重組白地霉脂肪酶催化菜籽油水解制備α-亞麻酸工藝的研究

付建紅 汪世娟 呂豪豪 白 希 王志勇

（新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1，烏魯木齊 830054）

（新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院2，烏魯木齊 830054）

α-亞麻酸是人體必需的脂肪酸，不能在體內(nèi)合成，必須從外界攝取。α-亞麻酸具有重要的生理作用和藥用價值。它可通過鏈延長酶和脫氫酶的雙重作用，轉(zhuǎn)化為具有降血壓、降血脂、抑制血小板凝聚和減少血栓形成等功效的EPA和DHA［1］。另外，α-亞麻酸還具有增強(qiáng)免疫力和抗炎作用、抑制癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移、保護(hù)視力和提高記憶力、抗氧化及延緩衰老等生理功能［2］。由于α-亞麻酸迄今不能人工合成，只能依賴于有限的自然資源，因此，進(jìn)一步開發(fā)和探尋富含α-亞麻酸的自然資源，并深入研究α-亞麻酸的制取與純化技術(shù)及其α-亞麻酸延伸產(chǎn)品，對促進(jìn)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化、農(nóng)業(yè)資源高效利用具有重要意義。

菜籽油是以油菜的種子榨制所得的透明或半透明狀的液體，是我國主要食用油之一，也是世界上第三大植物油。菜籽油中含有較多不飽和脂肪酸，其中α-亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)8%～10%，高于其他常見的食用油。新疆油菜種植面積達(dá)134.3萬畝，菜籽油的產(chǎn)量相當(dāng)可觀，如因地制宜地利用菜籽油生產(chǎn)α-亞麻酸，對擴(kuò)大菜籽油的利用價值以及油料資源的深加工利用具有廣泛而深遠(yuǎn)的意義。

在α-亞麻酸的制備過程中油脂的水解尤為關(guān)鍵，油脂水解率的提高，將會為后續(xù)提高目標(biāo)產(chǎn)物的得率奠定基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的油脂水解工藝是采用高溫高壓或強(qiáng)酸強(qiáng)堿法，需要耐高壓抗腐蝕設(shè)備，投資大，耗能多，環(huán)境污染嚴(yán)重，勞動條件差，而且不適用于熱敏性油脂，如含多不飽和脂肪酸的油脂。酶法水解油脂則正好克服了上述缺點，而且具有選擇性，可減少副反應(yīng)，提高產(chǎn)品的質(zhì)量和得率［3-4］。本試驗所用的重組脂肪酶來源于白地霉，而白地霉脂肪酶水解菜籽油，可將甘油3個酯鍵上的不飽和脂肪酸優(yōu)先釋放出來［5］，這對于菜籽油中α-亞麻酸釋放是很有利的。目前，對紫蘇籽油、亞麻籽油、花椒籽油、獼猴桃籽油及橡膠籽油中α-亞麻酸的富集研究已有文獻(xiàn)報道［6-14］，但利用重組脂肪酶對菜籽油中α-亞麻酸進(jìn)行富集的研究鮮見報道。本研究利用微生物發(fā)酵技術(shù)大量制備的重組脂肪酶水解菜籽油制備α-亞麻酸，可最大化的降低生產(chǎn)成本，為獲得較高含量的α-亞麻酸及菜籽油的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

福臨門一級菜籽油：中糧集團(tuán)（市售）；重組脂肪酶（8 000～10 000 U／g）：實驗室自制；酚酞、吐溫 -80、聚乙烯醇、橄欖油：均為化學(xué)純；正庚烷：色譜純；硬脂酸甲酯、棕櫚酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、α-亞麻酸甲酯：美國Sigma公司。

1.1.2 儀器

島津GC-9A型氣相色譜儀：島津企業(yè)管理（中國）有限公司；TS-211C天呈臥式恒溫振蕩器：上海天呈實驗儀器制造有限公司；RE52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：金壇市佳美儀器有限公司；2-16實驗室通用型離心機(jī)：德國希格瑪（Sigma）離心機(jī)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菜籽油混合脂肪酸的制備

