紅皮云杉球果原花青素提取優(yōu)化及抗氧化活性評(píng)價(jià)

鄭洪亮，何 飛，騰 飛，王 萍，王振宇，2，*，馬思慧

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150086）

近年來，人們對(duì)自身健康越來越關(guān)注，掀起了天然產(chǎn)物開發(fā)熱潮。尤其是具有強(qiáng)抗氧化活性的植物源原花青素，來源豐富，廣泛分布于植物界，有多樣的生理功效。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)記載，葡萄籽中提取的原花青素具有抗腫瘤、抗氧化、抗動(dòng)脈硬化、防治冠心病與中風(fēng)等心腦血管疾病以及抗菌等作用[1]。以蘋果、茶、葡萄、柑橘等為原料已經(jīng)成功開發(fā)出原花青素[2]，原花青素的獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)與其獨(dú)特化學(xué)性質(zhì)密切相關(guān)，在食品、醫(yī)藥、化妝品等許多行業(yè)已經(jīng)開發(fā)利用[3]。

紅皮云杉是常綠喬木，松科云杉屬，學(xué)名Picea koraiensis Nakai，在吉林山區(qū)海拔1400～1800m地帶、東北小興安嶺地區(qū)分布比較豐富，球果呈卵狀圓柱形或圓柱狀矩圓形，是我國(guó)重要的生物資源。近年來，對(duì)松科植物原花青素的提取國(guó)內(nèi)外研究不多。Duncan[4]以松樹皮為原料，在脫氧熱水中浸提（1min～20h）得到原花青素粗提物；黃啟亮等[5]以松針為原料提取原花青素，并對(duì)其主要生物活性進(jìn)行研究；李童等[6]以云南思茅松樹皮為原料，研究思茅松原花青素的降度提取工藝。秦永劍等[7-8]研究了云南松多聚原花青素降解產(chǎn)物抗氧化活性和低聚原花青素抗氧化活性。

本研究考察了溫度、料液比、溶劑濃度和提取時(shí)間對(duì)原花青素得率的影響，再通過響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)，確定提取最優(yōu)條件。利用D4020大孔樹脂對(duì)紅皮云杉原花青素粗提物進(jìn)行純化，然后對(duì)紅皮云杉原花青素精制物進(jìn)行抗氧化活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，較系統(tǒng)的分析了原花青素的提取優(yōu)化工藝及抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅皮云杉球果 黑龍江省葦河林業(yè)局提供，采集時(shí)間為2011年9月，將球果鱗片（去掉中間木質(zhì)軸）低溫干燥后粉碎過80目篩后-20℃密封冷凍，備用；1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、ABTS、5，6-聯(lián)苯基-3-（2-吡啶基）-1，2，4-三吖嗪（Ferrozine）、維生素E 美國(guó)Sigma公司；兒茶素 色譜級(jí)，上海源葉公司；FRAP試劑盒 碧云天試劑公司；抗壞血酸、濃硫酸、甲醇、硫酸亞鐵、30%過氧化氫、三氯乙酸（TCA）、濃鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、硫酸亞鐵、氯化亞鐵、無水乙醇 國(guó)產(chǎn)分析純；蒸餾水。

RT-6000酶標(biāo)儀 深圳雷社生命科技股份有限公司；TDL-5臺(tái)式離心機(jī) 上?？婆d儀器有限公司；T6紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用公司；旋轉(zhuǎn)R-205B蒸發(fā)儀 上海申勝儀器公司；NDJ-1電熱恒溫水浴鍋 北京醫(yī)療電子儀器廠；FJ-200高速萬能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；YP200lN電子天平 上海精天電子儀器廠；XW-80A漩渦混合器 江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 采用香草醛-硫酸法[9]。

配制兒茶素不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21、0.24、0.27、0.30mg/mL。精確移取1.0mL分別置于10支10mL相同規(guī)格試管中，然后分別加入2.5mL、4%香草醛-甲醇溶液和2.5mL、30%濃硫酸-甲醇溶液，混合均勻，于30℃水浴中避光靜置15min，以甲醇代替顯色劑為空白對(duì)照，在500nm波長(zhǎng)下測(cè)定溶液吸光值，平行測(cè)樣三次。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并擬合回歸方程。根據(jù)方程計(jì)算提取物中花青素濃度，然后根據(jù)樣品質(zhì)量進(jìn)一步換算成得率。

