GC-MS結合PLSR模型用于新疆小白杏杏仁油抗氧化性能的研究

田洪磊 詹 萍 朱新榮 顏海燕

（石河子大學食品學院，石河子 832000）

機體自由基的產生貫穿于整個生命代謝周期，抗氧化酶及其他各類抗氧化劑的存在為人體中抗氧化網絡的構建與完善及抗氧化平衡狀態(tài)的維護起到了至關重要的作用［1-2］。自由基產生與抗氧化防御系統(tǒng)的失衡直接誘導氧化應激狀態(tài)的發(fā)生發(fā)展，超氧陰離子等自由基的過多累積所導致的氧化應激型代謝紊及組織損傷等問題，是機體衰老、各種慢性疾病（如腫瘤、心血管疾病及糖尿病等）產生的主要根源［3］。近年來在人工合成抗氧化劑等食品添加劑的食用安全性受到普遍關注的同時，基于特色食品資源及其加工副產物進行天然抗氧化物質篩選與抗氧化劑制備已成為功能食品研究領域的熱點問題，富含多種生物活性物質的植物精油等天然復合基材為天然抗氧劑產品開發(fā)提供了豐富而便捷的資源樣本。作為多種脂肪酸及植物甾醇等物質組成較為復雜的新疆小白杏杏仁油，以其在多種疾病尤其是地方病干預治療方面的顯著效果，長期被維吾爾醫(yī)師作為一種藥物普遍使用，然而目前對其作用效果及機制的解析尚待填補或完善，在小白杏杏仁油資源樣本中生物活性物質鑒定分析的基礎上，對其清除自由基效果進行對照研究，預期通過抗氧化活性評價為多種疾病干預治療效果提供可靠解析或理論依據，從而有望在充實或補充天然抗氧化劑種類的同時，提升新疆區(qū)域特色資源的精深加工程度，推動區(qū)域資源優(yōu)勢向經濟優(yōu)勢轉變的進程。

在對復雜生物活性物質天然復合而成的小白杏杏仁油進行抗氧化活性研究的基礎上，結合相關分析方法對其中多樣活性物質單體與抗氧化指標之間的量效關系進行預測，可避免通過各種活性物質精確分離后進行抗氧化效果對比研究的復雜繁瑣過程，預期在節(jié)約研究成本的同時研究探討建立復雜生物活性物質樣本體系量效關系評價方法。PLRS分析法已被廣泛用于不同數據集之間的相關性研究，此方法主要通過分析復雜多變量體系組成的樣本集與有限幾種指標集之間的多重共線性進行量效關系預測［4-5］。目前鮮見關于新疆小白杏杏仁油藥食兩用資源的量效關系研究方面的報道，本研究結合項目組前期在小白杏杏仁油制備方法研究過程中所獲得研究成果，分別采用超臨界CO2萃取、機械壓榨、超聲波輔助提取及索氏提取的方法制備生物活性物質含量不同的小白杏杏仁油樣本，并采用GC-MS技術對不同樣本中脂肪酸、植物甾醇及VE等多種生物活性物質組分進行鑒定，再次對以上不同小白杏杏仁油樣本進行DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基及ABTS自由基清除效果研究，結合PLSR分析法對復雜生物活性物質組成的小白杏杏仁油進行抗氧化活性量效關系研究，旨在通過新疆小白杏杏仁油抗氧化活性及量效關系研究，為新疆小白杏功能產品開發(fā)及復雜天然產物體系生物學功能研究的方法改進提供堅實的理論依據或借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

小白杏杏仁：采集庫車縣成熟的小白杏鮮杏，整理收集小白杏杏仁，清水處理后進行烘箱干燥［干燥溫度（50±2）℃］，并將其分別粉碎至30目及60目（30目粉碎樣品用于超臨界萃取，60目粉碎樣品用于其他3種提取方法），低溫（-20℃）密封儲存?zhèn)溆?。內標物質（十九烷酸、角鯊烷）：美國Sigma化學試劑公司；甲苯：色譜級，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；DPPH及ABTS自由基：Sigma公司；正構烷烴混合標樣（C6-C26），其他試劑：均為國產分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

HA121-50-02超臨界萃取設備：江蘇華安科技股份有限公司；氣相色譜質譜聯用儀：美國Finnigan質譜公司；KESP-100KH超聲波萃取器：深圳科工達超聲設備有限公司；Carver12224-96液壓榨油機：美國Freds液壓設備公司；FW80微型高速試樣粉碎機：河北省黃驊市新興電器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 小白杏杏仁油的制備

