金針菇多糖的抗氧化活性

黃瓊，黃曉梅，張平，丁玲

（福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，福建福州350007）

金針菇多糖的抗氧化活性

黃瓊，黃曉梅，張平，丁玲

（福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，福建福州350007）

以茶多酚和VC為對照，采用Fenton反應(yīng)法研究金針菇多糖對羥自由基·OH的清除作用；采用鄰苯三酚自氧化法研究金針菇多糖對超氧陰離子自由基O2-·的清除作用。結(jié)果表明：在本試驗含量范圍內(nèi)，金針菇多糖對·OH和O2-·具有一定的清除能力；在含量相同的情況下，金針菇多糖對·OH和O2-·的清除能力比茶多酚和VC強。此外，研究了金針菇多糖抗油脂自動氧化能力，結(jié)果表明：金針菇多糖具有一定的抗油脂氧化活性。

金針菇多糖；抗氧化；·OH；O2-·

金針菇（Flammulina velutipes）富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、礦物質(zhì)元素、維生素和粗纖維，含脂肪較低，是一種不可多得的高營養(yǎng)食品，有增智菇和“一休菇”等美稱，在國際市場上的消費量僅僅次于蘑菇和香菇，目前已發(fā)展成為世界第三大食用菌[1]。金針菇多糖（Flammulina velutipes polysaccharides，F(xiàn)VP）對人體具有多種保健功效：增強記憶力、抗疲勞、提高機體耐缺氧能力；抗腫瘤，抗白血病作用，干擾腫瘤細胞的有絲分裂過程和提高機體的免疫力；抗衰老，延長壽命；提高免疫功能；抗有害藥物對機體的損害等[2]。

當人體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多或清除能力下降時，會導致各種嚴重病變，因此清除過量活性氧自由基具有重要意義[3]。尋找對自由基具有良好清除能力的清除劑，特別是從天然產(chǎn)物中尋找意義重大[4]。而多糖作為許多天然物的主要成分，具有低毒、安全、來源廣，能提高抗氧化酶活性、清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化，從而起到保護生物膜的作用[5]。目前國內(nèi)外關(guān)于金針菇多糖研究報道主要集中在金針菇多糖的提取，而對金針菇多糖的抗氧化性報道卻很少。為此，本試驗采用Fenton反應(yīng)法、鄰苯三酚自氧化法和油脂過氧化法，研究金針菇多糖對羥自由基·OH和超氧陰離子自由基O2-·的清除能力和對油脂的抗氧化能力，旨在為開發(fā)抗氧化、抗衰老的金針菇保健食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料

優(yōu)質(zhì)金針菇：福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院食用菌基地提供，新鮮，菇型完整，無畸形、雜質(zhì)、異味，呈白色。

1.1.2 試劑

苯酚、濃硫酸、無水乙醇、抗壞血酸（VC）、三羥甲基氨基甲烷、EDTA-Na2、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵均為分析純；茶多酚購于無錫太陽綠寶科技有限公司，純度為99％。

1.1.3 儀器設(shè)備

AB204-N/PL202-S型電子天平：梅特勒—托利多儀器（上海有限公司）；UV-2800型紫外可見分光光度計：尤尼克（上海）儀器有限公司；DHF-9055A型電熱鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司；LGR10-4.2高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海天呈科技有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海精密科學儀器有限公司；SHZ-D旋轉(zhuǎn)水式真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 金針菇多糖的提取

原料→烘干→稱重→勻漿→熱水抽提→離心分離→濾液醇析→復溶→去除雜蛋白→真空濃縮→干燥→產(chǎn)品

1.2.2 金針菇多糖對·OH的清除作用

利用Fenton體系[6]測定金針菇多糖對·OH-的清除作用。H2O2與2價鐵離子混合后產(chǎn)生·OH，其反應(yīng)方程式為：H2O2+Fe2+=OH-+·OH+Fe3+。·OH具有很高的反應(yīng)活性，存活時間短，但在反應(yīng)體系中加入鄰二氮菲，能有效地捕捉·OH并產(chǎn)生有色產(chǎn)物。該產(chǎn)物在波長536 nm處有強吸收。若加入具有清除·OH功能的被測物，則會與鄰二氮菲競爭·OH，從而使有色產(chǎn)物的生成量減少。采用固定反應(yīng)時間法，在波長536 nm處測量含被測物反應(yīng)液的吸光度，并與空白液比較，測定被測物對·OH的清除作用。

