響應(yīng)面法優(yōu)化β-環(huán)糊精脫除鴨蛋黃油脂膽固醇工藝條件

李 永 陳有亮 任大喜

（浙江大學動物科學學院，杭州 310058）

蛋黃油脂是從蛋黃中提取的脂質(zhì)，因提取方法不同成分有較大差異，但含有豐富的卵磷脂、不飽和脂肪酸是其主要特征。具有調(diào)節(jié)血脂，改善神經(jīng)功能等多種生理功能，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥領(lǐng)域［1］。但因蛋黃膽固醇含量過高，制取的蛋黃油脂同樣膽固醇含量很高。而攝入高膽固醇食品會造成血清膽固醇升高，引發(fā)心血管疾?。?］，低膽固醇食品的膳食成為人們的首選。因此，設(shè)法脫除食品中的膽固醇成了研究的熱點。

β-環(huán)糊精（β-cyclodextrin，簡稱 β-CD）是由7個吡喃葡萄糖單元以α-（1，4）-糖苷鍵連接而成的環(huán)狀低聚物，作為食品添加劑廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)［3］，可脫除膽固醇，防止微生物污染和褐變反應(yīng)［4］，保持香味，消除不良氣味［5］。

目前國內(nèi)外對生產(chǎn)低膽固醇食品研究主要集中在用膽固醇氧化酶降解，乳酸菌發(fā)酵，β-CD包合以及納濾、萃取、溶劑抽提等物理化學方法脫除膽固醇［6-7］。然而，與其他脫除膽固醇工藝相比，β-CD包合法具有脫除效率高、工藝簡單可行的優(yōu)點［8］。

通過β-CD包合法脫除動物性產(chǎn)品中的膽固醇已有大量研究［9-15］。在美國利用β-CD制造的低膽固醇蛋品早已進入市場［16］。在國內(nèi)β-CD包合法制造低膽固醇蛋黃的研究大部分集中在直接從蛋黃液中脫除膽固醇，結(jié)果會造成蛋黃中蛋白質(zhì)、磷脂等營養(yǎng)物質(zhì)的部分損失［17］，但是β-CD包合法脫除蛋黃油膽固醇的研究國內(nèi)外鮮有報道。本試驗利用響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化了β-CD脫除鴨蛋黃油脂膽固醇。通過優(yōu)化工藝參數(shù)，提高膽固醇脫除率和油脂回收率，為工業(yè)化生產(chǎn)低膽固醇蛋黃油脂提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

β-CD：孟州市華興生物化工有限責任公司。

TG16-WS臺式高速離心機：湘儀離心機儀器有限公司；721N可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；JHS-1電子恒速攪拌機：杭州儀表電機有限公司；SY-6000小型噴霧干燥儀：上海世遠生物設(shè)備有限公司；R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司。

鴨蛋黃油脂：新鮮鴨蛋黃與水按1∶1.5（體積比）混合，2層紗布過濾除去系帶、蛋黃膜后，以進口溫度165℃，出口溫度82℃，進行噴霧干燥制得蛋黃粉。然后將一定質(zhì)量的蛋黃粉與乙酸乙酯按1∶12（m∶V）混勻，35℃回流提取60 min。提取完畢，真空抽濾、取濾液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，得到鴨蛋黃油脂（主要成分為三酰甘油和膽固醇，其中膽固醇含量為 51.47 mg／g，三酰甘油含量為 948.53 mg／g）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計

采用響應(yīng)曲面設(shè)計，進行試驗條件的優(yōu)化。選用五因素五水平中心組合設(shè)計確定5個處理因素對膽固醇脫除率（Y1）和蛋黃油脂回收率（Y2）的影響。基于前期初步試驗研究，選取水油比（W∶O）、β-CD與油之比（β-CD∶O）、時間、溫度、攪拌速度5個因素。試驗因素水平及編碼見表1，響應(yīng)曲面設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 因素水平編碼表

表2 響應(yīng)曲面設(shè)計及結(jié)果

表2 （續(xù)）

1.2.2 試驗步驟

取一定質(zhì)量鴨蛋黃油脂，將不同質(zhì)量濃度的β-CD溶液與蛋黃油脂混勻。在不同的水浴溫度和時間下，用恒速攪拌機以不同的攪拌速度攪拌。然后6 000 r／min，5 min離心處理，上清液即為低膽固醇蛋黃油脂。取上清液測定膽固醇含量，計算膽固醇脫除率見式（1）；同時稱量上清液質(zhì)量，計算蛋黃油脂回收率見式（2）；回收中間層膽固醇-β-CD復合物。