小白杏杏仁油不同制品方法條件見表1。

表1 小白杏杏仁油不同制備方法條件

1.2.2 制備脂質體樣品脫膠處理方法

設置水與待脫膠樣品體積比例為18% （W／O），溫度為65℃進行水浴攪拌脫膠10 min，冷卻（4℃）后離心分離（2 800×g）12 min，脫膠分離的各脂質體樣品采用無水Na2SO4進行脫水后低溫貯藏備用。

1.2.3 小白杏杏仁油中主要生物活性成分的測定

脂肪酸的測定參見文獻［10］。

甾醇及VE等其他物質測定方法如下：準確稱取2.0 g油樣，加入100 mL濃度為1 mol／L的氫氧化鉀-甲醇溶液，在85℃水浴條件下回流加熱皂化1 h后冷卻至室溫（25℃）后，從中吸取5 mL，加入2 mL蒸餾水，用5 mL石油醚提取3次后，合并醚液，并將醚液蒸干，用2 mL吡啶溶解，再加入2 mL乙酸酐，靜止3 h后加入蒸餾水10 mL，冷卻后1 mL正己烷定容，待測。GC-MS分析條件：OV-1701毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，液膜厚度0.25μm），載氣（He）流量：0.8 mL／min，分流比：12∶1，進樣口溫度：280℃，起始柱溫240℃，以10℃／min的升溫速率升至265℃保持48 min。質譜條件：電離方式為EI，電子能量70 eV，發(fā)射電流150μA，檢測器電壓350 V，進樣量：0.5μL。

1.2.4 小白杏杏仁油抗氧化性能

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力

將DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基肼，1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl）自由基溶于95%的無水乙醇配成0.1mmol／L的待清除溶液，分別用無水乙醇將不同方法制備的小白杏杏仁油樣品及VE對照品稀釋成質量濃度為 0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg／mL的溶液，取上述各溶液2mL分別加入到2mL 0.1mmol／L的 DPPH配制溶液中［11］，室溫（25℃）暗室條件下水浴搖動20 min后取出，在517 nm處10 min內測定吸光值，并用2 mL去離子水配成的同濃度DPPH溶液作為對照，蒸餾水做空白對照，相關檢測做3次重復（其他自由基清除效果研究同樣重復對照）。DPPH自由基清除能力計算公式：清除能力＝［A0-（A1-A2）］／A0×100%，式中：A0為添加樣品前DPPH溶液吸光度；A1為添加樣品后的DPPH溶液吸光度；A2為樣品吸光度。采用各樣品達到最大抑制率一半（IC50）時的樣品濃度評價樣品清除自由基的效果［12］。

1.2.4.2 羥基自由基清除能力

采用2-脫氧-D-核酸糖-氧化法研究小白杏杏仁油對羥基自由基的清除效果［12］，依次在反應試管中加入0.4 mL KH2PO4-KOH緩沖液（pH＝7.4），0.1 mL以上不同濃度樣品溶液及 EDTA（1 mmol／L）、雙氧水（10 mmol／L）、2-脫氧 -D-核酸糖（60 mmol／L）、抗壞血酸（2 mmol／L）、三氯化鐵（1 mmol／L）溶液，并用0.1 mL蒸餾水代替三氯化鐵溶液做空白對照，28℃條件下反應90 min后加入1 mL三氯乙酸（20%）終止反應，然后加入1 mL硫代巴比妥酸溶液（1%），混合均勻后在沸水?。?00℃）中保持15 min，冰浴后在532 nm處測定吸光值［13］。

1.2.4.3 超氧陰離子自由基清除能力

依據生物活性物質經過超氧陰離子氧化還原反應失活形成呈色產物的原理［14-15］，將0.1 mL不同濃度的小白杏杏仁油樣本溶于2.8 mL的Tris-HCl-EDTA緩沖液（0.1 mol／L，pH＝8.2）中，25℃條件下混合20 min后加入0.1mL鄰苯三酚（3 mmol／L），相同溫度條件下反應5 min加入1 mLHCl溶液（8 mmol／L）終止反應，在299 nm處測定吸光值，計算清除率。

