酶差速脫壁法聯(lián)合差速貼壁法分離人頰黏膜上皮干細胞△

張鴻 黃挺

臨床上嚴重的角膜緣干細胞缺乏最終導(dǎo)致患者失明，自體角膜緣干細胞移植治療角膜緣干細胞衰竭效果較好，然而數(shù)量有限?？谇火つど掀ぜ毎浦草^角膜緣細胞移植存在容易生長新生血管的缺點［1］，異體角膜緣移植術(shù)后排斥率較高，倘若將異體角膜緣干細胞與自體口腔頰黏膜上皮干細胞聯(lián)合培養(yǎng)，在前者微環(huán)境下誘導(dǎo)后者分化為角膜上皮干細胞，或許既能減少新生血管形成，降低排斥反應(yīng)，又能獲得良好的術(shù)后長期療效。盡管目前關(guān)于分離培養(yǎng)口腔上皮細胞的研究很多，然而探討如何有效分離人頰黏膜上皮干細胞的研究較少。本實驗則采用酶差速脫壁法聯(lián)合差速貼壁法分離人頰黏膜上皮干細胞，為轉(zhuǎn)分化成角膜上皮干細胞的后續(xù)研究成功獲取種子細胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 取材及主要試劑 人頰黏膜上皮材料來源于捐獻器官的供體，供體年齡為20～50歲。Epilife培養(yǎng)基、中性蛋白酶DispaseⅡ、TrypLE Express消化液(美國Gibco);兔抗人P63多克隆抗體、兔抗人CK13多克隆抗體、Delight山羊抗兔二抗(美國Bioworld);兔抗人CK12單克隆抗體(英國Abcam);Hoechst33342(美國Sigma)。

1.1.2 主要儀器 恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱(美國NAPCO公司);微量移液器(Eppendorf公司);NiKon ECLIPSE 80i熒光顯微鏡(日本);Olympus-CK40倒置相差顯微鏡(日本);Olympus-GT51顯微照相系統(tǒng)(日本)等。

1.2 方法

1.2.1 原代培養(yǎng) 將雙抗處理過的人頰黏膜組織塊用眼科剪修剪去多余黏膜下組織，清洗后置于1.2 U·mL－1DispaseⅡ中，4℃冰箱消化16 h。顯微無齒鑷分離表層上皮和上皮下層，將表層上皮置于2.5 g·L－1胰蛋白酶溶液中，37℃消化10～15 min。終止消化并吹打成單細胞懸液，離心后加入Epilife無血清培養(yǎng)基，調(diào)整細胞密度約500×103個·mL－1，接種培養(yǎng)。48 h后首次換液，以后每2～3 d換液。培養(yǎng)2 d后每日在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長狀況，至細胞長滿培養(yǎng)皿備用。

1.2.2 傳代培養(yǎng) 原代細胞長滿培養(yǎng)皿后進行傳代，漂洗細胞3次后加入37℃預(yù)熱的TrypLE Express消化液消化獲得單細胞懸液，離心，此步將細胞分為兩組，第1組直接加入Epilife培養(yǎng)基培養(yǎng)，第2組行CFSE熒光標記后再加入Epilife培養(yǎng)基培養(yǎng)，1∶2比例進行傳代。48 h后換液，以后每2～3 d換液，培養(yǎng)7～8 d傳代。

1.2.3 繪制生長曲線 對生長狀況較好的第2代CFSE標記組細胞及未經(jīng)CFSE標記組細胞自培養(yǎng)48 h開始計數(shù)，連續(xù)8 d，繪制生長曲線。

1.2.4 分離培養(yǎng)人頰黏膜上皮干細胞 預(yù)先用DMEM配備濃度為20 mg·L－1的纖維結(jié)合蛋白，鋪滿整個培養(yǎng)皿進行包被，1 h后吸去上層液體，紫外燈照射2 h，超凈臺吹干待用。酶差速脫壁法:第1代細胞長滿培養(yǎng)皿后，用TrypLE Express消化液消化1 min，立即吸出脫壁細胞加入培養(yǎng)基終止消化，離心制成5×105個·mL－1細胞懸液。差速貼壁法:將酶差速脫壁法制得的細胞懸液加入到纖維結(jié)合蛋白預(yù)先包被的培養(yǎng)皿中，快速吸附20 min后棄去未貼壁細胞，已貼壁細胞上加入培養(yǎng)液開始培養(yǎng)，48 h后換液，以后每2～3 d換液，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況。每次傳代均聯(lián)合酶差速脫壁法及差速貼壁法進行分離純化。