式中：W1為原蛋黃油脂膽固醇含量／mg／g；W2為上清液膽固醇含量／mg／g。

式中：m1為上清液油脂質(zhì)量／g；m2為原油脂質(zhì)量／g。

1.2.3 膽固醇含量測定

采用直接皂化法測膽固醇含量［18］，并做適當改進。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Design-Expert.V8.0.6軟件中的Central Composite Design進行試驗設(shè)計，建立回歸模型及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 膽固醇脫除率（Y1）響應(yīng)面分析

2.1.1 回歸模型建立及顯著性檢驗

對表2結(jié)果進行回歸分析，擬合的膽固醇脫除率（Y1）對 W∶O（X1），β-CD∶O（X2），時間（X3），溫度（X4），攪拌速度（X5）的二次回歸方程為：

從表3知，失擬檢驗不顯著（F1＝2.56，P＝0.102 7），模型合適，說明該方程與實際情況擬合良好。方差分析結(jié)果表明二次回歸方程極顯著（P＜0.000 1），同時也說明不必擬合更高次冪的方程。

為了分析各因子對回歸方程的影響，對偏回歸系數(shù)進行分析（表3），X2、X4對蛋黃油脂膽固醇脫除率有極顯著影響（P＜0．01），而 X1、X3、X5無顯著影響（P＞0．05），但是 X1X3、X3X5的交互效應(yīng)對膽固醇脫除率有顯著影響（P＜0．01）。X12、X5

2也是顯著項（P＜0．01），同時需要指出的是 X52的二次項的F值比其他項都大，表明攪拌速度的二次回歸效應(yīng)作用最大。

表3 二次回歸方程、偏回歸系數(shù)顯著性檢驗的方差分析

2.1.2 單因子及交互效應(yīng)分析

由表3可知，5個因素對膽固醇脫除率（Y1）的影響順序為：溫度 ＞β-CD∶O＞時間 ＞攪拌速度 ＞W(wǎng)∶O。圖1a反應(yīng)了當某個因子變動，而其他因子保持不變時對膽固醇脫除率的影響［19］。W∶O（A）、時間（C）、攪拌速度（E）的編碼值增大時膽固醇脫除率先增大后降低。β-CD∶O（B）在-1～+1的整個編碼區(qū)內(nèi)變化時，膽固醇脫除率一直在增大。溫度（D）在編碼區(qū)-1～+1內(nèi)升高時，膽固醇脫除率呈線性降低；在所有因素中，溫度對二次回歸方程的直線效應(yīng)最顯著。

圖2a可知，在W∶O的整個編碼區(qū)內(nèi)，隨攪拌時間的延長，膽固醇脫除率先增大后減小；而攪拌時間固定某一值后，膽固醇脫除率也隨W∶O增大先增大后減小，說明加水必須適量，太多的水反而會使油脂中膽固醇稀釋，不利于膽固醇與β-CD的接觸形成包合物。只有W∶O和攪拌時間同時增大到一定程度時膽固醇脫除率才能達到最大，二者的交互效應(yīng)表現(xiàn)為膽固醇脫除率的增大。

圖2b可知，當時間保持不變，隨攪拌速度增大，膽固醇脫除率先增大后減小；在較低轉(zhuǎn)速時，延長攪拌時間，膽固醇脫除率升高，當攪拌速度較快時，膽固醇脫除率隨時間延長先增大后減小。這表明只有適中的攪拌速度和時間才能獲得較大的膽固醇脫除率，攪拌速度過高過低都不利于脫除膽固醇。同時需要指出的是X3X5的系數(shù)交互項是負值（-0.90），只考慮此交互效應(yīng)的話，負值表明隨響應(yīng)值Y1增加，攪拌速度X5和時間X3的編碼值需有不同的符號，即，一個必須大于零，另一個必須小于零［20］。即，當 Y1達到最佳值時，（X3，X5）＝（0.987，-0.639）。

