響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取紅皮云杉多酚工藝

周 芳，趙 鑫，宮 婕，劉海鵬，王振宇

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090；3.黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，黑龍江哈爾濱150020）

紅皮云杉（Picea koraiensis Nakai）是松科云杉屬常綠喬木，分布于大、小興安嶺、完達(dá)山及張廣才嶺，吉林長白山等地。松屬植物中含有萜類、多酚類、生物堿等多種生物活性成分[1]，具有抗氧化、抗病毒及抗菌等生物活性[2-3]。植物多酚廣泛存在于植物體的葉、木、皮、殼和果肉中，許多針葉樹皮中植物多酚含量高達(dá)20%～40%[4]。近年來研究表明，多酚具有抗心腦血管疾病、抗衰老、清除自由基、抗癌、抗輻射等多種生理功能[5-9]，可應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、精細(xì)化工等領(lǐng)域。這類物質(zhì)來自于天然植物，基本上不存在毒副作用，在日本有人將其稱為第七類營養(yǎng)素。

微波輔助萃取技術(shù)是近年來發(fā)展起來的提取方法，與傳統(tǒng)提取方法相比，具有高效、快速、節(jié)能、污染小、質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點，特別適合于處理熱敏性組分或從天然物質(zhì)中提取有效成分，己被應(yīng)用于植物成分的提取[10-12]。目前，采用微波輔助萃取技術(shù)提取紅皮云杉多酚的研究尚未見報道。本文以紅皮云杉球果為原料，采用微波輔助提取法從中提取多酚，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，建立回歸模型，可用于預(yù)測紅皮云杉多酚得率。本文研究成果為紅皮云杉多酚的深入研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅皮云杉球果 采自長白山；無水乙醇、石油醚 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；無水碳酸鈉 天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；沒食子酸 Sigma公司；福林酚試劑 天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑；所用化學(xué)試劑 均為分析純。

高速萬能粉碎機 天津泰斯特儀器公司；T6紫外可見分光光度計 北京普析通用公司；XH-300A超聲微波聯(lián)合萃取儀 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；NDJ-1電熱恒溫水浴鍋 北京醫(yī)療電子儀器廠；電子天平 上海精天電子儀器廠；TDL-5臺式離心機 上?？婆d儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多酚提取工藝過程 紅皮云杉球果→干燥→粉碎（40目）→除脂→干燥→微波輔助提取→離心→取上清液→定容并測量吸光度→計算多酚得率。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別準(zhǔn)確量取沒食子酸標(biāo)樣溶液（100μg/mL）0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35mL于10mL比色管中，加蒸餾水至2mL，搖勻后加入1.0mL福林酚試劑，4min后加入1.0mL 10%的碳酸鈉溶液，25℃水浴下保持2h后，在765nm處測定吸光度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.0214x+0.0033，R2=0.9992。

1.2.3 紅皮云杉多酚得率的測定 采用福林酚法[13]。準(zhǔn)確吸取1mL紅皮云杉球果提取液于10mL比色管中，加蒸餾水至總體積為2mL。加入1.0mL福林酚試劑后搖勻，4min后加入1.0mL 10%碳酸鈉溶液，25℃水浴下保持2h后，在765nm處測定吸光度值。將吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，按下式計算樣品中多酚的得率：

式中：Y—多酚得率（%），A—吸光值，b—標(biāo)準(zhǔn)曲線截距，N—稀釋倍數(shù)，V—溶劑體積（mL），a—標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，M—紅皮云杉球果粉末質(zhì)量（g）。

1.2.4 單因素實驗 通過單因素實驗，分別考察料液比、乙醇濃度、提取時間、微波功率對紅皮云杉多酚得率的影響。每個實驗條件重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4.1 料液比對多酚得率的影響 精確稱取6份2.00g的紅皮云杉球果粉末，在乙醇濃度為40%、微波功率為200W、提取時間為40s的條件下，料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）。

