前列腺癌膜聯(lián)蛋白Ⅱ微衛(wèi)星不穩(wěn)定的熒光復(fù)合擴增研究

蔡曉健 ,丁 濤 ,段友軍 ,黃振國 ,劉志文 ,王 豪 ,劉未斌 ,許韓峰

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科,湖南衡陽421001;2.廣州九賢林生物公司,廣州510000;3.上海市第十醫(yī)院泌尿外科,上海200072)

前列腺癌(prostate cancer,PC)為歐美男性發(fā)病率最高的惡性腫瘤,死亡率僅次于肺癌[1]。北京市男性前列腺癌發(fā)病率由2001年的5.53/10萬上升至2010年的16.62/10萬,9年增長200.5%[2]。目前,前列腺癌的病因可能與高脂飲食、環(huán)境、性激素等因素有關(guān)[3-4]。前列腺癌早期癥狀多不明顯,與前列腺良性增生癥的表現(xiàn)相似,容易被誤診延誤治療時機,約有20% ～30%的患者在初診時已有轉(zhuǎn)移。早期局限性前列腺癌治療效果良好,轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者不僅效果差而且生存率低[5-6],其發(fā)病和轉(zhuǎn)移的分子機制還不清楚,尋找早期前列腺癌的生物標記物對于前列腺癌診斷和治療具有重要意義。

膜聯(lián)蛋白Ⅱ?qū)儆谀ぢ?lián)蛋白家族中的一員,又名膜聯(lián)蛋白A2(annexinA2,ANXA2)、P36等,人的該基因定位于15q21-q22,含13個外顯子[7],膜聯(lián)蛋白Ⅱ表達水平及分布的變化和很多疾病的發(fā)生相關(guān),現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)在急性早幼粒細胞白血病、食管鱗癌、肝癌、肺癌等細胞組織中膜聯(lián)蛋白Ⅱ的mRNA和蛋白均呈異常表達,且與腫瘤細胞的分化程度密切有關(guān)[8-9]。

熒光復(fù)合擴增多重PCR是基于測序儀毛細管電泳,使用多色熒光染料標記不同的引物,在一個PCR管內(nèi)進行多個基因的擴增,激光器激發(fā)染料發(fā)光,在通過毛細管視窗檢測,CCD收集信號,軟件分析讀取,檢測的大小非常精確精準,在人類STR檢測,癌癥的微衛(wèi)星不穩(wěn)定有著廣泛的應(yīng)用[10-12]。

本研究使用熒光復(fù)合擴增的方法對前列腺癌組織、良性前列腺增生組織及正常人血樣中的膜聯(lián)蛋白Ⅱ的基因座D15S1185,D15S1292以及本研究尋找到二核苷酸重復(fù)序列微衛(wèi)星基因座AN2-di-repeat-NH進行擴增,探討此復(fù)合擴增方法的可行性,并對比樣本組織之間PCR產(chǎn)物的差異。

1 材料與方法

1.1 樣本

前列腺癌組織切片、良性前列腺增生組織切片和正常人血樣各16份。所有樣本均來自南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿科住院病人,該項研究得到本院倫理學(xué)委員會批準。

1.2 主要儀器和試劑

PE9700型DNA擴增(PEKIN-ELMER公司);ABI3130XL遺傳分析儀(ABI公司);2k-15型冷凍離心機(Sigma公司);微量移液器(芬蘭Themeo公司);Mulli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore公司)。熱啟動酶、復(fù)合擴增Master mix、納米磁珠DNA提取試劑盒均購買自廣州九賢林生物科技有限公司;熒光引物合成自Takara公司;Chelex-100樹脂購買自Bioroad公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 使用棉簽將前列腺癌癥石蠟組織切片及一般前列腺疾病石蠟組織切片上的組織轉(zhuǎn)移到棉簽上,使用試劑盒自帶的裂解液,補加蛋白酶K使終濃度為1 mg/mL,56℃孵育過夜。去除棉簽,加入3倍體積的結(jié)合液,95℃孵育15 min,加入20 μL的納米磁珠,室溫孵育5 min。置于磁力架上,吸附磁珠。棄去液體,再加入200 μL的結(jié)合液,漂洗一遍磁珠。加入洗滌液洗滌磁珠兩遍,56℃孵育5 min。加入50 μL洗脫液,56℃孵育10 min,置于磁力架上,吸取上清轉(zhuǎn)移至新的薄壁管中,得到提取好的DNA。血樣樣本DNA提取使用Chelex-100的方法提取DNA[9]。