取7支25mL比色管，分別加入7.5 mol/L鄰二氮菲溶液1.0mL、pH 7.4PBS（0.1mol/L）緩沖溶液5.0mL，充分混勻后加入7.5mmol/L硫酸亞鐵溶液1.0mL，立即混勻，然后，向其中5支試管中分別加入一定濃度的金針菇多糖、維生素C及茶多酚溶液作為樣品，另2支比色管分別記為對照管和空白管，對照組以蒸餾水代替樣品溶液和H2O2溶液，空白組以蒸餾水代替樣品溶液。然后，在前5支比色管和空白比色管中分別加入濃度0.1％H2O21.0mL，再將7支比色管以蒸餾水補至25mL，使各待測液多糖濃度分別為0.005、0.010、0.015、0.020、0.025mg/mL，于37℃下反應(yīng)1 h，測定在波長536 nm處吸光度。“

·OH的清除率（E）的計算方法如下：

式中：A樣品為金針菇多糖吸光值；A空白為空白組吸光值；A對照為對照組吸光值。

1.2.3 金針菇多糖對O2-·的清除作用

采用鄰苯三酚自氧化法[7]測定。在堿性條件（pH 8.2）下，鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng)，生成O2-·和有色中間產(chǎn)物。該有色物在波長325 nm處有一特征吸收峰。當加入O2-·清除劑時，O2-·的生成受到抑制，鄰苯三酚的自氧化反應(yīng)受阻，溶液在波長325 nm處吸收峰減小。所以，通過測定在波長325nm處吸光值，可以計算多糖對O2-·的清除作用。

取5支10mL比色管，各加入0.1mol/LpH 8.2Tris-HCl緩沖液4.5mL，分別加入一定濃度的金針菇多糖、VC及茶多酚溶液作為樣品，混合后置于25℃水浴中預熱20 min，在25℃水浴中預熱的7 mmol/L鄰苯三酚0.3mL，以蒸餾水定容至10mL，使各待測液多糖濃度分別為0.005、0.010、0.015、0.020、0.025mg/mL，混勻后于25℃水浴中反應(yīng)，在第3min加入1滴10mol/LHCl終止反應(yīng)，在波長325 nm處測定吸光度。清除率計算公式為：

式中：A自氧化為不加多糖的吸光值；A樣品為多糖的吸光值。

1.2.4 金針菇多糖抗油脂自動氧化能力的測定

Fe2+/卵磷脂體系中，過渡金屬離子如Fe2+等，可以通過多種途徑促進油脂過氧化反應(yīng)的進行。卵磷脂暴露在有氧環(huán)境中會發(fā)生自動氧化，實驗時提高環(huán)境溫度可以加速其氧化過程，通過測定其添加樣品后的過氧化水平，并與空白對照比較，可以評價樣品的抗油脂過氧化活性[8]。

取8mg/mL卵磷脂溶液0.2mL，分別加入一定濃度的金針菇多糖、VC及茶多酚溶液作為樣品，加入50μL FeSO4（347.5mg FeSO4，35mg VC，定容至25mL）溶液，加0.1mol/L磷酸氫二鈉一磷酸二氫鈉緩沖液（pH=7.4）定容至3mL，37℃恒溫40min。然后，加入10mg/mL硫代巴比妥酸1mL（硫代巴比妥酸溶于10％三氯乙酸），搖勻，使樣品液最終濃度分別為0.005、0.010、0.015、0.020、0.025mg/mL，在100℃水浴15min，4 000 r/min離心10min，于532 nm處測定吸光度，用蒸餾水代替樣品做空白。

式中：A樣品為樣品的吸光值；A空白為空白管的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復3次，數(shù)據(jù)取平均值，采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 金針菇多糖對·OH的清除作用

按1.2.2的方法測定金針菇多糖、VC和茶多酚對·OH的清除作用，結(jié)果如圖1所示。

圖1 金針菇多糖、VC和茶多酚清除·OH的能力Fig.1 The ability of eliminating·OH of Flammulina velutipes polysaccharides，VCand tea polyphenol

由圖1可知，3種抗氧化劑對·OH均有一定的清除作用。其中金針菇多糖清除·OH能力最強，最高可達92.99％。茶多酚對·OH的清除能力與VC相當，金針菇多糖則大大高于前兩者。金針菇多糖的清除·OH能力是VC的3.03倍，是茶多酚的3.93倍。從圖1還可以看出：VC和茶多酚清除·OH能力隨著濃度增加而提高，然而金針菇多糖清除·OH能力在含量較低時，隨著含量的增加而提高；當含量超過0.001 0mg/mL時，抗氧化能力反而下降。這可能是由于含量越高，抗氧化劑對自身的抗氧化消耗越大，清除·OH的能力隨之下降。