1.2.4.2 乙醇濃度對多酚得率的影響 精確稱取6份2.00g的紅皮云杉球果粉末，在料液比為1∶20、微波功率為200W、提取時間為40s的條件下，乙醇濃度分別為0%、20%、40%、60%、80%、100%。

1.2.4.3 提取時間對多酚得率的影響 精確稱取6份2.00g的紅皮云杉球果粉末，在料液比為1∶20、乙醇濃度為40%、微波功率為200W的條件下，提取時間分別為10、20、30、40、50、60s。

1.2.4.4 微波功率對多酚得率的影響 精確稱取6份2.00g的紅皮云杉球果粉末，在料液比為1∶20、乙醇濃度為40%、提取時間為40s的條件下，微波功率分別為100、200、300、400、500、600W。

1.2.5 響應(yīng)面法實驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以料液比、微波功率、提取時間三個因素為自變量，以多酚得率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計法優(yōu)化多酚提取工藝條件，分析軟件為Statistica 6.0。設(shè)計三因素三水平響應(yīng)分析實驗，中心點實驗重復(fù)5次，實驗的因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素和水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 微波功率對多酚得率的影響 由圖1可知，在微波功率為100～300W時，隨著微波功率的增加，多酚得率明顯增加，且明顯呈正相關(guān)關(guān)系，在微波功率為300W時，多酚得率最高；在微波功率為300～500W時，多酚得率明顯下降，且基本呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。這是由于隨著微波功率的增加，其產(chǎn)生的熱效應(yīng)隨之增大，有利于多酚的溶出，表現(xiàn)為得率明顯增加。但是在功率超過300W后，溶劑中大量的水分子產(chǎn)生的熱效應(yīng)使溶液溫度升高過快，加速了多酚的降解，多酚損失較大，因而多酚得率有所下降。因此，選擇微波功率為300W。

圖1 微波功率對多酚得率的影響Fig.1 Effect of microwave power on the yield of polyphenol

2.1.2 料液比對多酚得率的影響 由圖2可知，在料液比在1∶10～1∶30g/mL時，隨料液比的增加，多酚得率隨之增加，且呈明顯正相關(guān)關(guān)系，在料液比為1∶30g/mL時，多酚得率最高；在料液比為1∶30～1∶60g/mL時，隨溶劑量的增加，多酚得率有所下降。這是由于增加濃度梯度可增加提取效果，提高料液比對有利于多酚的提取，但當(dāng)料液比達(dá)到某一限度時，再提高溶劑量則相當(dāng)于對多酚溶液的稀釋，降低了濃度梯度，同時，更多的溶劑也可能消耗了微波的能量，所以多酚得率反而有所下降。因此，選擇料液比為1∶30g/mL。

2.1.3 乙醇濃度對多酚得率的影響 由圖3可知，在乙醇濃度為0%～40%時，隨著乙醇濃度的增加，多酚得率隨之增加，且明顯呈正相關(guān)關(guān)系，乙醇濃度為40%，多酚得率最高；隨著乙醇濃度繼續(xù)增加，多酚得率明顯下降，這可能是因為乙醇濃度為40%時，與紅皮云杉多酚的極性最為相近，多酚的溶解度最大。因此，選擇乙醇濃度為40%。

圖2 料液比對多酚得率的影響Fig.2 Effect of the ratio of material to liquid on the yield of polyphenol

圖3 乙醇濃度對多酚得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of polyphenol

2.1.4 提取時間對多酚得率的影響 由圖4可知，在提取時間為10～40s時，隨著提取時間的增加，多酚得率明顯增加，且基本呈正相關(guān)關(guān)系；在提取時間為40～60s時，多酚得率增加緩慢，在提取時間為40s時基本達(dá)到多酚得率的最高值，在提取時間為40～60s時，多酚得率增加緩慢，提取量已基本達(dá)到飽和，并且得率沒有隨著提取時間的增加而出現(xiàn)下降的趨勢，這說明微波的熱效應(yīng)在提高多酚得率的同時，并沒有明顯加速多酚的降解。因此，選擇提取時間為40s。