1.3.2 引物設(shè)計 在Genebank上調(diào)取Annexin A2的序列定位于人類15號染色體上,同時在NCBI上在UniSTS下搜索annexin A2,選取其中定位于人類15號染色體上,選取其中命名ANXA2的基因座D15S1185(GeneBank登錄號：G07155.1),以及D15S1292(GeneBank登錄號：G15634.1),使用軟件在兩個基因座附近尋找二核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星序列,在側(cè)翼設(shè)計引物,命名為AN2-di-repeat-NH。引物序列見表1。

表1 基因座復(fù)合擴增引物序列

1.3.3 引物的熒光標記及PCR反應(yīng)體系 根據(jù)引物的特性在上游或下游5′末端標記FAM熒光素。反應(yīng)總體系25 μL,Just Taq Hotstart DNA Ploymerase(熱啟動酶)2 μL,Just PCR buffer for Multiple(多重PCR buffer)12.5 μL, 引物2 μL(最后終濃度0.2 μm),DNA模板4 μL, 補超純水至25 μL。95℃11 min,94℃40 s 60℃1 min 72℃1 min,30循環(huán),72℃ 10 min,4℃∞。

1.3.5 PCR產(chǎn)物檢測 單一擴增預(yù)實驗使用3%瓊脂糖電泳檢測,復(fù)合擴增熒光 PCR產(chǎn)物,使用ABI PRISM3130XL測序儀/分型儀(Applied Biosystems)進行基因分型,用Genemapper軟件對有熒光標記的PCR產(chǎn)物的大小進行測量。熒光復(fù)合擴增的圖譜見圖1。

圖1 基因座D15S1185,AN2-di-repeat,D15S1292熒光復(fù)合擴增PCR分型圖譜

1.3.6 統(tǒng)計學(xué)分析 原始數(shù)據(jù)的處理與分析用Excel2000(Microsoft)及SPSS 13.0(SPSS Inc.)。 卡方(χ2)檢驗使用SPSS 13.0,比較前列腺癌組織和對照良性前列腺增生組織,以及正常血液樣本的差別。

2 結(jié) 果

2.1 樣本提取及擴增

前列腺癌組織石蠟樣本、前列腺增生組織石蠟樣本通過磁珠法快速提取,得到DNA樣本在擴增中不受抑制;正常血液樣本通過Chelex-100法提取。所有樣本經(jīng)熒光復(fù)合PCR擴增后,樣品在ABI PRISM3130XL遺傳分析儀上樣檢測,得到分型圖譜。

2.2 微衛(wèi)星AN2-di-repeat擴增PCR產(chǎn)物在不同組織中大小有差異

GeneMapper分析軟件得到的基因座大小,基因座D15S1185,D15S1292大小分別為分析圖譜中得到的結(jié)果為固定大小的102 bp和146 bp,而通過軟件在這兩個基因座附近尋找二核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星AN2-di-repeat擴增PCR產(chǎn)物大小在不同組織樣本中大小不一致,如表2所示。

2.3 D15S1185,D15S1292,AN2-di-repeat擴增PCR產(chǎn)物統(tǒng)計分析

由于膜聯(lián)蛋白Ⅱ的很多區(qū)域趨于保守,本研究中D15S1185,D15S1292兩個基因座在前列腺癌癥組織,良性前列腺增生組織,以及血液樣本中擴增大小無差別,但我們通過軟件發(fā)現(xiàn)的AN2-di-repeat的二核苷酸重復(fù)序列區(qū)域表現(xiàn)出在癌癥和不同組織的差別,使用統(tǒng)計軟件SPSS.13,以擴增大小134 bp為分界線,統(tǒng)計分析。

統(tǒng)計結(jié)果顯示,前列腺癌癥組織與血液樣本在AN2-di-repeat二核苷酸重復(fù)序列以擴增大小134 bp為分界線,卡方檢驗達到非常顯著的水平。(χ2=9.087,df=1,P=0.003)。前列腺癌癥組織與良性前列腺增生組織在AN2-di-repeat二核苷酸重復(fù)序列以擴增大小134 bp為分界線,卡方檢驗不顯著(χ2=1.997,df=1,P=0.158);前列腺增生組織與無關(guān)正常人血樣在AN2-di-repeat二核苷酸重復(fù)序列以擴增大小134 bp為分界線,卡方檢驗表現(xiàn)出顯著差異的趨勢(χ2=3.405,df=1,P=0.065)。

3 討 論

本研究使用熒光復(fù)合擴增的方法對前列腺癌組織、良性前列腺增生組織及正常人血樣中的膜聯(lián)蛋白Ⅱ的基因座D15S1185,D15S1292以及本研究尋找到二核苷酸重復(fù)序列微衛(wèi)星基因座AN2-di-repeat-NH進行擴增,探討此復(fù)合擴增方法的可行性,并對比樣本組織之間PCR產(chǎn)物的差異,統(tǒng)計分析本研究尋找到二核苷酸重復(fù)序列微衛(wèi)星基因座AN2-di-repeat-NH在前列腺癌組織、前列腺增生組織及正常人血樣之間的關(guān)系。

