超臨界CO2酶法合成低熱量三酰甘油工藝條件的優(yōu)化

于殿宇 張春艷 宋 鵬 李萬振 解桂東 江連洲

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，哈爾濱 150030）

油脂是食品的重要組成成分，能賦予食品獨特的口感、風味和質(zhì)地，但大量攝入會引發(fā)高血脂、心臟病和動脈硬化等慢性病，嚴重損害人類的健康［1-3］。以往的油脂代用品和模擬品會不同程度地影響人類的基礎代謝，有些產(chǎn)品的風味和口感也不易保存［4-5］。因此，開發(fā)特性、口感和風味效果與天然油脂相同的功能性油脂已成為各國食品行業(yè)的熱門研究方向［6-8］。即將短鏈脂肪酸和油脂進行酯化，形成的至少包含一個低熱量短鏈脂肪酸和一個不被吸收長鏈脂肪酸（被稱為構(gòu)造脂質(zhì)）的長短鏈三酰甘油［9-10］。因長短鏈脂肪酸具有發(fā)熱量低，可刺激腸道電解質(zhì)和水的吸收等特點，故長短鏈三酰甘油具有降低血糖水平和膽固醇水平的功能［11-12］。低熱量油脂代用品在綜合評分中優(yōu)于以往的油脂代用品和模擬品［13-14］。

近年來，生產(chǎn)低熱量油脂的方法大都是在常規(guī)的方式下進行，不僅生產(chǎn)周期長，且酯化率低，而在化學隨機酯交換反應研究背景下研究的超臨界CO2酶法酯交換反應，是近年來生物工程新開拓的領域［15-16］。在這種狀態(tài)下，反應物在超臨界CO2流體中的溶解度大，且超臨界CO2流體的傳質(zhì)速率高，進而使反應物能與催化劑充分接觸，提高酯化反應的速度，大大縮短反應時間。這些特點使其在食品工業(yè)上的應用具有廣闊的發(fā)展前景。

本試驗以短鏈脂肪酸與葵花油的甘油酯混合進行酯化反應，利用具有更高活性的脂肪酶Lipozyme RM IM，對超臨界CO2狀態(tài)下酶法合成長短鏈甘油酯進行了初步研究，并確定了酯化條件。

1 材料與方法

1.1 試劑

葵花油：金龍魚嘉里糧油（營口）有限公司；脂肪酶Lipozyme RM IM：丹麥諾維信公司；二氧化碳（純度＞99.9%）：哈爾濱黎明氣體有限公司；乙酸甲酯標準品：美國sigma公司；正己烷（色譜純）、甲醇（色譜純）、乙酸（分析純）、乙酸酐：天津市科密歐化學試劑有限公司；氫氧化鉀（分析純）：天津光復精細化工研究所；濃硫酸：固安縣清運化工廠。

1.2 設備

高壓反應釜：江蘇太倉市醫(yī)器械廠；恒溫水浴鍋：上海申生科技有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市英峪高科儀器廠；低速離心機：北京醫(yī)用離心機廠；7890A型氣相色譜儀：安捷倫公司。CP-Sil 88毛細管柱（100 m×0.25 mm i.d×0.2μm）：美國Varian公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酶促酯化方法

向反應釜中加入一定比例的乙酸、乙酸酐、葵花油、甘油及一定量的脂肪酶和純凈水，放入轉(zhuǎn)子，進行充分攪拌，確保反應物混合均勻。將反應釜密封后充入少量CO2以置換出反應釜中的空氣，同時試漏，確定反應釜密封情況良好不漏氣后，在加壓泵的作用下充入CO2使反應釜內(nèi)達到一定壓力，然后將反應釜置于水浴鍋中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至200 r／min，在一定溫度下反應一定時間。

1.3.2 酯化率的測定分析

取1.3.1中的液體產(chǎn)物3～5滴，稱重，采用無水硫酸鈉過濾除去水分，以1%H2SO4-甲醇甲酯化后溶于正己烷，供氣相色譜分析［17］。乙酸的質(zhì)量含量通過利用乙酸甲酯標準品繪制的標準曲線算出。