圖1 單因子效應(yīng)圖

圖2 膽固醇脫除率響應(yīng)曲面圖

2.2 蛋黃油脂回收率（Y2）響應(yīng)面分析

2.2.1 建立回歸模型及顯著性檢驗

對蛋黃油脂回收率（Y2）先建立一個二次回歸模型。由表4可知，二次回歸方程模型顯著（F2＝2.65，P＝0.008 3＜0.05），但是失擬檢驗也顯著（F1＝8.43，P＝0.003 8＜0.05），說明二次回歸模型雖然有意義但其在整個回歸空間內(nèi)的擬合度并不是很好，需要擬合更高次的回歸模型，即建立非標準模型。因每個因素都有5個水平，因此模型中可以包含四次項，選用逐步篩選法（αin＝αout＝0.10）對變量進行篩選，通過計算機生成設(shè)計來找出一個更好的模型［19］。

表4 二次回歸方程顯著性檢驗的方差分析

表5是新建的四次回歸模型的方差分析，可以看出對油脂回收率（Y2）建立的四次回歸模型明顯要優(yōu)于二次回歸模型［19］，有更大的 R2（0.973 9＞0.646 4），更小的變異系數(shù)（3.71% ＜10.48%）；且失擬檢驗不顯著（F1＝0.72，P＝0.692 9），回歸模型極顯著（F2＝19.85，P＜0.000 1）。

表5 通過變量篩選的四次回歸模型、偏回歸系數(shù)顯著性檢驗的方差分析

2.2.2 單因子及兩因子交互效應(yīng)分析

由表5可知，建立的蛋黃油脂回收率（Y2）四次回歸模型中 X1、X3、X4、X5、X1X2、X1X3、X1X4、X3X4、X3X5、X22、X52、X1X2X3、X1X2X4、X1X3X4、X1X3X5、X2X4X5、X12X4、X12X5、X1X22、X12X22是顯著項（P＜0.05）。各因子對蛋黃油脂回收率影響順序為：攪拌時間＞W(wǎng)∶O＞攪拌速度＞溫度＞β-CD∶O。相對于其他兩因子的交互效應(yīng)，W∶O與溫度、W∶O與β-CD∶O之間的交互效應(yīng)對蛋黃油脂回收率的影響更大。

從圖1b可知，W∶O（A）、溫度（D）、時間（C）在編碼區(qū)-1～+1內(nèi)增大時，蛋黃油脂回收率呈線性降低。β-CD∶O（B）在編碼區(qū)域內(nèi)，蛋黃油脂回收率隨編碼值增大先增加后下降。攪拌速度（E）的編碼值小于-0.862時，蛋黃油脂回收率隨編碼值增大而增加，隨后緩慢降低，當編碼值大于0.00時，蛋黃油脂回收率迅速下降。

將其他因素固定在中心點時，得到另外兩因素對油脂回收率的響應(yīng)曲面圖（圖3a～圖3d）。較高的W∶O會降低油脂回收率（圖3a），因為較高的W∶O會降低蛋黃油黏度，在離心分離時有助于小顆粒的沉淀，因此回收率降低。

圖3 油脂回收率響應(yīng)曲面圖

2.3 優(yōu)化組合試驗條件及驗證試驗分析

以膽固醇脫除率為響應(yīng)值，利用Design-Expert8.0.6對試驗數(shù)據(jù)進行分析，當（X1，X2，X3，X4，X5）＝（0.865，0.904，0.966，-0.962，-0.362），即實際值為：W∶O＝1.55，β-CD∶O＝0.295，時間24.83 min，溫度10.19℃，攪拌速度963.80 r／min時膽固醇脫除率理論值為73.30%。

以蛋黃油回收率為響應(yīng)值時，當（X1，X2，X3，X4，X5）＝（-1.000，-0.058，-0.997，1.000，-0.750），即，在 W∶O＝0.80，β-CD∶O＝0.247，時間15.02 min，溫度20.00℃，攪拌速度924.99 r／min的條件下，蛋黃油回收率理論可達77.39%。

為了獲得滿意的綜合效果，使得膽固醇脫除率和蛋黃油脂回收率兩響應(yīng)值都達到最大，將二者作為共同考察指標——渴求值（Desirability），通過渴求函數(shù)（Desirability Function）的響應(yīng)曲面圖、等高線圖優(yōu)化膽固醇脫除率和油脂回收率［5］，從而確定最佳工藝參數(shù)。響應(yīng)曲面可以直接反映各試驗因子對響應(yīng)值影響的大小，由等高線圖可得到最佳條件下各試驗因子的取值［21］。