稱取一定量菜籽油于250 m L三角瓶中，按比例加入0.025 mol／L磷酸緩沖溶液，再加入5%（油）吐溫-80和一定量的脂肪酶，置于200 r／min恒溫振蕩器內(nèi)進(jìn)行水解反應(yīng)。反應(yīng)一定時間后取出25 m L水解產(chǎn)物，離心，上清液中加入正己烷萃取，有機(jī)相水洗至中性，用無水硫酸鈉脫水，減壓蒸餾回收溶劑，獲得菜籽油混合脂肪酸，測定酸值、計算水解率，并用氣相色譜儀測定其中脂肪酸組分的含量。

1.2.2 重組脂肪酶水解菜籽油的正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取pH值、加酶量、水解時間和水油比4個因素，以水解率為評價指標(biāo)，采用四因素三水平的正交試驗L9（34），優(yōu)化脂肪酶催化菜籽油水解的工藝條件。正交試驗因素水平見表1。

表1 重組脂肪酶水解正交試驗因素水平表

1.2.3 尿素包合法富集α-亞麻酸工藝

按一定的配比將乙醇和尿素加入燒瓶中，開啟機(jī)械攪拌，在65℃的水浴鍋中回流至尿素完全溶解，再加入一定比例的混合脂肪酸繼續(xù)攪拌至溶液澄清透明。在一定的溫度下冷卻結(jié)晶一定的時間，迅速抽濾。濾液經(jīng)減壓旋蒸除去多余的溶劑乙醇，分別用稀酸和正己烷洗滌至中性，再用無水硫酸鈉干燥，得到富集的α-亞麻酸。

根據(jù)前期單因素試驗，確定包合時間、尿素∶脂肪酸比、乙醇比∶尿素對α-亞麻酸的含量影響很大。采用L9（34）正交試驗對富集α-亞麻酸的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗因素選取包合時間14、20、26 h，尿素∶脂肪酸（m∶m）（2、4、6）∶1，乙醇 ∶尿素（V∶m）（5、7、9）∶1。

1 .2.4 脂肪酸組成分析測定

菜籽油及富集后的不飽和脂肪酸先進(jìn)行甲酯化，再進(jìn)行氣相色譜分析其脂肪酸組成。甲酯化方法參照文獻(xiàn)［14］。GC分析條件為：DB-WAX型色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度240℃；檢測器溫度 260℃；載氣流速為 1.2 mL／min；程序升溫為初始溫度80℃，保留2 min，以5℃／min升溫至 140℃，保持 5 min，然后以 2.5℃／min升至230℃，保持10 min；進(jìn)樣量為1μL；分流比 35∶1。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜籽油脂肪酸組成

菜籽油的脂肪酸甲酯氣相色譜圖見圖1。與脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖對比可知，菜籽油中初步定性了5種脂肪酸，它們的組成含量見表2。

圖1 菜籽油中脂肪酸的氣相色譜圖

表2 菜籽油脂肪酸組成的分析結(jié)果

從表2可知，原料菜籽油中不飽和脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)94.62%，其中以油酸的含量最高，其次是亞油酸，α-亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.03%。利用脂肪酶水解法和尿素包合法可將飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸及多不飽和脂肪酸進(jìn)行一定的分離，進(jìn)而得到較高含量的α-亞麻酸。

2.2 正交試驗優(yōu)化重組脂肪酶水解的工藝條件

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取pH（A）、加酶量（B）、水解時間（C）和水油比（D）4個因素作為影響因素，在酶促反應(yīng)溫度42℃的條件下，探討各因素對油脂水解率的影響，并找出最大的影響因素。正交試驗結(jié)果見表3。

表3 重組白地霉脂肪酶水解正交試驗結(jié)果與分析

從表3中的極差分析可以看出，4個因素對菜籽油水解率影響的主次順序為A＞D＞C＞B，即pH值影響最大，加酶量影響最小。以水解率為評價指標(biāo)時重組白地霉脂肪酶水解菜籽油最佳的工藝條件為A1B3C3D3，即當(dāng)水／油為 1.5∶1，pH為 8.0，加酶量為250 U／g油，反應(yīng)18 h的菜籽油水解率為40.1%。