圖4 提取時間對多酚得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of polyphenol

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計原理，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選擇料液比、微波功率、提取時間3個因素，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面實驗設(shè)計，共17個實驗點，實驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and the result

2.2.2 數(shù)學(xué)模型的建立及顯著性檢驗 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，方差分析結(jié)果見表3，得到的回歸模型為：Y=17.1900+0.5038X1-0.1312X2+0.9850X3+ 0.0325X1X2+0.0550X1X3-0.0950X2X3-2.2438X12-1.6937X22-0.8513X32。

由表3可知，回歸模型的顯著性水平p＜0.0001，達(dá)到極顯著水平；失擬項p=0.052＞0.05，差異不顯著，且相關(guān)系數(shù)R2=0.9945，表明實測值與預(yù)測值高度相關(guān)。綜上所述，建立的回歸模型擬合度高，可用該模型較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系。因此，可用該模型預(yù)測微波輔助提取紅皮云杉多酚的工藝條件。

表3 回歸模型方差分析Table 3 The variance analysis of regression model

回歸模型顯著性檢驗結(jié)果見表4。t檢驗結(jié)果表明，料液比、提取時間的一次項和二次項、微波功率的二次項對多酚得率的影響極顯著，而微波功率的一次項和交互項對多酚得率的影響不顯著。各因素對多酚得率影響程度大小順序為：X3（提取時間）＞X1（料液比）＞X2（微波功率）。

表4 回歸模型顯著性檢驗Table 4 The significance test of regression model

圖5 料液比和微波功率對多酚得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plot for the effect of ratio of material to liquid and microwave power on the yield of polyphenol

圖6 料液比和提取時間對多酚得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot for the effect of ratio of material to liquid and extraction time on the yield of polyphenol

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化與驗證實驗 利用Statistica 6.0軟件，繪制各因素對紅皮云杉多酚得率影響的響應(yīng)曲面和等高線圖，結(jié)果見圖5～圖7。如果一個響應(yīng)曲面的坡度較平緩，表明隨著處理條件的變化，響應(yīng)值變化較?。欢绻粋€響應(yīng)曲面的坡度較陡峭，表明隨著處理條件的變化，響應(yīng)值變化較大。

圖7 微波功率和提取時間對多酚得率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plot for the effect of microwave power and extraction time on the yield of polyphenol

由圖5～圖7可知，料液比與微波功率、料液比與提取時間、微波功率與提取時間等兩兩因素的交互作用呈現(xiàn)出山丘形或馬鞍形曲面，表明各交互作用對響應(yīng)值有明顯影響，并且3個等高線中最小橢圓的中心都在各因素值-1～+1范圍內(nèi)，說明響應(yīng)值的最大值在3個因素設(shè)計的范圍內(nèi)。從等高線的疏密度可以判斷出，料液比對響應(yīng)值的影響大于微波功率、提取時間對響應(yīng)值的影響大于料液比、提取時間對響應(yīng)值的影響大于微波功率。

綜上所述，提取時間對多酚得率的影響最大，料液比次之，微波功率的影響相對較小。通過計算，得到的最佳工藝條件為：料液比為1∶31.19、微波功率為294.6W、提取時間為45.85s。在此條件下，紅皮云杉多酚的得率為17.51%?？紤]到實際操作條件，將工藝條件修正為料液比1∶31、微波功率295W、提取時間46s。在此條件下，進(jìn)行驗證實驗，實際測得的得率為17.38%，實測值與預(yù)測值相對誤差＜1%，說明回歸模型擬合度高，可用于優(yōu)化微波輔助提取紅皮云杉多酚的工藝條件，具有實用價值。

3 結(jié)論

本實驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對微波輔助提取紅皮云杉多酚的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，料液比、提取時間對紅皮云杉多酚得率均有顯著影響，最佳工藝條件為：料液比1∶31、微波功率295W、提取時間46s，乙醇濃度40%。驗證實驗結(jié)果表明，回歸模型擬合度高，得率可達(dá)到17.38%，可用于優(yōu)化微波輔助提取紅皮云杉多酚的工藝條件，具有實用價值。

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