1.2.4.4 ABTS自由基清除能力

采用Floegel等［15］方法進行不同小白杏杏仁油樣品清除ABTS（2，2’-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉 -6-磺酸，2，2＇-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate））自由基的對照研究，通過34 mg K2S2O8及52 mL蒸餾水配置K2S2O8儲備液，取儲備液5.2 mL加入20 mg ABTS，制的ABTS母液暗室放置12 h后，取0.8 mL用甲醇定容至50 mL，得ABTS待用液，取2 mL ABTS待用液分別加入到2 mL不同濃度的小白杏杏仁油樣品及VE對照品中，并用相同體積的甲苯-甲醇溶液（1∶1）形成空白對照組，各反應樣本室溫（25℃）振蕩0.5 min后避光密封放置30min，在734 nm處測定吸光值，計算清除率。

1.3 數據統(tǒng)計分析

對測定結果采用SPSS20.0軟件進行Duncan多重比較檢驗和方差分析（ANOVA），P＜0.05認為存在顯著性差異。相關性分析采用偏最小二乘回歸法（PLSR），所有數據均進行3次平行試驗。

2 結果與分析

2.1 不同方法制備新疆小白杏杏仁油主要生物活性物質分析

如表2、表3所示，通過對4種不同方法制備的小白杏杏仁油樣品進行生物活性物質鑒定，發(fā)現各樣品中生物活性物質含量豐富且存在差異，包括脂肪酸、甾醇及VE等50余種物質組分，為了后期分析的便捷性及對照研究的需要，將含量甚微（峰面積＜10 000）的成分刪除，采用Xcalibur軟件對色譜數據進行分析，通過對鑒定所得化合物與NIST及WILEY數據庫中的已知化合物質譜數據比對（盡可能采用標準物質對檢出物質進行比對），選取相似度（SI）和逆檢索相似指數（RSI）＞800的物質比較其KI指數。通過對4組樣品生物活性物質進行對照篩選，共獲得共有活性物質33種，其中包括19種脂肪酸組分、14種甾醇及其他生物活性物質類組分，相關活性物質均呈顯著差異性（P＜0.05，α-生育酚除外），與其他3種制備方法相比，SCDE法制備的樣品中相關共有活性物質種類較為齊全。各樣品脂肪酸中單不飽和脂肪酸（MUFA）質量分數在59.95%～68.90%之間，多不飽和脂肪酸（PUFA）質量分數在21.70%～25.36%之間。采用MCE制備的樣品中順式 -油酸Δ9、油酸Δ11、亞油酸Δ9，12、亞麻酸Δ6，9，12及亞麻酸Δ9，12，15的含量相對最高，十七烷酸、二十三烷酸、二十四烷酸及亞油酸Δ8，11未檢出；在其他3種方法制備的樣品中順式-油酸Δ9及亞油酸Δ9，12等脂肪酸組分亦保持了相對較高的含量，其中SCDE制備樣品中硬脂酸、二十三烷酸、亞油酸Δ8，11及花生四烯酸Δ5，8，11，14含量相對稍有偏高，肉豆蔻酸及二十碳三烯酸Δ8，11，14未檢出，UAE制備樣品中棕櫚酸、花生酸、花生一烯酸Δ11、二十二烷酸及二十四烷酸的含量相對較高，但亦存在亞油酸Δ8，11、二十三烷酸及花生四烯酸Δ5，8，11，14未檢出的現象，同樣在SE制備樣品中棕櫚油酸、反式 -油酸Δ9及二十碳三烯酸Δ8，11，14的含量呈現了相對較高的現象，花生四烯酸Δ5，8，11，14與二十四烷酸未檢出。與脂肪酸組成相比，不同方法制備的小白杏杏仁油樣品中甾醇及其他生物活性物質含量亦存在較為明顯的差異性，采用SCDE制備的樣品中β-谷甾醇Δ5、角鯊烯Δ2，6，10，14，18，22及 γ-生育酚含量相對較高，在其他3種方法制備的樣品中α-生育酚、Δ5-燕麥 甾 醇Δ5，24（28）、Δ5-豆 甾 醇Δ5，22、Δ7-燕 麥 甾醇Δ7，24（28）、沉香萜醇Δ1，6、膽甾醇Δ5、菠菜甾醇Δ7，22、麥角甾醇Δ5及 Δ7-豆甾醇Δ7，22等分別亦表現了相對較高的含量狀態(tài)。

表3 不同方法制備小白杏杏仁油中甾醇及其他生物活性物質

在較全面地對所選擇的新疆小白杏杏仁油樣品中生物活性物質進行分析鑒定后，發(fā)現小白杏杏仁油中確實存在多種物質成分，新疆少數民族居民長期采用其作為多種維吾爾藥物配伍資源進行相關疾病干預，可能與某些生物活性物質的多元化組成相關，為提高小白杏杏仁油中生物活性物質生物學功能追溯的科學性，避免通過各種活性物質精確分離后進行抗氧化效果對比研究的復雜繁瑣過程，復雜多變量體系組成的4種不同方法制備的小白杏杏仁油樣品為相關單體成分功能作用的顯著性與協(xié)同性研究或預測提供了相近但存在差異的研究樣本。

