儲(chǔ)藏微環(huán)境下小麥胚細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化及衰老機(jī)制研究

王若蘭 張麗麗 曹志帥 王 晨

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，鄭州 450001）

近年來，糧食安全問題愈益受到重視。保障糧食安全，既要靠增加產(chǎn)量也要靠延緩糧食種子衰老，提高產(chǎn)后儲(chǔ)備質(zhì)量。目前關(guān)于種子衰老機(jī)制的研究尚未形成體系，存在多種假說，其中自由基傷害學(xué)說受到廣泛重視［1］。自由基是有氧代謝不可避免的產(chǎn)物［2］。Harman［3］和 Fridovich［4］提出的自由基理論，指出衰老過程是細(xì)胞和組織中不斷進(jìn)行著的自由基損傷反應(yīng)的總和。多項(xiàng)研究表明，種子衰老與細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷密切相關(guān)［5-6］。

國(guó)內(nèi)外針對(duì)糧食種子特別是小麥種子的儲(chǔ)藏衰老研究側(cè)重于生理生化方面，較少結(jié)合細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，在細(xì)胞水平上探究?jī)?chǔ)藏衰老機(jī)制。研究表明，小麥的胚乳細(xì)胞在小麥籽粒成熟后已被淀粉和貯藏蛋白充實(shí)而死亡，其主要生理功能是為胚活動(dòng)提供營(yíng)養(yǎng)，而小麥的胚細(xì)胞是小麥生理活性的集中體現(xiàn)［7］，胚細(xì)胞的衰老導(dǎo)致小麥生理活性的降低，進(jìn)而影響小麥衰老進(jìn)程。本試驗(yàn)基于衰老的自由基理論，通過研究不同儲(chǔ)藏微環(huán)境下小麥衰老和胚細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，探討小麥衰老與胚細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷之間的關(guān)系，以期進(jìn)一步豐富儲(chǔ)藏小麥的衰老機(jī)制研究，為延緩小麥衰老和安全儲(chǔ)藏提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

小麥“瑞星1號(hào)”，2012年收獲，河南瑞星種業(yè)公司提供，容重801 g／L，含水量11.4%，粗蛋白和濕面筋質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為13.82%和30.00%。

1.2 主要儀器

JEM-1400透射電子顯微鏡：日本電子公司；752N紫外分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；GL-20G-II高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；JXFM110錘式旋風(fēng)磨：上海嘉定糧油儀器有限公司；HWS恒溫恒濕培養(yǎng)箱：寧波東南儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 儲(chǔ)藏條件

根據(jù)我國(guó)糧食儲(chǔ)藏生態(tài)區(qū)域的劃分標(biāo)準(zhǔn)，模擬小麥主要儲(chǔ)藏區(qū)（主要為糧食儲(chǔ)藏生態(tài)區(qū)的蒙新區(qū)、華北區(qū)、華中區(qū)、華南區(qū)）的氣候條件，設(shè)置對(duì)應(yīng)的溫濕度分別為 A：（15℃，50%）、B：（20℃，65%）、C：（28℃，75%）、D：（35℃，85%）4個(gè)條件，利用恒溫恒濕箱進(jìn)行人工模擬儲(chǔ)藏（分別以A、B、C、D代表對(duì)應(yīng)的儲(chǔ)藏條件），每30 d為1個(gè)儲(chǔ)藏期，儲(chǔ)藏150 d。

1.3.2 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

根據(jù)參考文獻(xiàn)［8］的方法，并作修改。在室溫下，取小麥籽粒的胚放入4%的戊二醛溶液中4 h進(jìn)行前固定，之后用PH為7.2的磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗4次，每次15 min，再將其投入1%鋨酸溶液中90 min進(jìn)行后固定，并用 PBS漂洗3次，每次15 min；將樣品依次放入丙酮濃度梯度分別為30%、50%、70%、90%、100%的溶液中進(jìn)行逐級(jí)脫水，每次15 min；然后再依次置入環(huán)氧樹脂812與丙酮比例分別為1∶2、1∶1、2∶1、1∶0的混合液中進(jìn)行浸透處理，每次120 min。將浸透好的樣品依次放入37、45、60℃的鼓風(fēng)干燥箱中各加熱12 h，最后用LKB-Nova超薄切片機(jī)進(jìn)行切片，厚度為80 nm。再經(jīng)醋酸鈾染色25 min和檸檬鉛染色20 min后，在透射電鏡下觀察并拍照。