1.2.5 免疫熒光鑒定 細胞分為兩組，第Ⅰ組是未經(jīng)聯(lián)合分離法傳代的第2代細胞，第Ⅱ組則是經(jīng)聯(lián)合分離法傳代的第2代細胞。預(yù)先將第2代細胞制成細胞爬片，2～3 d后進行免疫熒光分析，冰丙酮固定10 min，PBS漂洗3次，每次5 min，50 g·L－1BSA封閉30 min，加入BSA稀釋的一抗，于4℃過夜，PBS漂洗3次，每次5 min，加入BSA稀釋的二抗，于37℃雜交45 min，PBS漂洗3次，每次5 min，Hoechst33342染色2 min，抗淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀測P63、CK12、CK13的表達。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng) DispaseⅡ及胰蛋白酶雙酶消化法獲得的人頰黏膜上皮細胞在倒置顯微鏡下觀察，貼壁前為漂浮的體積較小的圓形細胞，折光性強，胞漿透亮，邊界輪廓清晰、光滑，5 min后可見部分細胞開始貼壁。12 h后頰黏膜上皮細胞均勻貼壁于60 mm直徑塑料培養(yǎng)皿，細胞由圓形伸展為卵圓形，細胞大小變?yōu)橘N壁前2倍左右，大部分細胞形態(tài)相似、邊界清晰，核圓而清楚，少部分細胞貼壁后形狀不規(guī)則、折光性差、較卵圓形細胞更大。48～72 h細胞成簇樣生長，可見核分裂象。3～4 d細胞開始生長旺盛，8～9 d后細胞基本達到融合，細胞形態(tài)、大小差異小，呈典型鋪路石樣，未見明顯成纖維細胞生長。

2.2 傳代培養(yǎng)

2.2.1 未經(jīng)CFSE標記組細胞 原代細胞長滿培養(yǎng)皿后，倒置顯微鏡下觀察到細胞5～10 min開始貼壁。隨著培養(yǎng)時間延長，細胞體積逐漸增大，胞核與胞漿比值降低，細胞增殖能力逐漸減弱。第1－2代細胞形態(tài)與原代細胞相似，細胞呈卵圓形、短梭狀，小部分細胞形態(tài)不規(guī)則，可見多角形、圓形細胞，未見明顯成纖維細胞(圖1)。第3－4代細胞貼壁后折光性明顯下降，胞漿顏色加深，核漿比變小，細胞增殖緩慢，卵圓形、短梭狀細胞減少，圓形細胞、不規(guī)則細胞、巨細胞增多。第5代細胞形態(tài)不規(guī)則，以巨細胞為主，視野中未見早期的卵圓形、短梭狀細胞，部分細胞伸出偽足和周圍細胞連接，細胞逐漸走向衰老，胞內(nèi)空泡、顆粒增多，細胞邊界模糊。

2.2.2 CFSE標記組細胞 熒光染色后的細胞置倒置顯微鏡下觀察到，細胞5～10 min開始貼壁;熒光倒置顯微鏡下觀察到，貼壁細胞呈現(xiàn)綠色熒光，細胞形態(tài)可辨，與普通倒置顯微鏡下對比，可見到細胞的CFSE熒光染色率達到100%。經(jīng)CFSE熒光染色的頰黏膜上皮細胞在體外傳代，其形態(tài)、生長速度與未經(jīng)CFSE染色的頰黏膜上皮細胞一致。人頰黏膜上皮細胞第1－2代，細胞綠色熒光較強，邊界熒光清楚，形態(tài)可辨，熒光標記率達100%。人頰黏膜上皮細胞第3－4代，出現(xiàn)巨細胞。傳至第5代，細胞扁平散大，邊界模糊，形態(tài)不規(guī)則，胞內(nèi)黑色顆粒明顯增多，熒光較前代稍微減弱，但熒光標記率仍＞98%。

Figure 1 Morphology of passage 2 cells 第2代細胞形態(tài)學(xué)

2.3 繪制生長曲線 CFSE標記組細胞與未經(jīng)CFSE標記組細胞在無血清Epilife培養(yǎng)基下的生長狀況較為一致，均生長迅速，3～7 d呈對數(shù)增長，之后進入平臺期，增殖減慢(圖2)。