2.2 金針菇多糖對O2-·的清除作用

按1.2.3的方法測定金針菇多糖、VC和茶多酚對O2-·的清除作用，結(jié)果如圖2所示。

圖2 金針菇多糖、VC和茶多酚清除O2-·的能力Fig.2 The ability of eliminating O2-·of lotus Flammulina velutipes polysaccharides，VCand tea polyphenol

由圖2可知，3種抗氧化劑對O2-·均有一定的清除作用。其中金針菇多糖清除O2-·能力最強，最高可達24.58％。茶多酚對O2-·的清除能力與VC相當，金針菇多糖則高于前兩者。金針菇多糖的清除O2-·能力是VC的1.32倍，是茶多酚的1.25倍。從圖2還可以看出：3種抗氧化劑清除O2-·能力隨濃度增加而提高。3種抗氧化劑濃度達到0.012 5mg/mL時，再增加抗氧化劑濃度，清除率變化不大，說明用量已接近飽和。

2.3 金針菇多糖抗油脂自動氧化能力的測定

按1.2.4的方法測定金針菇多糖、VC和茶多酚抗油脂自動氧化能力，結(jié)果如圖3所示。

圖3 金針菇多糖、VC和茶多酚抗油脂自動氧化能力Fig.3 The effect of lotus Flammulina velutipes polysaccharides，VCand tea polyphenol on oil anti-oxidation

油脂的自動氧化是油脂和含油脂食品最主要的變質(zhì)現(xiàn)象，由圖3可知，3種抗氧化劑對油脂均有一定的清除作用。其中Vc清除油脂能力最強，最高可達16.85％，茶多酚最高為11.69％，金針菇多糖最高為11.20％，金針菇多糖對油脂的清除能力與茶多酚相當。3種抗氧化劑抑制油脂過氧化作用和濃度有較大關(guān)系，濃度較低時，增大濃度抗氧化能力增強，但當濃度達到0.012 5mg/mL時，再增加抗氧化劑濃度，抗氧化能力反而下降。

3 結(jié)論

1）現(xiàn)代醫(yī)學和營養(yǎng)保健學認為，自由基在人體內(nèi)可直接引起許多疾病，一些疾病的發(fā)生與自由基也相關(guān)。人們普遍認為植物天然抗氧化物可以抑制自由基反應(yīng)，最終具有抗衰老、減少癌癥、心血管疾病的發(fā)生[9-10]。金針菇多糖具有較好的清除氧自由基的能力，表明其能夠清除人體內(nèi)過剩的氧自由基，而氧自由基與機體衰老、疾病關(guān)系密切，說明金針菇多糖具有抗衰老作用、減少癌癥、心血管疾病的發(fā)生。

2）金針菇多糖對·OH、O2-·的清除能力清除效果顯著，均比VC和茶多酚強，且具有一定的抗油脂自動氧化能力。因此，說明金針菇多糖是較好的抗氧化劑。

3）當金針菇多糖含量超過一定量時，其清除自由基的能力隨著含量的增加而下降，表明金針菇多糖作為一種較有效的天然抗氧化劑，使用時應(yīng)當適量，否則有可能引起食品色澤的改變。

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Antioxidant Activity of Polysaccharides from Flammulina velutipes

HUANG Qiong，HUANG Xiao-mei，ZHANG Ping，DING Ling
（Fujian Vocational College of Agriculture，F(xiàn)uzhou 350007，F(xiàn)ujian，China）

Using tea polyphenol and VCas the control，the effect of Flammulina velutipes polysaccharides on scavenging·OH and O2-·was studied with Fenton reaction and pyrogallol autoxidation methods．The results showed that Flammulina velutipes polysaccharides had certain ability to scavenge·OH and O2-·；with various concentrations．When concentrations were the same，F(xiàn)lammulina velutipes polysaccharides had stronger ability than tea polyphenol and VCto scavenge O2-·and·OH．In addition，the oil and oxidation of Flammulina velutipes polysaccharides was studied．The results showed that Flammulina v elutipes polysaccharides had certain ability on anti-oxidation of oil．

Flammulina velutipes polysaccharides；antioxidatio；·OH；O2-·

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.04.017

2012-09-29

福建省教育廳B類科技研究項目（JB12375）；福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院級課題（11-2s-01）

黃瓊（1976—），女（漢），講師，碩士，主要從事天然產(chǎn)物開發(fā)與利用方面的科研與教學工作。