1.2.2 紅皮云杉球果原花青素提取優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

a.乙醇濃度對(duì)提取效果的影響：固定提取時(shí)間4h，料液比1∶20（g/mL），提取溫度為60℃，分別以乙醇濃度0%、20%、40%、60%、80%、100%提取，并計(jì)算原花青素得率。

b.提取溫度對(duì)提取效果的影響：固定提取時(shí)間4h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比1∶20（g/mL），分別以提取溫度30、40、50、60、70、80℃提取，并計(jì)算原花青素得率。

c.料液比對(duì)提取效果的影響：固定提取時(shí)間4h，提取溫度50℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，分別以料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）提取，并計(jì)算原花青素得率。

d.提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響：固定提取溫度50℃，料液比1∶40（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，分別以提取時(shí)間1、2、3、4、5、6h提取，并計(jì)算原花青素得率。

1.2.2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以料液比（X1）、提取時(shí)間（X2）、提取溫度（X3）、乙醇濃度（X4）4個(gè)因素為自變量，以原花青素得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)見表1，原花青素得率公式如下。

式中，ω為原花青素得率（mg/g）；C為原花青素的質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為提取液體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量（g）。

表1 紅皮云杉球果原花青素提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Coded values and corresponding actual values of factors in BBD design

1.2.3 紅皮云杉球果原花青素粗提物的純化[10]原花青素提取物2.5mg/mL，作為上樣液。在處理好的D4020型大孔吸附樹脂柱加入上樣液，徑高比1∶25，以2.0BV/h的流速上樣，吸附4h，將大孔樹脂柱用蒸餾水洗至流出液呈無色后，用70%、4BV的乙醇對(duì)大孔樹脂吸附柱洗脫，洗脫流速1.5BV/h，將70%乙醇洗脫液收集，減壓濃縮至無醇味后，備用。

1.2.4 原花青素的抗氧化能力評(píng)價(jià)

1.2.4.1 DPPH·清除作用 紅皮云杉球果原花青素提取物精制后，配制成濃度為10、20、30、40、50、60、70、80、90μg/mL的溶液。分別在10.0mL試管中加入2.0mL上述不同濃度樣品溶液，之后加入2.0mL 1×10-3mol/L DPPH·溶液（用95%乙醇配制），混合均勻，暗處反應(yīng)30min，在517nm處測(cè)定其吸光值，用2.0mL無水乙醇替代2.0mL樣品液作參比，測(cè)定吸光值A(chǔ)，同時(shí)以乙醇溶液為參比測(cè)定DPPH空白溶液吸光度值A(chǔ)0，用Trolox作陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)做平行實(shí)驗(yàn)[11]。計(jì)算DPPH·清除率RSA：

以清除率RSA對(duì)樣品濃度進(jìn)行回歸處理，計(jì)算提取物的半數(shù)抑制濃度（IC50）數(shù)值。

1.2.4.2 ABTS+·清除作用 在96孔板的樣品檢測(cè)孔和對(duì)照孔中依次加入45μL不同濃度的樣液；空白對(duì)照孔中加入45μL PBS緩沖液；然后檢測(cè)孔和空白孔中依次加入300μL ABTS+·自由基工作液，對(duì)照空中加入等量的PBS緩沖液，避光反應(yīng)6min，于734nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值[12]。

其中：A1為加測(cè)定溶液后ABTS+·的吸光值；A2為測(cè)定溶液在測(cè)定波長(zhǎng)下的吸光值；A3為未加測(cè)定溶液時(shí)ABTS+·的吸光值。

1.2.4.3 總抗氧化能力的測(cè)定 采用FRAP法[13]。

a.FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)備：稱取27.8mg FRAP試劑盒提供的FeSO4·7H2O，溶解并定容到1mL，此時(shí)濃度即為100mmol/L。取適量100mmol/L FeSO4溶液稀釋至0、100、200、300、400、500μg/L?？梢允褂谜麴s水或樣品配制溶液配制標(biāo)準(zhǔn)品。FeSO4溶液宜新鮮配制使用。

b.總抗氧化能力的測(cè)定：96孔板的檢測(cè)孔中加入180μL FRAP工作液（現(xiàn)用現(xiàn)配）?？瞻讓?duì)照孔中加入40μL蒸餾水；樣品檢測(cè)孔內(nèi)加入40μL各種濃度的樣品或Trolox作為陽(yáng)性對(duì)照，輕輕混勻。37℃孵育3～ 5min后測(cè)定A593。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的總抗氧化能力[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 原花青素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

原花青素質(zhì)量濃度與吸光度曲線的回歸方程如圖1所示?；貧w方程y＝2.1658x+0.0178，R2≈0.9995，式中：y—溶液在500nm處的吸光度；x—溶液中的原花青素質(zhì)量濃度（mg/mL）。

