水貂FGF5 基因多態(tài)性及其與毛長性狀的關(guān)聯(lián)分析

劉琳玲，宋興超，叢波，劉宗岳，宋姍姍，楊福合，王桂武

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130112）

貂皮是中國“東北三寶”（新三寶：人參、貂皮、鹿茸）之一，素有“皮中之王”的美稱。貂皮是珍貴的裘皮，其皮板優(yōu)良，輕柔結(jié)實(shí)，毛絨豐厚、細(xì)密、平齊，色澤光潤，有彈性。針毛和絨毛的長度是影響貂皮毛絨質(zhì)量的重要因素之一。水貂育種工作中，毛絨品質(zhì)的選育目標(biāo)為針毛短、平、齊，絨毛細(xì)、密，且針、絨毛比例適中，因此，毛長性狀在水貂新品種選育及培育過程中尤為重要。目前，國內(nèi)飼養(yǎng)量較多的水貂品種主要有紅眼白水貂、丹麥咖啡水貂和美國短毛黑水貂等[1]。通過篩選與水貂毛長性狀相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）位點(diǎn)，運(yùn)用分子標(biāo)記輔助選擇（marker-assisted selection，MAS）方法可以進(jìn)一步加快水貂品種選育進(jìn)展。據(jù)研究表明，成纖維細(xì)胞生長因子5（fibroblast growth factor 5，F(xiàn)GF5）是成纖維細(xì)胞生長因子家族的成員之一。FGF5 基因是通過影響毛囊生長期的長短進(jìn)而影響被毛長度的調(diào)控基因[2-3]。FGF5 基因的隱性突變會導(dǎo)致反常的長毛現(xiàn)象已經(jīng)在人類[4]及兔[5]、貓[6]、狗[7]、鯨目動(dòng)物[8]、羊駝[9]和羊[10]等動(dòng)物上得到驗(yàn)證。叢波等[11]研究表明，美國短毛黑水貂針毛平均長度為（2.02±0.22）cm、絨毛平均長度為（1.69±0.13）cm；丹麥咖啡色水貂針毛平均長度為（2.58±0.21）cm、絨毛平均長度為（2.11±0.29）cm，丹麥咖啡水貂針毛和絨毛都顯著長于美國短毛黑水貂。本研究以被毛長度存在顯著差異的美國短毛黑水貂和丹麥咖啡水貂為研究對象，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)―限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法檢測FGF5 基因多態(tài)性，并對FGF5基因多態(tài)性與毛長性狀進(jìn)行相關(guān)分析，旨在為今后研究水貂毛絨品質(zhì)的分子遺傳機(jī)理與分子標(biāo)記輔助選擇育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所毛皮動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地和大連名威貂業(yè)有限公司采集7 月齡左右、雄性水貂血樣，其中，美國短毛黑水貂115 只，丹麥咖啡水貂137只。在水貂取皮期，采集心臟血液，檸檬酸鈉抗凝，在﹣ 20 ℃的條件下保存。

1.2 主要試劑

全血基因組試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；限制性內(nèi)切酶 TaqⅠ（賽默飛世爾公司）；Marker和Taq DNA 聚合酶（大連TaKaRa 有限公司）。

1.3 DNA 提取

采用全血基因組試劑盒提取血液DNA，利用0.7%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，紫外分光光度法測定基因組的濃度和純度，在﹣20 ℃的條件下保存。

1.4 引物合成及 PCR 擴(kuò)增

以GenBank 數(shù)據(jù)庫中水貂FGF5 基因序列（登錄號：JF288167.1）為參考，利用 Primer Premier 5.0 軟件在其內(nèi)含子1 和外顯子1 區(qū)域設(shè)計(jì)1 對引物FGF51-R（5′-AGGGCTATCACTAAAGCCGC-3′）和 FGF51-S（5′-TGGGGAGAGGAACCTCGATT-3′），由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

PCR 反應(yīng)程序如下：94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性 30 s，60 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 45 s，共 30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；在4 ℃條件下保存。