2.3 尿素包合法富集菜籽油α-亞麻酸的條件優(yōu)化

在各單因素試驗基礎(chǔ)上，本試驗選定包合時間、尿素∶脂肪酸（m∶m）、乙醇∶尿素（V∶m）3個因素，每因素取3水平，選用L9（34）正交設(shè)計試驗，以α-亞麻酸相對含量和得率為指標(biāo)進(jìn)一步研究各因素對α-亞麻酸富集程度的影響。正交試驗結(jié)果見表4。

由表4中極差分析可知，各因素對尿素包合菜籽油中α-亞麻酸含量的影響次序為A＞B＞C，即尿素∶脂肪酸＞乙醇∶尿素＞包合時間。對得率的影響順序也是A＞B＞C，即尿素∶脂肪酸＞乙醇∶尿素＞包合時間。正交試驗結(jié)果表明，使α-亞麻酸相對含量達(dá)到最高的組合為A2B1C3，得率達(dá)到最高的組合為A3B3C1，在確定最佳工藝條件時，應(yīng)綜合考慮α-亞麻酸的含量與得率。如果加大尿素用量，部分α-亞麻酸也與尿素包合，使α-亞麻酸的含量降低，所以A選水平2。溶劑乙醇用量太多，α-亞麻酸難以與之分離，影響產(chǎn)品α-亞麻酸含量，也造成溶劑浪費(fèi)，所以B選水平1。包合時間對尿包后α-亞麻酸的含量和得率影響都比較小，為節(jié)約能源C選取水平1。確定適宜的包合條件為A2B1C1，即m（脂肪酸）∶m（尿素）∶V（乙醇）為 1∶4∶20、包合時間14 h，在-20℃條件下包合所得α-亞麻酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.24%，得率為5.13%。

表4 尿素包合正交試驗結(jié)果與分析

圖2 尿素包合富集后的不飽和脂肪酸氣相色譜圖

2.4 尿素包合富集前、后菜籽油不飽和脂肪酸組成的比較

尿素包合富集后的脂肪酸甲酯氣相色譜圖見圖2，經(jīng)與尿素包合前菜籽油的脂肪酸氣相色譜圖（圖1）比較，富集后的脂肪酸中初步定性了3種不飽和脂肪酸即油酸、亞油酸和α-亞麻酸，而棕櫚酸和硬脂酸已檢測不出來。由圖2可見，富集后的亞油酸和α-亞麻酸的相對含量明顯高于富集前原料菜籽油中亞油酸和α-亞麻酸的含量，而油酸的相對含量與之相比顯著降低。結(jié)果表明，尿素包合能將飽和脂肪酸（棕櫚酸和硬脂酸）以及部分油酸除去，而亞油酸和α-亞麻酸被富集，含量明顯提高。亞油酸和α-亞麻酸碳鏈長度相同，且只相差一個不飽和鍵，因此很難將其分離。

3 結(jié)論

在反應(yīng)時間18 h、反應(yīng)溫度42℃條件下，通過正交試驗優(yōu)化得到重組白地霉脂肪酶水解菜籽油的最優(yōu)工藝條件為∶水油比1.5∶1，pH 8.0，酶用量250 U／g。在此條件下菜籽油的水解率最大達(dá)40.1%。酶法制備脂肪酸是一項較先進(jìn)的提取技術(shù)，而重組白地霉脂肪酶水解菜籽油效果明顯，本研究為利用該酶水解其他動植物油脂制備脂肪酸提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

通過正交試驗優(yōu)化的尿素包合法富集菜籽油中α-亞麻酸的最佳條件為m（脂肪酸）∶m（尿素）∶V（乙醇）為 1∶4∶20，包合時間為 14 h，包合溫度為-20℃，產(chǎn)品中α-亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)由8.03%提高到19.24%。表明采用尿素包合法純化富集菜籽油中α-亞麻酸是可行的，尿素包合法是大幅度提高不飽和脂肪酸含量的有效途徑之一。尿素包合法工藝簡單，易于操作，生產(chǎn)成本低廉，溶劑可回收再利用，且此過程在低溫下進(jìn)行，對不飽和脂肪酸的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)不會產(chǎn)生影響，可作為實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的工藝技術(shù)參考。

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