1.3.3 超氧陰離子自由基含量（O2-·）的測(cè)定

按照參考文獻(xiàn)［9］植物超氧陰離子自由基含量的測(cè)定方法并略加修改：植物樣品量改為2.5 g，離心的轉(zhuǎn)速改為12 000／min，其他方法不變。

1.3.4 丙二醛含量的測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)中的方法［10］，并修改如下：將小麥磨成粉，分別稱取小麥粉試樣（2.0±0.1）g并加入7 mL 10%的三氯乙酸（TCA）溶液，中速震蕩10 min后置于離心管中，以4 800 r／min的轉(zhuǎn)速離心10 min將上清液定容至10 mL，得到的即為丙二醛提取液。

1.3.5 種子活力的測(cè)定

采用 TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）法，按照文獻(xiàn)［9］的方法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥胚細(xì)胞中超氧陰離子自由基（O2·-）含量的變化

McDonald［11］和 Tian等［12］研究認(rèn)為，種子衰老與自由基代謝失調(diào)累積密不可分。由圖1可知，隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，小麥胚細(xì)胞中的O2-·含量整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。O2-·可引起細(xì)胞的氧化脅迫，而其含量的不斷積累會(huì)加劇細(xì)胞氧化損傷［11-12］。T檢驗(yàn)結(jié)果表明，儲(chǔ)藏90 d后O2-·含量已顯著高于前期（P＝0.02＜0.05），可能是儲(chǔ)藏后期胚細(xì)胞內(nèi)各項(xiàng)調(diào)控能力不斷減弱，線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，呼吸鏈的電子泄漏嚴(yán)重，使自由基得以快速積累［12］。

圖1 小麥細(xì)胞中O2·-含量的變化

不同的溫濕度條件對(duì)O2-·產(chǎn)生速率的影響各不相同。從圖1可明顯看出，在微環(huán)境A和B條件下，O2-·含量變化平緩，增幅小，分別只有19%、30%。而微環(huán)境C和D條件下的O2-·含量增幅較明顯，分別達(dá)到75%、124%，尤其在D條件下，O2·-含量水平顯著高于A條件（P＝0.011＜0.05）。這表明儲(chǔ)藏微環(huán)境的溫濕度是影響O2·-產(chǎn)生速率的重要因素。在正常情況下，細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，自由基濃度低，不會(huì)引起傷害，而在高溫高濕逆境條件下，這種平衡更易遭到破壞，自由基代謝失調(diào)，使得細(xì)胞內(nèi)基態(tài)分子氧單電子還原的效率增高，產(chǎn)生的O2·-速率增大［12］，細(xì)胞衰老加快。

2.2 小麥胚細(xì)胞中丙二醛含量的變化

Sung［13］和 Bailly［14］提出自由基積累導(dǎo)致膜的氧化是種子衰老的主要原因。丙二醛（MDA）是細(xì)胞膜脂過氧化作用的最重要產(chǎn)物之一，它的生成和積累會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的交聯(lián)聚合，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。