1.5 SNP 分析

先用30 個(gè)美國短毛黑水貂的基因組進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送交吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行測序。利用DNAMAN 軟件對擴(kuò)增核苷酸序列進(jìn)行比對分析并篩查SNP。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，在擴(kuò)增產(chǎn)物的 376處存在多態(tài)性，該位點(diǎn)位于FGF5 基因內(nèi)含子1 中。

1.6 PCR-RFLP 分析

利用NEBcutter V 2.0 在線酶切設(shè)計(jì)軟件（http://nc2.neb.com/NEBcutter2/）查詢限制性內(nèi)切酶，發(fā)現(xiàn)Taq I 可識別FGF5 基因T376C 位點(diǎn)的C 等位基因。

基因型鑒定：內(nèi)切酶TaqⅠ識別位點(diǎn)為AGTCGAT，正常情況下將621 bp 的擴(kuò)增序列酶切為376 bp 和245 bp 兩個(gè)片段。將能夠酶切的基因型定義為CC 基因型，不能酶切的基因型為TT 基因型，雜合子則為CT基因型。

對 115 只美國短毛黑水貂和 137 只丹麥咖啡水貂的基因采用PCR-RFLP檢測方法進(jìn)行FGF5 基因多態(tài)性檢測。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用PopGen 32 軟件統(tǒng)計(jì)基因型頻率和等位基因頻率、純合度和雜合度等群體遺傳參數(shù)。使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行SNP位點(diǎn)與毛長性狀的關(guān)聯(lián)分析，構(gòu)建線性分析模型，具體模型如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 FGF5 基因的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果及測序篩選 SNP

利用引物對30 只美國短毛黑水貂的FGF5 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在500～750 bp 間，與預(yù)期結(jié)果相一致。從圖1 可以看出，SNP 位點(diǎn)位于FGF5 基因內(nèi)含子1 區(qū)域的376 bp 處，經(jīng)分析處于TaqⅠ內(nèi)切酶位點(diǎn)內(nèi)。

圖1 CC、TC 和TT 基因型的測序峰圖Fig.1 The sequencing peak graph of CC, TC and TT genotypes

2.2 PCR-RFLP 檢測分析

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物長度為621 bp，采用限制性內(nèi)切酶TaqⅠ對2 個(gè)水貂品種FGF5 基因的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。由圖 2 可知，F(xiàn)GF5 基因 T376C 位點(diǎn)存在 3 種基因型，分別為 TT（621 bp）、TC（621、376 和 245 bp）和 CC（376 和 245 bp）。

圖2 FGF5 基因T376C 位點(diǎn)的酶切分析結(jié)果Fig.2 Results of FGF5 T376C locus digested with Ⅰenzyme

2.3 FGF5 基因型頻率和等位基因頻率分布

由表1 可知，美國短毛黑水貂群體中檢測到3 種基因型，以 CC 型居多，TC 型次之，TT 型最少，而 C 等位基因頻率高于T 等位基因頻率；咖啡水貂群體中以TC 型居多，CC 型次之，TT 型最少，而 C 等位基因頻率與T 等位基因頻率相差不大。

表1 FGF5 基因 T376C 位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率Table 1 Genotype frequency and allele frequency of FGF5 T376C locus

2.4 不同水貂品種 FGF5 基因 T376C 位點(diǎn)的遺傳多樣性分析

由表2 可知，T376C 多態(tài)位點(diǎn)在美國短毛黑水貂群體中為中度多態(tài)（0.25 ＜PIC ＜0.05），而在丹麥咖啡水貂群體中表現(xiàn)為高度多態(tài)（PIC ＞0.25）。2檢測結(jié)果表明，T376C 位點(diǎn)在美國短毛黑水貂群體處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)，在丹麥咖啡水貂群體中顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)。

表2 2 個(gè)水貂品種 T376C 位點(diǎn)遺傳多態(tài)性Table 2 Genetic polymorphism of T376C locus in two mink breeds