將其他因子固定在最佳點處，W∶O和時間對渴求值的影響見圖4b，優(yōu)化的時間范圍為19～23 min，W∶O范圍為1.4～1.5。并且從圖4a可知在時間的所有水平內(nèi)，W∶O對渴求值的影響更大，W∶O超過1.45后渴求值降低。在低W∶O值時，時間變化對渴求值影響不大，W∶O值較高處，渴求值隨時間延長先增大后減小。W∶O、β-CD∶O、攪拌溫度固定在最佳點時，渴求值的響應(yīng)曲面及等高線圖見圖5a～圖5b。在時間的所有水平上隨攪拌速度增大渴求值先增大后減小，優(yōu)化的攪拌速度范圍950～1 000 r／min。利用同樣的方法可以分析其他因子交互效應(yīng)對渴求值的影響。

渴求函數(shù)獲得最大渴求值時最佳工藝參數(shù)編碼值為（X1，X2，X3，X4，X5）＝（0.627，1.000，0.367，-1.000，-0.242），實際條件為 W∶O＝1.45，β-CD∶O＝0.30，時間21.83 min，溫度10℃，攪拌速度975.83 r／min。在此條件下，預(yù)測渴求值為0.752，膽固醇脫除率 Y1＝72.65%，蛋黃油回收率 Y2＝68.33%。

對優(yōu)化后最佳工藝條件A1（W∶O＝1.45，β-CD∶O＝0.30，時間21.83 min，溫度10℃，攪拌速度975.83 r／min）；膽固醇脫除率最高點 A2（W∶O＝1.55，β-CD∶O＝0.295，時間24.83 min，溫度10.19℃，攪拌速度963.80 r／min）；蛋黃油回收率最高點A3（W∶O＝0.80，β-CD∶O＝0.247，時間 15.02 min，溫度20℃，攪拌速度924.99 r／min），3處不同的處理條件下的驗證試驗結(jié)果見表6。在優(yōu)化的最佳工藝條件下鴨蛋黃油脂膽固醇含量由51.47 mg／g降到15.33 mg／g，膽固醇脫除率達70.21%，蛋黃油回收率為68.7%，與理論預(yù)測值接近。驗證了模型的可靠性，同時也說明β-CD脫除蛋黃油脂膽固醇影響因素較多，工藝參數(shù)的變化會同時影響膽固醇脫除率和油脂回收率，2個指標需合理權(quán)衡。

圖5 時間和攪拌速度的交互效應(yīng)影響渴求值的響應(yīng)曲面和等高線圖

表6 驗證試驗

3 結(jié)論

各因子對膽固醇脫除率的影響順序為：溫度＞β-CD∶O＞時間＞攪拌速度＞W(wǎng)∶O；對蛋黃油脂回收率影響順序為：時間＞W(wǎng)∶O＞攪拌速度＞溫度＞β-CD∶O。

通過對擬合的回歸方程中回歸系數(shù)的顯著性檢驗發(fā)現(xiàn)，一次項溫度及W∶O與時間、時間與攪拌速度的交互效應(yīng)對蛋黃油脂膽固醇脫除率和油脂回收率都有顯著影響（P＜0.01）；W∶O與 β-CD∶O、W∶O與攪拌溫度、時間與攪拌溫度的交互效應(yīng)雖對膽固醇脫除率影響不顯著（P＞0.05），但對蛋黃油脂回收率有顯著影響（P＜0.01）。

利用渴求函數(shù)的響應(yīng)曲面圖、等高線圖優(yōu)化膽固醇脫除率和蛋黃油脂回收率，確定了最佳工藝條件：W∶O＝1.45（V／m），β-CD∶O＝0.30（m／m），時間21.83 min，溫度 10℃，攪拌速度 975.83 r／min。該條件下，預(yù)測渴求值為0.752，膽固醇脫除率理論達72.48%，蛋黃油脂回收率為68.05%；驗證試驗中鴨蛋黃油脂膽固醇含量由51.47 mg／g降到15.33 mg／g，膽固醇脫除率為 70.21%，油脂回收率為68.70%。

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