Annexin A2的序列定位于人類15號染色體上,基因全序列大小大約190 kb左右。在NCBI上的UniSTS下,搜索annexin A2,選取其中的2個基因座D15S1185(GeneBank登錄號：G07155.1)和D15S1292(GeneBank登錄號：G15634.1),這兩個基因座沒有相關(guān)報道,其中基因座D15S1185報道的擴增大小為105 bp～106 bp,基因座D15S1192有關(guān)報道的大小在150 bp。通過序列分析軟件發(fā)現(xiàn)這個兩個基因座附近存在一些二核苷酸以及五核苷酸的微衛(wèi)星序列。找出的二核苷酸微衛(wèi)星AN2-di-repeat-NH通過熒光擴增,發(fā)現(xiàn)了AN2-di-repeat-NH這個新膜聯(lián)蛋白Ⅱ二核苷酸序列在前列腺癌、前列腺增生組織,以及正常血樣的統(tǒng)計學(xué)差別。

表2 微衛(wèi)星AN2-di-repeat在不同組織中的擴增大小

石蠟組織切片中含有組織量較少,并且切片中含有的甲醛以及石蠟等是PCR反應(yīng)的強抑制劑,普通的抽提取方法很難達到滿意的效果,本研究使用納米磁珠,使石蠟組織切片的DNA得到最大量的提取,得到的DNA純化產(chǎn)物在下游PCR反應(yīng)中沒有抑制,可以得到目的產(chǎn)物。

癌癥是一種基因病,并且越來越多的研究發(fā)現(xiàn)癌癥與微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性(MSI)和雜合性缺失(LOH)相關(guān)。微衛(wèi)星(MS)是廣泛存在于真核生物基因組中具有高度多態(tài)性的、非編碼的、簡單串聯(lián)式核苷酸重復(fù)序列,具有介導(dǎo)基因重組、保持基因組穩(wěn)定性的作用。MSI是指與正常組織相比,在腫瘤組織基因組中微衛(wèi)星簡單重復(fù)序列的增加或丟失,多是由于DNA錯配修復(fù)功能的缺失所致。LOH是指一對染色體中的一條染色體發(fā)生了幾千個核苷酸乃至一整條染色體遺傳物質(zhì)的缺失,多發(fā)生于抑癌基因的附近,是識別抑癌基因的標志。前列腺癌以前有報道與雄激素受體(AR)基因微衛(wèi)星多態(tài)性有關(guān)[13],但國內(nèi)外未見有與膜聯(lián)蛋白Ⅱ基因內(nèi)部微衛(wèi)星有關(guān)的報道,本研究第一次發(fā)現(xiàn)了膜聯(lián)蛋白Ⅱ基因內(nèi)部的一個新二核苷酸微衛(wèi)星AN2-di-repeat-NH在前列腺癌組織與正常血樣中有統(tǒng)計學(xué)的顯著差異。

從AN2-di-repeat-NH基因座的統(tǒng)計分析來看,前列腺癌組織和正常血樣的基因頻率在134 bp這個分界線上有非常顯著的差異,χ2=9.087,df=1,P=0.003,提示膜聯(lián)蛋白Ⅱ基因的內(nèi)部微衛(wèi)星的改變與前列腺癌組織的癌細胞增殖有關(guān);良性前列腺增生組織和正常血樣的基因頻率在134 bp這個分界線上有顯著差異的趨勢,提示前列腺增生疾病的產(chǎn)生也會導(dǎo)致膜聯(lián)蛋白Ⅱ基因內(nèi)部微衛(wèi)星序列的微變異,這可能與PSA值的高低變化有關(guān)系。本次實驗結(jié)果前列腺癌組織和良性前列腺增生組織的基因頻率在134 bp這個分界線上,沒有顯著差異,有兩種可能性：第一,良性前列腺增生與前列腺癌是前列腺組織疾病的主要構(gòu)成,它們的組織細胞來源具有高度一致性,同時兩種疾病的初期病理表現(xiàn)均為組織細胞的增殖所致,它們在疾病發(fā)展初期可能存在趨同的關(guān)系。第二,由于本研究的樣本有限,無法達到統(tǒng)計學(xué)顯著差異的程度。這些都有待于進一步的研究。

綜上所述,一個新膜聯(lián)蛋白Ⅱ二核苷酸微衛(wèi)星基因座AN2-di-repeat-NH的多態(tài)性有可能成為早期前列腺癌的預(yù)警指標。

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