圖2 小麥細(xì)胞MDA含量的變化

由圖2可看出，與O2-·相似，小麥胚細(xì)胞的MDA含量隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)也呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，并且經(jīng)T檢驗(yàn)，儲(chǔ)藏90 d后，MDA含量的變化幅度同樣明顯大于前期（P＝0.011＜0.05）。不同的溫濕度條件下，小麥胚細(xì)胞MDA含量的變化差異也較大。在A、B、C、D條件下，MDA含量由1.23分別增加到1.39、1.41、1.73、2.02（10-3umol／g），增加幅度分別達(dá)到8%、8.2%、148%、172%。由此可見，C和D條件下的小麥總是比A和B條件下的小麥胚細(xì)胞MDA含量增加得更明顯。尤其在D條件下，MDA含量顯著高于A條件（P＝0.045＜0.05），說明高溫高濕環(huán)境易促進(jìn)細(xì)胞膜脂過氧化，從而導(dǎo)致有毒產(chǎn)物快速積累，且隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，膜脂過氧化作用不斷加劇。

分析可知，小麥胚細(xì)胞中O2-·和MDA含量的變化存在一定的關(guān)聯(lián)性，首先細(xì)胞中積累的自由基氧化攻擊膜脂中的不飽和雙鏈酸，誘發(fā)細(xì)胞膜脂過氧化，進(jìn)而導(dǎo)致脂類本身被破壞，再經(jīng)過一系列復(fù)雜反應(yīng)產(chǎn)生MDA等有毒產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，致使細(xì)胞衰老甚至死亡。

2.3 小麥種子活力的變化

種子活力是種子品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。種子在儲(chǔ)藏過程中受儲(chǔ)藏條件的不利影響，胚細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和生理功能受到損害而逐漸衰老，導(dǎo)致種子活力下降，種子衰老甚至劣變［15］。由圖3可看出，隨儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，小麥種子活力整體呈下降趨勢(shì)，高溫高濕（C和D）條件下，活力下降最明顯，尤其D條件下的種子活力由96%降至21%，降幅顯著高于A和B條件（P＜0.05）。這表明，高溫高濕條件對(duì)小麥種子活力的影響顯著，小麥衰老速度較快。因此儲(chǔ)藏微環(huán)境的溫濕度是影響小麥安全儲(chǔ)藏的主要調(diào)控因素。

圖3 小麥種子活力的變化

2.4 小麥細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化

從圖4可觀察到，原始小麥胚細(xì)胞形態(tài)及各細(xì)胞器正常，顯示出良好的結(jié)構(gòu)和功能。細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致密，可清楚看到纖維素微纖絲，細(xì)胞膜平整光滑（圖4d）；細(xì)胞基質(zhì)致密均勻；細(xì)胞核占據(jù)細(xì)胞的較大空間，核膜、核仁清晰可辨，核質(zhì)均勻，著色較淡，常染色質(zhì)較異染色質(zhì)豐富（圖4a），說明核內(nèi)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)大部分處于松弛狀態(tài)，核酸在此期經(jīng)歷著活躍的轉(zhuǎn)錄和合成代謝；線粒體數(shù)量豐富，呈比較規(guī)則的圓形或卵圓形，雙層被膜結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)膜的脊密集清晰（圖4a，圖4b），說明細(xì)胞正在進(jìn)行著旺盛的能量代謝；細(xì)胞內(nèi)蛋白體充盈，呈現(xiàn)規(guī)則的球形，大小不等；脂肪體豐富，并均勻分布在細(xì)胞膜和蛋白體附近（圖4d）。在胞間質(zhì)中還可觀察到大量的胞間連絲和成列的小囊泡（圖4b，圖4c），可以認(rèn)為小囊泡此時(shí)正在執(zhí)行它的胞間物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)傳遞功能，張偉成等［16］稱此現(xiàn)象為跨膜囊泡轉(zhuǎn)移。由圖4d可清晰地看到在細(xì)胞壁上附著有豐富的Ca2+，Ca2+可與細(xì)胞壁的果膠質(zhì)結(jié)合，豐富的Ca2+有助于延緩胚細(xì)胞衰老，提高種子活力，進(jìn)而提高儲(chǔ)藏品質(zhì)。