圖1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Catechin standard curve

2.2 紅皮云杉球果原花青素提取單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響 乙醇濃度對(duì)原花青素提取效果的影響如圖2所示。

圖2 乙醇濃度對(duì)原花青素提取得率的影響Fig.2 Effect of different ethanol concentrations on extraction rate

濃度小于60%時(shí)，隨著乙醇濃度增大，溶劑中原花青素含量也增加；大于60%時(shí)，隨著乙醇濃度增大，溶劑中原花青素含量有所降低，可能是由于乙醇濃度繼續(xù)增加會(huì)加大醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性等成分的溶出，這些成分與原花青素競(jìng)爭(zhēng)，同乙醇水分子結(jié)合，同時(shí)組織的通透性下降，從而導(dǎo)致原花青素的溶解度下降[14]，因此乙醇濃度選為60%。

2.2.2 提取溫度對(duì)提取效果的影響 溫度對(duì)原花青素提取效果的影響如圖3所示。

圖3 提取溫度對(duì)原花青素提取得率的影響Fig.3 Effect of different temperature on extraction rate

溫度升高，分子熱運(yùn)動(dòng)加快，有利于傳質(zhì)過程的進(jìn)行。小于50℃時(shí)，隨著溫度增加，紅皮云杉原花青素大量溶出，從而溶劑中其含量增加；溫度超過50℃而小于70℃時(shí)，原花青素的含量開始下降，是由于溫度升高導(dǎo)致原花青素開始降解，其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[15]；當(dāng)溫度超過70℃時(shí)，原花青素溶解量又開始略有增加，是因?yàn)榭赡芘c較高溫度下，其他雜質(zhì)物質(zhì)大量溶出有關(guān)[16]，故50℃為原花青素最佳提取溫度。

2.2.3 料液比對(duì)提取效果的影響 料液比對(duì)原花青素提取效果的影響圖4所示。

由圖4可知料液比對(duì)得率影響較大。當(dāng)料液比大于1∶10（g/mL）時(shí)，隨著料液比增加，原花青素得率明顯增加，這是因?yàn)橛袡C(jī)溶劑能抑制原花青素與植物中的蛋白、多糖等物質(zhì)結(jié)合，增加料液比有利于原花青素更大限度的浸出[17]，但料液比繼續(xù)增大又會(huì)增加原花青素與空氣接觸的機(jī)會(huì)，而原花青素容易氧化降解，所以得率有所降低，同時(shí)料液比增加還會(huì)造成原料的浪費(fèi)[18]，因此選擇料液比為1∶40（g/mL）。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響 提取時(shí)間對(duì)原花青素提取效果的影響如圖5所示。

在提取時(shí)間低于2h時(shí)，原花青素濃度隨時(shí)間增長(zhǎng)而增大，溶劑中原花青素濃度低，紅皮云杉球果粉末原花青素含量高，兩個(gè)體系有高濃度差，傳質(zhì)動(dòng)力大，原花青素浸出速率快[19]。2h后，原花青素濃度隨時(shí)間變化的得率減小，是由于隨著時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，可能是由于原花青素對(duì)熱敏感，時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)造成其被氧化變性，考慮到縮短工藝時(shí)間，提高效率，最佳提取時(shí)間為2h。

2.3 紅皮云杉球果原花青素提取響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

表2 響應(yīng)面分析及結(jié)果Table 2 Experiment design and results of response surface method

2.3.1 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了乙醇濃度、溫度、時(shí)間、料液比的4因素3水平響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，其因素水平見表1，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

選用中心復(fù)合模型，做四因素三水平共29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)（5個(gè)中心點(diǎn)）的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。這29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)分為兩類：其一是析因點(diǎn)，自變量取值在各因素所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共有24個(gè)析因點(diǎn)；其二是零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。紅皮云杉球果原花青素提取率為響應(yīng)值（指標(biāo)值）。使用響應(yīng)曲面法分析軟件對(duì)表2中原花青素得率大小的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，分析后得出的回歸方程為：y= 142.63+1.65A+2.55B-3.53C+8.79D+0.49AB+1.50AC+ 1.07AD+1.33BC+1.12BD+2.86CD-24.14A2-16.14B2-16.90C2-10.95D2。