2.5 FGF5 基因 T376C 位點(diǎn)多態(tài)性與水貂毛長性狀的關(guān)聯(lián)分析

由表3 可知，T376C 位點(diǎn)形成的不同基因型在兩種水貂品種中差異極顯著（P ＜0.000 1），說明該位點(diǎn)可能與水貂毛長性狀相關(guān)。

表3 T376C 位點(diǎn)基因型與水貂毛長表型的關(guān)聯(lián)分析Table 3 Relationship analysis between the genotype of T376C locus with hair length phenotype of mink

3 討論

美國短毛黑水貂和丹麥咖啡水貂均為國外引進(jìn)品種，是目前我國飼養(yǎng)量較多的水貂品種[12]。美國短毛黑水貂毛絨品質(zhì)優(yōu)良，針毛短、平、齊，絨毛細(xì)、密，分布均勻，皮板富有彈性，但繁殖力較低；丹麥咖啡水貂體型較大，繁殖力較高，被毛略粗糙，呈淺褐色或深褐色[13]。美國短毛黑水貂和丹麥咖啡水貂的毛絨品質(zhì)差異較大，因此，本研究選擇這2 個(gè)品種開展毛絨品質(zhì)相關(guān)分子遺傳標(biāo)記研究。

FGF5 是毛囊從生長期到休止期轉(zhuǎn)換的重要的影響因子，同時(shí)也被證明 FGF5 是體內(nèi)誘導(dǎo)退行期毛囊分泌和抑制毛發(fā)生長的信號蛋白。目前，關(guān)于FGF5 基因突變導(dǎo)致動(dòng)物毛長表型改變和FGF5 基因多態(tài)性的檢測方法均有報(bào)道[14-16]。本研究分析了FGF5 基因在不同水貂品種中的多態(tài)性，不同品種水貂群體遺傳學(xué)分析表明 T376C 位點(diǎn)在美國短毛黑水貂和丹麥咖啡水貂中的基因型頻率有很大的差異。在美國短毛黑水貂群體中以CC 基因型居多，而C 等位基因頻率高于T 等位基因頻率；在丹麥咖啡水貂群體中以TC 基因型居多，而C 等位基因頻率與T 等位基因頻率相差不大；經(jīng)卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，品種間的基因型頻率差異極顯著（P＜0.01）。丹麥咖啡水貂針毛和絨毛都顯著長于美國短毛黑水貂，據(jù)此推測，該位點(diǎn)可能與水貂毛長性狀相關(guān)。T376C 位點(diǎn)在美國短毛黑水貂群體中為中度多態(tài)，而在丹麥咖啡水貂群體中表現(xiàn)為高度多態(tài)。T376C 位點(diǎn)在短毛黑水貂群體處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)，與劉琳玲等[17]研究結(jié)果基本一致。然而，丹麥咖啡水貂群體在該位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)，究其原因可能是因?yàn)槌Ｒ?guī)選擇育種對該品種水貂絨毛經(jīng)濟(jì)性狀產(chǎn)生一定的影響，并且本研究樣本量較少，后續(xù)尚需增加檢測數(shù)量及擴(kuò)大水貂品種范圍以進(jìn)一步驗(yàn)證本試驗(yàn)結(jié)果。

本研究基于 PCR-RFLP 技術(shù)[18]開展了 2 個(gè)品種水貂群體T376C 位點(diǎn)的多態(tài)性檢測及其與毛長性狀的相關(guān)性分析，結(jié)果表明，該位點(diǎn)與水貂毛長性狀存在極顯著相關(guān)。絨山羊FGF5 基因多態(tài)性與絨長度相關(guān)，蘇博美利奴羊FGF5基因多態(tài)性與其產(chǎn)毛性狀相關(guān)，兔的產(chǎn)毛量也被證實(shí)與該基因相關(guān)[5]。FGF5 基因T376C位點(diǎn)可能是影響水貂毛長的主控位點(diǎn)，為水貂毛長性狀分子遺傳標(biāo)記研究提供了一定的分子基礎(chǔ)[19]。