Figure 2 Growth curves of groups marked with or without CFSE CFSE標記組與未標記組細胞生長曲線

2.4 分離培養(yǎng)人頰黏膜上皮干細胞 經(jīng)酶差速脫壁法獲取的細胞懸液，加入纖維結(jié)合蛋白預(yù)先包被的塑料培養(yǎng)皿內(nèi)，在倒置相差顯微鏡下可見部分細胞貼壁，貼壁細胞分散均勻、圓形、折光性較強，快速貼附20 min后，吸去未貼壁細胞。24 h后顯微鏡下觀察到小部分細胞懸浮，進行換液，其余細胞伸展為卵圓形，細胞較小，折光性強。隔日換液，培養(yǎng)3～4 d，克隆形成(圖3)，培養(yǎng)6～7 d細胞鋪滿培養(yǎng)皿，呈典型鋪路石狀。而對20 min后未貼壁細胞單獨培養(yǎng)時可見最早貼壁的細胞較大，折光性稍差，體外培養(yǎng)48 h仍無克隆樣生長。

2.5 免疫熒光鑒定 未經(jīng)聯(lián)合分離法傳代的第2代細胞免疫熒光鑒定發(fā)現(xiàn)，CK13陽性、P63陰性、CK12陰性。經(jīng)聯(lián)合分離法傳代的第2代細胞免疫熒光鑒定發(fā)現(xiàn)，P63陽性(圖4)、CK13陽性、CK12陰性。

Figure 3 A clone of buccal mucosal epithelial stem cells 頰黏膜上皮干細胞形成小克隆

Figure 4 Positive staining of P63 in passage 2 cells cultured with combined partition methods 經(jīng)聯(lián)合分離法傳代的第2代細胞免疫熒光P63陽性

3 討論

組織工程的成熟發(fā)展為人口腔黏膜上皮細胞體外培養(yǎng)體系的建立奠定了基礎(chǔ)。將體外培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細胞種植在一系列載體上形成復(fù)層上皮［2-3］或者直接構(gòu)建膜片［4］，是組織工程口腔黏膜的研究熱點。既往實驗聯(lián)合載體支撐、血清培養(yǎng)基和滋養(yǎng)層細胞進行培養(yǎng)，這些因素在一定程度上促進了細胞不同程度的分化，同時也增加了動物源性污染及免疫排斥反應(yīng)的可能性［5］。本實驗在采用經(jīng)典的Dispase II和胰蛋白酶雙酶消化法獲得上皮細胞懸液后，加入到Epilife無血清培養(yǎng)基及無動物源性滋養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)體系中進行培養(yǎng)。在傳代培養(yǎng)中，用TrypLE Express消化液取代傳統(tǒng)的胰蛋白酶。TrypLE Express是一種非動物源性的消化酶，它的作用性質(zhì)溫和，對細胞造成的損傷更小，能夠應(yīng)用在有血清或者無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的不同細胞。然而，在對口腔黏膜上皮組織塊消化的步驟中，TrypLE Express消化下來的細胞較少，因而我們僅僅將TrypLE Express應(yīng)用在傳代消化的過程中，可能是因為培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的細胞較組織塊上黏附的細胞相對容易獲取所致。此法培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細胞中未見明顯成纖維細胞生長，細胞貼壁迅速，活性良好，而且細胞數(shù)量豐富，生長旺盛，第1－2代細胞形態(tài)大小較均一，共可傳代5次。

在后續(xù)研究聯(lián)合培養(yǎng)異體角膜緣干細胞與自體口腔黏膜上皮干細胞之前，本實驗需要一種熒光標記物對這兩種細胞進行區(qū)分?；罴毎玖螩FSE可以不可逆地和細胞內(nèi)蛋白的Lysine殘基或其他氨基發(fā)生結(jié)合反應(yīng)從而標記這些蛋白，它有著非常廣泛的應(yīng)用［6-7］。本實驗嘗試應(yīng)用CFSE對頰黏膜上皮細胞進行標記及體外培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下觀察到細胞標記率達到100%，傳代5次以后在熒光倒置顯微鏡下仍可見到綠色熒光，第5代細胞標記率仍＞98%。與未進行染色標記的頰黏膜上皮細胞比較，我們發(fā)現(xiàn)兩種情況下的上皮細胞在細胞形態(tài)、生長曲線、傳代次數(shù)方面極其相似，是本實驗中理想的熒光標記示蹤物。