檢測器：FID；進樣口溫度：250℃；檢測器溫度：250℃；空氣壓力：50 kPa；氫氣壓力：60 kPa；氮氣壓力：220 kPa；程序升溫：70℃時保持 4 min，然后以13℃／min的升溫速率將溫度升至175℃，保持此溫度27 min，最后以4℃／min的升溫速率將溫度升至215℃，保持31 min。

式中：M0為反應初始體系中酸的單位含量；Mt為反應完畢后體系的游離酸的單位含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 反應壓力對酯化率的影響

固定反應溫度55℃，反應時間15 h，水分添加量為2%，酶用量為4%，乙酸與葵花油底物比為3∶1，反應壓力分別取8、9、10、11、12 MPa進行酯化反應，測定樣品的酯化率。

壓力是超臨界酯化反應的主要影響因素，壓力不同必然影響底物濃度從而影響反應速率及酯化率。如圖1所示，隨著反應壓力的增加，酯化率先增加，后有所下降。隨著壓力的不斷增大，反應物與酶接觸面積不斷增大，反應速率加快，從而相應提高轉(zhuǎn)化率，并縮短了反應時間。但當壓力達到11 MPa以上時，酯化率略有下降，因此反應壓力為11 MPa較為適宜。

2.1.2 反應溫度對酯化率的影響

固定反應壓力11 MPa，反應時間15 h，水分添加量為2%，酶用量為4%，乙酸與葵花油底物比為3∶1，反應溫度分別取45、50、55、60、65℃進行酯化反應，測定樣品的酯化率。

如圖2所示，隨著溫度的升高，酯化率逐漸增大，當達到一定溫度時，再升高溫度，酯化率反而呈下降趨勢。這是由于隨著溫度的增加，一方面，反應物在超臨界流體中的溶解度會有很大提高，另一方面，酶的催化效率升高，當溫度到達55℃時，酶的結(jié)構(gòu)逐漸被破壞使其活性逐漸下降，從而影響了反應效果。由此可見，此催化酯化反應中脂肪酶Lipozyme RM IM的最適溫度在55℃。本試驗選擇反應溫度為55℃。

圖2 反應溫度對酯化率的影響

2.1.3 反應時間對酯化率的影響

固定反應壓力11 MPa，反應溫度55℃，水分添加量為2%，酶用量為4%，乙酸與葵花油底物比為3∶1，反應時間分別取 5、10、15、20、25 h進行酯化反應，測定樣品的酯化率。

如圖3所示，隨著反應時間的延長，酯化率不斷提高，當反應時間達到15 h后，酯化率先下降后趨于平緩，這是因為隨著反應時間的延長，底物濃度和酶活力開始降低，反應速度逐漸減小，酯化率最后趨于平緩，是因為酯化反應達到平衡后略向逆反應方向進行的緣故。綜合考慮反應時間以15 h為宜。

圖3 反應時間對酯化率的影響

2.1.4 體系水份添加量對酯化率的影響

固定反應壓力11 MPa，反應溫度55℃，反應時間15 h，酶用量為4%，乙酸與葵花油底物比為3∶1，水分添加量分別取1%、2%、3%、4%、5%進行酯化反應，測定樣品的酯化率。

如圖4所示，隨著水分的增加，酯化率先升高后降低，結(jié)合到葵花油中的乙酸含量隨著水分的增加而提高，這是由于少量水的存在，起著增加酶活性的作用，促進酸解反應，而且少量水分有利于保持酶活性部位構(gòu)象，使酶充分發(fā)揮活力。當水分添加量不足2%時酯化率低，是因為含水量不足以使酶發(fā)揮其最大活性；當反應體系中水分添加量超過2%時酯化率下降，是由于水量過多時會在酶的活性位點上形成一層水的屏障，阻礙了酶促反應的進行。因此，體系水分添加量為2%較為適宜。

圖4 體系水分添加量對酯化率的影響

2.1.5 酶用量對酯化率的影響

固定反應壓力11 MPa，反應溫度55℃，反應時間15 h，水分添加量為2%，乙酸與葵花油底物比為3∶1，酶用量分別取 1%、2%、3%、4%、5%進行酯化反應，測定樣品的酯化率。