圖4 原始小麥細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

對(duì)比圖5～圖7可看出，在不同的溫濕度條件下，經(jīng)過150 d的儲(chǔ)藏，小麥的胚細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)都發(fā)生了不同程度的變化。在A條件下的小麥胚細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)與原始小麥相比無明顯變化，細(xì)胞及內(nèi)部各細(xì)胞器均保持較良好的結(jié)構(gòu)，多數(shù)細(xì)胞的核染色質(zhì)出現(xiàn)輕度的凝聚，說明低溫下核酸代謝并不旺盛，小麥胚細(xì)胞多處于相對(duì)靜止的狀態(tài)（圖5a，圖5b）。在B條件下的小麥胚細(xì)胞與原始小麥相比出現(xiàn)了一定的變化，主要表現(xiàn)為：細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚稍有加重；線粒體內(nèi)膜脊的數(shù)量有所減少，脊的雙層膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)模糊。線粒體是細(xì)胞能量代謝的主體，也是自由基產(chǎn)生的主要部位［11］，其結(jié)構(gòu)的損傷將直接影響細(xì)胞的能量代謝和自由基水平（圖5c、圖5d）。

圖5 A、B條件下儲(chǔ)藏150 d后的小麥胚細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

在C條件下的小麥胚細(xì)胞與原始小麥相比發(fā)生了較明顯的變化。首先，細(xì)胞壁開始出現(xiàn)輕度溶解，少部分細(xì)胞膜輕度內(nèi)陷，膜的完整性遭到破壞，并且?guī)缀跽也坏紺a2+的存在。其次，細(xì)胞核質(zhì)不均勻，異染色質(zhì)凝聚加重，多成片狀（圖6a），說明此時(shí)細(xì)胞的核酸代謝減弱了。完整線粒體數(shù)目減少，線粒體變化出現(xiàn)2種情況，一種是線粒體外膜破損，內(nèi)膜的脊出現(xiàn)不同程度的解體而變得模糊，內(nèi)腔出現(xiàn)空泡化。另一種是線粒體外膜完整，但出現(xiàn)內(nèi)陷變形，沒有空泡化（圖6b、圖6c），說明此時(shí)細(xì)胞的能量代謝也在降低，而自由基正在快速積累。此外蛋白體和脂肪體也出現(xiàn)了不同程度的降解，數(shù)量減少，這可能與細(xì)胞的耗能代謝有關(guān)，蛋白體和脂肪體分解可為細(xì)胞供能（圖6c）。

圖6 C條件下儲(chǔ)藏150 d后的小麥胚細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

在D條件下的小麥胚細(xì)胞與原始小麥相比，變化最為顯著。大部分細(xì)胞形態(tài)已出現(xiàn)變形，細(xì)胞壁纖維絲模糊不清，部分膜內(nèi)陷破裂，膜的完整性幾近喪失，已經(jīng)看不到Ca2+；細(xì)胞核質(zhì)著色加深，異染色質(zhì)充滿整個(gè)細(xì)胞核，核仁分裂為多個(gè)小核仁，少部分細(xì)胞的核仁已溶解不見；線粒體數(shù)量明顯減少，大部分線粒體內(nèi)部降解嚴(yán)重，脊的雙層膜已無法辨認(rèn)，有的線粒體甚至已完全空泡化。蛋白體也嚴(yán)重降解，有的已瀕臨解體，圍繞其周邊的脂肪體數(shù)量也明顯減少（圖7）。在細(xì)胞間質(zhì)中幾乎看不到胞間連絲以及成列的小囊泡。說明此時(shí)胚細(xì)胞中的核酸代謝，能量代謝，物質(zhì)代謝以及信息傳遞等已不能正常進(jìn)行，胚細(xì)胞衰老嚴(yán)重。