采用響應(yīng)面法軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，其結(jié)果見表3。

模型誤差p＜0.0001，顯著；失擬項(xiàng)p=0.2120＞0.05，差異不顯著，說明了方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合的情況好，實(shí)驗(yàn)誤差?。蛔儺愊禂?shù)值為3.47，說明了實(shí)驗(yàn)可靠；模型的校正系數(shù)R2adj=0.9366，說明該模型能解釋93.66%響應(yīng)值的變化，僅有總變異大約6%不能用此模型來解釋。

時(shí)間、料液比的一次項(xiàng)，乙醇濃度、溫度、時(shí)間、料液比的二次項(xiàng)對(duì)得率的影響極顯著；溫度的一次項(xiàng)影響為顯著；乙醇濃度及4因子的交互的影響不顯著。通過F值還能看出，實(shí)驗(yàn)中各因素對(duì)原花青素得率的影響大小順序?yàn)椋毫弦罕龋紩r(shí)間＜溫度＜乙醇濃度。此回歸模型得出BBD實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)提取條件為：乙醇濃度為60.42%，溫度50.91℃、時(shí)間1.97h、料液比為1∶44（g/mL），此時(shí)原花青素得率為72.46mg/g。

2.3.2 響應(yīng)面結(jié)果驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為檢驗(yàn)響應(yīng)面法優(yōu)化紅皮云杉球果原花青素提取工藝的可靠性，采用優(yōu)化后提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，參考實(shí)際操作，將優(yōu)化后工藝參數(shù)調(diào)整為：乙醇濃度為60%，溫度51℃、時(shí)間2h、料液比為1∶44（g/mL），在此最佳條件下，提取紅皮云杉球果原花青素得率為（71.23±0.25）mg/g，與模型預(yù)測(cè)值的比較誤差為1.70%。

2.4 紅皮云杉球果原花青素精制物的制備

紅皮云杉球果原花青素經(jīng)D4020的純化，純化前原花青素純度為29.45%±1.33%，純化后純度為68.57% ±1.78%，回收率為88.27%±3.18%。

2.5 紅皮云杉球果原花青素精制物的抗氧化評(píng)價(jià)

2.5.1 紅皮云杉球果原花青素精制物對(duì)DPPH·的清除作用 如圖6所示，紅皮云杉球果原花青素精制物對(duì)DPPH·自由基具有顯著的清除作用。以Trolox做陽(yáng)性對(duì)照，在90μg/mL時(shí)清除率分別為90.7%±2.07%和69.58%±1.56%。紅皮云杉球果原花青素精制物和Trolox在實(shí)驗(yàn)濃度的IC50值分別為（41.04±1.12）μg/mL、（16.62±0.98）μg/mL。從總體上看，紅皮云杉球果原花青素精制物清除DPPH·自由基能力較強(qiáng)，但低于Trolox。

2.5.2 紅皮云杉球果原花青素精制物對(duì)ABTS+·的清除作用 如圖7所示，不同濃度紅皮云杉球果原花青素精制物對(duì)ABTS+·自由基均具有很顯著的清除作用。以Trolox做陽(yáng)性對(duì)照，在相同濃度條件下，陽(yáng)性對(duì)照Trolox的清除率均超過紅皮云杉球果原花青素精制物。紅皮云杉球果原花青素精制物和Trolox在實(shí)驗(yàn)濃度的IC50值分別為（20.45±1.08）μg/mL、（32.94± 0.65）μg/mL。從總體上看，紅皮云杉球果原花青素精制物具有很強(qiáng)的清除ABTS+·自由基能力，接近于陽(yáng)性對(duì)照Trolox。

2.5.3 紅皮云杉球果原花青素精制物的還原能力（FRAP） 用FeSO4做標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.123x-0.007，R2=0.9982。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 ANOVA for Response Surface Quadratic Model

圖6 紅皮云杉球果原花青素對(duì)DPPH·清除作用Fig.6 DPPH radical scavenging activity of proanthocyanidins from Picea koraiensis Nakai’s cones

圖7 紅皮云杉球果原花青素對(duì)ABTS+·清除作用Fig.7 ABTS radical scavenging activity of proanthocyanidins from Picea koraiensis Nakai’s cones

圖8 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 FeSO4standard curve

研究表明，植物提取物的抗氧化能力與還原能力之間具有很好的相關(guān)性，還原能力可以作為一種衡量抗氧化能力的指標(biāo)[20]。具有還原能力的物質(zhì)可以通過提供氫質(zhì)子將體系中鐵離子還原，從而抑制自由基的產(chǎn)生[21]。由圖9可以看出，紅皮云杉球果原花青素、Trolox的還原能力與濃度之間呈現(xiàn)出顯著的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R2分別為：0.9959、0.9907。紅皮云杉球果原花青素還原能力略高于Trolox。紅皮云杉球果原花青素、Trolox還原力的半效濃度值（EC50值）依次為（34.95±0.55）、（39.31±0.98）μg/mL。