如圖5所示，隨著酶用量的增加，酯化率隨之提高后略有下降，原因是隨著酶用量的增加，酶分子與底物接觸的機會增加，反應速度加快，酯化反應程度提高，但當酶用量達到4%后，酯化率略有下降趨勢，這是由于酶量大時，水量不足，水解慢，偏酯的生成量少，限制后續(xù)酯化反應，進而對酯化率造成影響。故酶用量選擇4%最為適宜。

圖5 酶用量對酯化率的影響

2.1.6 底物物質(zhì)的量比對酯化率的影響

固定反應壓力11 MPa，反應溫度55℃，反應時間為15 h，水分添加量為2%，酶用量為4%，乙酸與葵花油底物比分別為 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1進行酯化反應，測定樣品的酯化率。

底物比是影響葵花油中短鏈脂肪酸含量的主要因素。如圖6所示，隨著底物比的增加，即結(jié)合到葵花油中的乙酸含量提高，酯化率先升高后降低，當乙酸／葵花油的比例達到3∶1時，酯化率最高。當?shù)孜锉瘸^3∶1后，酯化率降低，這是因為當羧基供體的量持續(xù)增大時，葵花油和酶的含量相應降低，可能會因底物抑制或其他（如擴散速度）的限制而影響到葵花油中的乙酸插入量。綜上所述，底物比為3∶1較為適宜。

圖6 底物物質(zhì)的量比對酯化率的影響

2.2 最佳工藝參數(shù)的確定

由單因素試驗可以看出在酯化過程中，水分添加量、酶用量、反應溫度對反應的影響較大。因此，確定在水分添加量2%，酶用量4%，反應溫度55℃基礎上采用中心組合設計（Box-Benhnken），以水分添加量（A）、酶用量（B）和反應溫度（C）為自變量，酯化率（R1）為響應值設計響應面試驗。自變量水平編碼見表1，試驗設計方案及結(jié)果見表2。

表1 因素水平編碼表

表2 響應面設計方案及試驗結(jié)果

利用Design Expert7.0.0軟件對試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表3（P＜0.05為顯著項）。

表3 方差分析結(jié)果

通過對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到酯化率（R1）對水分添加量、酶用量和反應溫度（C）的回歸方程為：

由表3可知，方程因變量與自變量之間的線性關系明顯，該模型回歸顯著（P＜0.000 1）失擬項不顯著（P＞0.05），并且該模型 R2＝98.53%96.64%，回歸模型與實際情況擬合很好，可以用該模型預測超臨界CO2狀態(tài)下酶法酯化的實際酯化率情況。圖7～圖9分別給出了酶用量與水分添加量，反應溫度與水分添加量，反應溫度與酶用量的交互作用對酯化率的響應曲面圖。

圖7 水分添加量與酶用量對酯化率影響的響應面圖

將反應中的反應溫度固定在0水平上，可以得到水分添加量和酶用量交互作用對酯化率的影響。由圖7可以看出，加酶量不變時，隨著水分含量的增加，酯化率含量呈現(xiàn)逐漸增加，當達到一定值后略有降低的趨勢；水分添加量不變時，隨著加酶量的增加，酯化率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。在水分添加量為2%～2.5%，酶用量約為4%時，酯化率在65%以上。

圖8 水分添加量和反應溫度對酯化率影響的響應面圖

將反應模型中的加酶量固定在0水平上，可以得到水分添加量和反應溫度交互作用對酯化率的影響。由圖8可以看出，水分添加量不變時，隨著反應溫度的增加，乙酸酯化率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢；反應溫度不變時，隨著水分添加量的增加，酯化率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。在水分添加量約為2%～2.5%，反應溫度約為55℃時，酯化率在65%以上。

圖9 酶用量和反應溫度對酯化率影響的響應面圖

將反應中的反應溫度固定在0水平上，可以得到酶用量和反應溫度交互作用對酯化率的影響。由圖9可以看出，反應溫度不變時，隨著酶用量的增加，酯化率呈現(xiàn)先增加后略有降低的趨勢；酶用量不變時，隨著反應溫度的升高，酯化率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。在加酶量為4%～4.5%，反應溫度約為55℃時，酯化率在65%以上。

