘤標(biāo)志物存在的主要缺陷是：1）特異性和靈敏度不夠高，存在誤診或漏診的可能；2）檢測費(fèi)用偏高，聯(lián)合診斷在普通查體中難以普及；3）某些腫瘤的特異性標(biāo)志物仍不明確，難以在臨床中識別。未來腫瘤標(biāo)志物的發(fā)展方向是開發(fā)高特異性和高靈敏度的標(biāo)志物，針對各種腫瘤都能達(dá)到極高的早期診斷率，對各種化療及生物藥物的藥效及預(yù)后有著有效和準(zhǔn)確的評價，能夠準(zhǔn)確地預(yù)示腫瘤轉(zhuǎn)移病人的預(yù)后及生存期。未來腫瘤標(biāo)志物篩選技術(shù)的發(fā)展方向是高通量和高精確度。通過各種先進(jìn)的技術(shù)手段，找到針對某種腫瘤的特異性和靈敏度均很高的腫瘤標(biāo)志物，然后通過臨床驗(yàn)證，結(jié)合已有標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合診斷，提高聯(lián)合診斷的檢出率和準(zhǔn)確率。

目前腫瘤標(biāo)志物及其篩選正處于蓬勃發(fā)展階段?？梢韵嘈牛S著生物學(xué)及其相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，必將有更多更有效的腫瘤標(biāo)志物出現(xiàn)，并在腫瘤預(yù)防、診斷和預(yù)后中發(fā)揮重要的作用。

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[專家介紹]徐寒梅：教授，女，1966年出生，博士生導(dǎo)師，中國藥科大學(xué)海洋藥學(xué)教研室主任。海南省藥物研究所顧問，中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會海洋生物化學(xué)與分子生物學(xué)分會理事會理事，江蘇省生物化學(xué)協(xié)會理事。多年從事抗多肽藥物的研究，設(shè)計了抗腫瘤多肽安替安吉肽、AP25、EDSM等具有自主知識產(chǎn)權(quán)的分子，其中安替安吉肽具有安全性高、動物體內(nèi)活性顯著、不易引發(fā)耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已獲得1.1類化學(xué)新藥臨床批件。近5年在國內(nèi)外發(fā)表學(xué)術(shù)文章50余篇，其中SCI收錄20篇，主編及參編論著各一部，主編教材一部；申請發(fā)明專利共28項(xiàng)（其中國際專利8項(xiàng)）。近5年以來，先后主持了由國家自然科學(xué)基金、國家“863”高科技發(fā)展計劃、國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)等資助的項(xiàng)目。因與企業(yè)合作抗腫瘤多肽研究的卓著成果獲得內(nèi)蒙古自治區(qū)“杰出創(chuàng)新引進(jìn)人才”獎和“草原英才”；先后獲得江蘇省“青藍(lán)工程”優(yōu)秀骨干教師、中青年學(xué)術(shù)帶頭人、南京市領(lǐng)軍人才等獎勵和稱號；被內(nèi)蒙古自治區(qū)政府聘為科技特派員，被教育部“藍(lán)火工程”聘為泰州市科技特派員。

Advances in Research on Application of Tumor Markers and Their Screening Technique

LI Ce, NIE Caihui, ZHANG Lijun, XU Hanmei
(School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)

Tumor markers are a kind of substances bio-synthesized and secreted by gene expression of tumor cells, or abnormally generated and fluctuating due to body responses toward tumors. They play an important role in early detection, diagnosis and prognosis of tumors. With the development of biotechnology, the new tumor markers have been discovered continually, and the tumor marker screening techniques have been improved markedly. The new tumor markers and the related screening techniques have been summarized and introduced in this paper, so as to provide references for the clinical application and the further research of tumor markers.

tumor marker; combined diagnosis; detection technique; screening要作用。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，各種新型標(biāo)志物逐漸被發(fā)現(xiàn)，且特異性和靈敏度不斷提高，具有代表性的有癌基因、抑癌基因及其產(chǎn)物，腫瘤DNA，細(xì)胞因子及其受體，腫瘤miRNA和腫瘤干細(xì)胞等；腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合診斷技術(shù)也成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，針對不同腫瘤的多標(biāo)志物聯(lián)合診斷大大提高了腫瘤檢測的靈敏度。隨著蛋白組學(xué)和質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，腫瘤標(biāo)志物的篩選方法也出現(xiàn)了根本性的變革。本文對腫瘤標(biāo)志物及其篩選方法作一綜述，旨在為其深入研發(fā)提供參考。

R730.43

A

1001-5094（2014）01-0001-13

*接受日期：2013-11-21

徐寒梅，教授；

研究方向：多肽類藥物的研究與開發(fā)；

Tel：025-86185436；E-mail：13913925346@126.com