尋找到合適的熒光標記示蹤物之后，我們對口腔黏膜上皮干細胞的分離純化技術(shù)進行探討。干細胞的分離方法有密度梯度離心法、差速貼壁法、酶差速脫壁消化法、流式細胞儀分選、磁珠分離［8］等。其中密度梯度離心法、流式細胞儀、磁珠分離技術(shù)相對耗時耗力，分離的某些干細胞活性欠佳，或者獲得的數(shù)量較少，這些都會影響進一步的實驗。快速吸附法可以分離干細胞與滋養(yǎng)層細胞、成纖維細胞，并且不會影響干細胞的多能性，還具有操作簡單、耗時短、吸附干細胞多、細胞活性不受影響的特點。酶差速脫壁法具備類似的優(yōu)點。利用干細胞的這些特性［8-9］，本研究采用酶差速脫壁消化法與差速貼壁法結(jié)合的聯(lián)合分離法。在應(yīng)用差速貼壁法技術(shù)的過程中，不可或缺的則是包被培養(yǎng)皿的材料，例如膠原、明膠、纖維結(jié)合素、纖維結(jié)合素-膠原復(fù)合體、多聚賴氨酸、層粘連蛋白等。其中吸附作用最好的是Ⅳ型膠原，它對上皮干細胞吸附性好，促進更多克隆形成，在回收后可以重復(fù)利用，并且不影響干細胞的黏附性［10-11］。但是膠原價錢昂貴，因而在實驗或者臨床上的應(yīng)用受到了一定限制。Hirayama等［12］報道，纖維結(jié)合蛋白包被的培養(yǎng)皿培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細胞較羊膜載體培養(yǎng)的細胞移植有更高的成功率，術(shù)后能獲得更好的最佳矯正視力及更少新生血管生長。因此本實驗利用纖維結(jié)合蛋白包被培養(yǎng)皿的差速貼壁法聯(lián)合酶差速脫壁法對頰黏膜上皮干細胞進行分離純化，取得了一定的效果。

在未采用聯(lián)合分離法進行傳代培養(yǎng)以及采用了該聯(lián)合分離法之后，我們進一步在免疫學(xué)上對細胞的干細胞特性進行了鑒定。未經(jīng)聯(lián)合分離法傳代的第2代頰黏膜上皮細胞細胞免疫熒光檢測到CK13陽性、P63陰性、CK12陰性，證明了所培養(yǎng)的細胞是口腔非角化上皮細胞。本研究中口腔黏膜組織并非現(xiàn)場取材培養(yǎng)而是來源于尸體，從異地取材到實驗室處理需要一定的時間，加上干細胞的比例本來就低以及在消化過程中又損失了一定數(shù)量的干細胞，這些原因?qū)е屡囵B(yǎng)的干細胞較分散，密度非常低。極少的干細胞位于較大密度的高分化的上皮細胞內(nèi)，受周圍細胞及細胞外基質(zhì)的影響較大［13］，加速了干細胞特性的喪失，上述原因可能導(dǎo)致了干細胞標記物P63的陰性表達。而通過聯(lián)合分離法傳代的第2代頰黏膜上皮干細胞，極大提高了干細胞吸附聚集的密度，免疫熒光檢測到P63陽性、CK13陽性、CK12陰性，證明聯(lián)合分離法獲得了一定數(shù)量的干細胞。本次實驗中發(fā)現(xiàn)并非所有細胞都為干細胞，這可能與干細胞體外最佳培養(yǎng)條件未知、分離純化次數(shù)不夠、干細胞在體外培養(yǎng)過程中仍有一定程度分化等原因有關(guān)。

目前為止，關(guān)于口腔黏膜上皮干細胞的研究報道較少。Nakamura等［3］首次發(fā)表口腔黏膜上皮干細胞體外培養(yǎng)及移植于眼表的文章，但是該研究中擴增培養(yǎng)的是細胞混合液，并未說明細胞來源于口腔的具體位置，也未進行干細胞的分離純化。本實驗初步證明了CFSE熒光標記人頰黏膜上皮細胞的高效性、安全性，通過將酶差速脫壁法與差速貼壁法相結(jié)合的聯(lián)合分離法，為轉(zhuǎn)分化角膜上皮干細胞獲得了一定數(shù)量呈克隆增殖的干細胞［14］。這為聯(lián)合培養(yǎng)異體角膜緣干細胞及自體頰黏膜上皮干細胞并誘導(dǎo)后者分化為角膜上皮干細胞的后續(xù)研究提供了依據(jù)，為干細胞轉(zhuǎn)分化技術(shù)在角膜緣干細胞缺乏患者中的應(yīng)用提供新的研究思路。

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