應用響應面優(yōu)化分析方法對回歸模型進行分析，尋找最優(yōu)響應結(jié)果見表4。

表4 響應面尋優(yōu)結(jié)果

為檢驗響應面方法所得結(jié)果的可靠性，按照上述整理值進行試驗，得到的酯化率為65.3%，預測值與試驗值之間的良好擬合性證實了模型的有效性，表明所得出的回歸方程可以很好的反應水分添加量、酶用量和反應溫度與酯化率的關系。

2.3 超臨界狀態(tài)下合成的長短鏈三酰甘油

在超臨界狀態(tài)下，用脂肪酶Lipozyme RM IM催化合成長短鏈三酰甘油。以酯化率為指標，以壓力11 MPa，反應溫度56℃，反應時間15 h，水分添加量為2.5%，乙酸與葵花油底物比為3∶1，酶用量4%的條件下合成長短鏈三酰甘油。在此參數(shù)下進行驗證試驗，試驗結(jié)果顯示酯化率可達65.3%（見圖10，圖11）。

圖10 乙酸甲酯標準品標樣的GC圖

圖11 長短鏈甘油酯的GC圖

3 結(jié)論

在超臨界CO2狀態(tài)下，利用脂肪酶Lipozyme RM IM催化酯化反應合成長短鏈三酰甘油，通過單因素和響應面優(yōu)化試驗確定了最佳的制備工藝：反應壓力11 MPa、反應溫度56℃、反應時間15 h、體系水分添加量2.5%、酶用量4%、底物物質(zhì)的量比3∶1。在最佳條件下進行酯化反應，酯化率為65.3%，用此方法制得的長短鏈脂肪酸三酰甘油食用安全，與普通葵花油相比，熱量值降低了大約50%。

［1］Casimir C Akoh，PH D.Fat replacers［J］.Food Technology，1988，52（3）：47-53

［2］Ney K H.Sensogamme，eine methodische erweiterung der aromagramme［J］.Gordian，1988，88（1）：19

［3］董建林，曹萬新，郜順成.低熱量油脂（脂肪代用品）的市場需求及研究開發(fā)現(xiàn)狀［J］.中國油脂，2000，25（3）：5-6

［4］谷利偉.新一代的低熱油脂 salatrim［J］.食品科技，1999（2）：11-12

［5］鄭建仙.低熱量食品［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，2002

［6］何川，王海清.低熱量油脂的制備和精煉工藝研究［J］.中國油脂，2005，30（3）：14-15

［7］孫志芳，高蔭榆，鄭淵月.功能性油脂的研究進展［J］.中國食品添加劑，2005（3）：4-7

［8］劉如燦，單良金，青哲，等.葵花籽油基低熱量油脂的酯交換法制備工藝［J］.油脂工程技術，2010（10）：3-7

［9］張晶，周家春.低熱量油脂Salatrim研制［J］.糧食與油脂，2004（1）：5-8

［10］王春玲.低熱量油脂的現(xiàn)狀和展望［J］.山東教育學院學報，2009（5）：89-90

［11］Cumming JH，Rombeau J L，Sakata T（eds）.Physiological and clinical aspects of short-chainfatty acids［M］.Cambridge：cambridge universitypress，1995

［12］石階平，韓雅珊.兩種脂肪代用品對大鼠脂質(zhì)代謝的影響［J］.營養(yǎng)學報，2002（2）：11-14

［13］曹萬新，孟橘，倪芳妍，等.低熱量油脂的發(fā)展與應用研究現(xiàn)狀［J］.油脂化學，2011，36（6）：50-54

［14］G Livesey，D Buss，P Coussement，et al.Suitability of traditional energy values for novel foods and food ingredients［J］.Food Control，2000，11（4）：249-289

［15］Hammond D A，Karel M，Klibanov A M，et al.Applied biochemistry enzymatic reaction in supercritical gases［J］.Appl Biochem Biotechnol，1985，11（5）：393-400

［16］Klemann L P，AJi K，ChrysamM，et al.Random nature of triacylglycerols produced by the catalyzed interesterification of short-and long-chain fatty acid triglyceride precursors［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1994，42（2）：442-446

［17］寇秀穎，于國萍.脂肪和脂肪酸甲酯化方法的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2005，26（2）：46-47.