2.2 小白杏杏仁油抗氧化活性

基于物質組分含量及協(xié)同作用效果的差異，不同制備樣品可能存在清除能力變化的差異。試驗中，小白杏杏仁油抗氧化活性通過對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基和ABTS自由基進行表征。通過對不同方法制備的小白杏杏仁油樣品不同濃度的抗氧化能力測定，采用SPSS軟件計算得出4種不同方法制備的小白杏杏仁油抗氧化能力的IC50值，結果見表4。

表4 供試樣本抗氧化能力的IC50值對照

4種制備小白杏杏仁油樣本及VE對照樣本對于DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基和ABTS自由基均具有一定的清除能力。對于DPPH自由基，在質量濃度為0.05～0.2 mg／mL時清除效果變化最為明顯，其中SCDE、SE及UAE制備樣品在質量濃度達到0.8 mg／mL濃度時清除率基本達到最佳狀態(tài)，其達到最大清除率50%的質量濃度（IC50）分別為0.134、0.191、0.321 mg／mL；MCE制備樣品及VE對照品清除率在質量濃度達到0.4 mg／mL后有下降趨勢，IC50值分別為 0.202、0.050 mg／mL；小白杏杏仁油樣品對羥基自由基亦具有一定的清除能力，其中以SCDE制備樣品最為明顯，其 IC50值為0.190 mg／mL，與 VE IC50值（0.123 mg／mL）相比，SCDE制備樣品清除羥基自由的能力較VE稍弱。所有考察樣品對羥基自由基的清除能力均表現出相似的變化趨勢，在0.05～0.8 mg／mL范圍內，隨樣品濃度的改變羥基自由基清除率變化明顯，繼而提升樣品濃度時清除率變化微弱，不同物質含量的樣品所呈現的相似趨勢可以反映某些物質組分與羥基自由基清除效果間可能存在相關性，或相近的制備樣本自然形成了某種特定類型的協(xié)同作用體系；對于超氧陰離子清除效果，結果表明濃度較低（0.05～0.8 mg／mL）的情況下樣品對超氧陰離子的抑制效果均明顯高于VE對照組，在質量濃度達到0.8 mg／mL后，除VE對照組及UAE樣品組外，其他3組樣品濃度對超氧陰離子的清除率變化產生的影響不明顯，與 VE對照組（IC50＝0.731 mg／mL）相比，SCDE、MCE及SE制備樣品均顯示了較強的超氧陰離子自由基清除活性（IC50值 0.578～0.721 mg／mL），UAE制備樣品稍弱，其 IC50值僅為1.160 mg／mL；與此同時小白杏杏仁油樣品對ABTS自由基亦具有一定的清除能力，其中以MCE制備樣品最為明顯，其IC50值為0.436 mg／mL，其他3種制備樣品 IC50值在0.733～0.786 mg／mL之間，與 VE對照組（IC50＝0.278 mg／mL）相比，各制備樣品對ABTS自由基的清除能力稍遜于VE。通過對各供試樣本的IC50值比較亦可發(fā)現，與其他供試樣本相比，UAE制備樣品對相關自由基的清除效果均相對較弱，各供試樣本對DPPH自由基的清除效果尤為明顯。

2.3 顯著相關性活性物質與抗氧化性能量化分析

在對差異性小白杏杏仁油樣品進行抗氧化活性評價的基礎上，為深入明晰或預測小白杏杏仁油樣品中主要生物活性物質對小白杏杏仁油樣品抗氧化性能的作用方式，采用ANOVA-PLSR方法建立了PLSR模型，對4種不同方法制備的小白杏杏仁油中的33種主要成分和4個抗氧化指標進行了相關分析。在對前期相關變量集合進行PLSR分析前，對所有原始變量進行標準化的預處理（1／Sedv），所有PLSR模型均采用全交叉驗證法進行檢驗。以33種化合物為X變量，單個氧化應激指標為Y變量分別建立4個PLSR模型，根據Jack-knife不確定度檢驗分別計算得出的對Y變量（即4個抗氧化制備）具有顯著影響的活性物質（P≤0.05），結果見表5。