圖7 D條件下儲(chǔ)藏150 d后的小麥胚細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

以上分析均顯示出，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，小麥胚細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)在不斷發(fā)生劣變。并隨儲(chǔ)藏溫濕度的增大，劣變?cè)节厙?yán)重，胚細(xì)胞衰老加快。這一變化與胚細(xì)胞中O2-·和MDA含量以及種子活力的變化規(guī)律保持高度一致，表明小麥胚細(xì)胞的損傷劣變和衰老與O2-·、MDA的產(chǎn)生和積累存在著一定的相關(guān)性，胚細(xì)胞的衰老導(dǎo)致小麥種子活力下降，進(jìn)而加快小麥衰老進(jìn)程。

多項(xiàng)研究認(rèn)為，O2-·積累引起細(xì)胞氧化損傷是種子衰老的關(guān)鍵［4，10-11］。這一理論也較符合小麥的衰老進(jìn)程。低溫低濕環(huán)境下，O2-·和MDA含量保持在較低的水平，胚細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)較良好，細(xì)胞內(nèi)的各項(xiàng)代謝基本處于平衡狀態(tài)。小麥在受到高溫高濕的逆境脅迫時(shí)，胚細(xì)胞內(nèi)的O2-·代謝失調(diào)，不斷積累的O2-·加大了對(duì)胚細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等大分子的損害，使細(xì)胞內(nèi)的有毒產(chǎn)物不斷積累，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)上的氧化損傷也隨之發(fā)生，破壞了細(xì)胞進(jìn)行正常生命活動(dòng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，降低了細(xì)胞的活力，同時(shí)也減弱了細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)對(duì)O2-·的清除水平，而這又會(huì)進(jìn)一步加快O2-·的產(chǎn)生，致使其產(chǎn)生和清除的平衡不斷被打破，形成一個(gè)惡性循環(huán)，加速了胚細(xì)胞的衰老進(jìn)程，種子活力快速下降，從而加重了小麥的衰老。因此在小麥儲(chǔ)藏過程中，采用低溫低濕環(huán)境，易于減緩小麥的衰老，保持小麥的品質(zhì)。

3 結(jié)論

隨儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)和溫濕度的增高，小麥胚細(xì)胞中的O2·-和MDA含量不斷增加。與此同時(shí)胚細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)都發(fā)生了不同程度的損傷劣變，且溫濕度越高，劣變?cè)絿?yán)重，種子活力下降越明顯，種子衰老越快。低溫低濕（A和B）的條件下，胚細(xì)胞中的O2·-和MDA含量均保持在較低的水平，胚細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化均不明顯，種子活力較高；高溫高濕C和D條件下，O2·-和MDA含量快速增加，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了較明顯的劣變。在C條件下，部分細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，染色質(zhì)凝聚加重，線粒體數(shù)目減少，內(nèi)外膜出現(xiàn)損傷，而小麥種子活力也出現(xiàn)了較明顯的下降；在D條件下，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)劣變更加嚴(yán)重：大部分細(xì)胞形態(tài)已變形，細(xì)胞膜完整性幾近喪失；異染色質(zhì)充滿整個(gè)細(xì)胞核，核仁分裂甚至溶解；線粒體明顯減少，內(nèi)部降解嚴(yán)重甚至已完全空泡化；貯藏物質(zhì)解體，幾乎找不到執(zhí)行胞間物質(zhì)運(yùn)輸及信號(hào)傳遞的小囊泡。此時(shí)小麥胚細(xì)胞的O2·-和MDA含量增加最明顯，增幅分別達(dá)到124%、172%，而種子活力下降也最明顯，降幅達(dá)到75%，三者變化幅度都顯著高于低溫低濕（A和B）條件（P＜0.05）。

小麥儲(chǔ)藏過程中自由基的產(chǎn)生、有毒物質(zhì)的積累和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷三者之間相互關(guān)聯(lián)，促使細(xì)胞衰老，降低種子活力，進(jìn)而影響種子衰老進(jìn)程。儲(chǔ)藏微環(huán)境中的溫濕度是影響小麥細(xì)胞衰老進(jìn)程的重要因素，高溫高濕環(huán)境易加速細(xì)胞衰老，而低溫低濕環(huán)境利于延緩衰老，保藏小麥品質(zhì)。

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