圖9 紅皮云杉球果原花青素精制物的還原能力Fig.9 Reducing power of proanthocyanidins from Picea koraiensis Nakai’s cones

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)紅皮云杉球果原花青素的提取工藝研究，獲得最佳條件為：乙醇濃度為60%、溫度51℃、時(shí)間2h、料液比為1∶44（g/mL），此時(shí)原花青素得率為（71.23±0.25）mg/g。紅皮云杉球果原花青素精制物的體外抗氧化活性研究結(jié)果表明紅皮云杉球果原花青素精制物具有較強(qiáng)的清除自由基能力和還原能力，并且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍時(shí)，清除ABTS+·能力和還原能力高于陽(yáng)性對(duì)照Trolox。這說明紅皮云杉球果原花青素具有較強(qiáng)的抗氧化能力，有待進(jìn)一步進(jìn)行深入研究。

[1]步文磊，王茵.原花青素的生物活性及作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)（衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)），2007（5）：311-315.

[2]周坦洋，羅芙蓉，白彬.葡萄籽原花青素生物藥理活性的研究進(jìn)展[N].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，46（1）：94-96.

[3]王忠合，朱俊晨，陳惠音.葡萄籽原花青素提取物的保健功能與應(yīng)用[J].食品科技，2006（4）：135-139.

[4]李瑩，李才國(guó).原花青素分離純化方法的研究進(jìn)展[J].食品工程，2008（1）：9-11.

[5]黃啟亮.松針原花青素的制備及主要生物活性研究[D].浙江：浙江師范大學(xué)，2012.

[6]李童，張加研，秦永劍，等.思茅松樹皮原花青素的化學(xué)降度提取工藝[J].西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012（3）：92-96.

[7]秦永劍，田珩，張加研，等.云南松多聚原花青素降解產(chǎn)物抗氧化活性研究[J].西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011（3）：77-79，91.

[8]秦永劍，張加研，于勇剛.云南松低聚原花青素抗氧化活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（19）：11563-11564.

[9]孫蕓，谷文英.硫酸—香草醛法測(cè)定葡萄籽原花青素含量[J].生產(chǎn)與科研經(jīng)驗(yàn)，2009，29（9）：43-45.

[10]楊青，何傳波，魏好程，等.大孔樹脂純化山竹殼原花青素的研究[N].熱帶作物學(xué)報(bào)，2013，34（3）：569-573.

[11]Suksomtip M，Ukpisdawithid S，Bhusawang P，et al.Phenolic compound content，antioxidant and radical-scavenging properties of methanolic extracts from the seed coat of certain thai tamarind cultivars[J].Journal of Food Biochemistry，2010，34（5），916-931.

[12]田福.三種野生漿果花色苷的提取、純化及抗氧化活性研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2008.

[13]羅云.槲皮萬壽菊素-鐵（III）配合物的合成與性質(zhì)[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2010（6）：2512-2515.

[14]Giorgia S，Lorenza T，Dante M D.Effects of extraction time temperature and solvent on concentration and antioxidant activity of grape marc phenolics[J].Journal of Food Engineering，2007（81）：200-208.

[15]汪志慧，孫智達(dá)，謝筆鈞.蓮房原花青素的穩(wěn)定性及熱降解動(dòng)力學(xué)研究[J].食品科學(xué)，2011（7）：77-82.

[16]金海英.沙棘籽原花青素提取單因素實(shí)驗(yàn)研究[J].沙棘，2005（4）：29-32.

[17]黃慧華.多酚-蛋白質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)的影響因素研究[J].食品科學(xué)，2003，24（4）：22-25.

[18]溫志英，曹妍.響應(yīng)面法優(yōu)化花生紅衣原花青素微波輔助提取工藝[N].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2011，26（6）：97-101.

[19]劉新，韓琴，徐潔.荔枝核中原花青素超聲波提取工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（6）：3282-3285.

[20]Yen GC，Chen HY，Peng HH.Evaluation of the cytotoxicity，mutagenicity and anti-mutagenicity of emerging edible plants[J]. Food Chemical Toxicology，2000（11），1045-1053.

[21]Tassoni A，Durante L，F(xiàn)erri M.Combined elicitation of methyl-jasmonate and red light on stilbene and anthocyanin biosynthesis[J].Plant Physiology，2012，169：775-781.