然而，在實際操作過程中發(fā)現，與多種中藥制劑的功效作用相似，小白杏杏仁油供試樣本對4種自由基的清除效果不可能完全由某種單一的活性成分呈現，極有可能通過多種成分的協(xié)同作用完成，再者，復合體系中不同生物活性物質的功效閾值差異性較大。因此，為了更為直觀的比較不同方法制備的小白杏杏仁油中相關活性物質與自由基清除效果間的量化關系，從上述顯著活性物質中找出一些在不同方法制備的小白杏杏仁油樣本中含量差異變化較大的組分尤為重要。在前期生物活性成分與抗氧化能力相關性明晰的基礎上，選擇傳統(tǒng)索氏提取法制備的小白杏杏仁油樣本（SE）為參照，以其中相關性分析顯著的化合物的含量為基準，計算得出其他3種方法制備的小白杏杏仁油樣本中相關性分析顯著成分含量的差值系數，計算公式為：

式中：Y為各種顯著化合物含量的差值系數；Cx分別為3種不同方法制備的小白杏杏仁油中各種顯著化合物含量；C0為索氏提取制備小白杏杏仁油中相應組分含量。

通過比較差值系數，可以直觀地表征不同方法制備的小白杏杏仁油中各種化合物之間的差值變化率，用來反映同一物質在不同方法中的差異程度。一般來說，結合PLSR模型確定的顯著成分中，基準含量高的化合物可能是起主導功效的重要物質，而差值系數較大的物質則可能是導致不同樣本產生差異功效的關鍵成分。具體量化結果如表5所示。

表5 具有顯著特性的成分與自由基清除能力間的量化分析

由表5所示的PLSR模型的回歸系數可以看出，與DPPH自由基清除能力強弱相關的顯著化合物依次為角鯊烯Δ2，6，10，14，18，22（0.049 06）、γ-生育酚（0.045 86）、亞油酸Δ9，12（0.045 03）、順式-油酸Δ9（0.044 00）、β-谷甾醇Δ5（0.043 93）、亞油酸Δ8，11（0.041 74）、菠菜甾醇Δ7，22（0.039 58）、α-生育酚（0.033 88）等。同時結合各種活性化合物的差值系數（按式（1）計算所得）進行比較分析，發(fā)現亞油酸Δ8，11（3.00）、亞麻酸Δ6，9，12（1.06）、花生三烯酸Δ8，11，14（1.00）、菠菜甾醇Δ7，22（0.67）差值系數變化相對較大，而其基準含量卻相對較低（分別為0.04 g／100 g、0.15 g／100 g、0.14 g／100 g和 4.62μg／g），其他顯著活性化合物，如順式油酸Δ9（62.78 g／100 g）、亞油酸Δ9，12（21.5 g／100 g）基準含量較高，差值系數變化較小（分別為0.14和0.13），綜合以上分析結果推斷：角鯊烯Δ2，6，10，14，18，22為主導的小白杏杏仁油的DPPH自由基清除體系中，順式油酸Δ9和亞油酸Δ9，12對于DPPH的亦存在顯著清除效力，但導致4種方法制備的小白杏杏仁油樣本對DPPH自由基清除效力存在顯著差異，可能恰恰是由于以上基準含量相對較低的物質在其他3種制備樣品中的差異性配伍與協(xié)同效力所造成的；按上述分析方法推測，角鯊烯Δ2，6，10，14，18，22（差值系數為 0.57）可能是小白杏杏仁油樣本清除羥基自由基的關鍵物質，花生四烯酸Δ5，8，11，14可能是清除超氧陰離子自由基的關鍵物質，Δ5-燕麥甾醇Δ5，24（28）（1.00）和亞麻酸Δ6，9，12（1.06）可能是清除ABTS自由基的關鍵物質。

3 結論

通過GC及GC-MS技術對超臨界CO2萃取、機械壓榨、超聲波輔助提取及索氏提取四種小白杏杏仁油制備樣品進行了分析，共篩選獲得了33種呈顯著差異性（P＜0.05，α-生育酚除外）的活性物質；不同方法制備樣品對 DPPH、羥基、超氧陰離子及ABTS 4種自由基均存在差異的清除能力。采用PLS1模型分析了具體活性物質與抗氧化指標之間的相關性，同時結合差值系數分析，初步推測角鯊烯Δ2，6，10，14，18，22、花 生 四 烯 酸Δ5，8，11，14、Δ5-燕 麥 甾醇Δ5，24（28）、亞麻酸Δ6，9，12可能分別在不同小白杏杏仁油自由基清除體系中起關鍵協(xié)同作用。

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