補(bǔ)腎活血?jiǎng)?duì)高糖和(或)缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞活力及谷氨酰胺合成酶活性的影響△

馬殿偉 謝學(xué)軍 張梅 萬(wàn)李

近年來(lái)，中醫(yī)藥治療糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)的研究取得了一定進(jìn)展，在長(zhǎng)期臨床研究工作中觀察到，補(bǔ)腎活血中藥對(duì)DR有較好的治療作用，能夠有效提高患者視力，改善眼底病變，提高患者的視野光敏感度。我們前期已進(jìn)行補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方含藥血清對(duì)高糖狀態(tài)下純化培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGC)干預(yù)作用的相關(guān)系列研究，并取得一些積極結(jié)果，即糖尿病大鼠不僅存在視網(wǎng)膜血管損害，而且存在RGC數(shù)量及其尼氏小體含量減少、突觸素Ⅰ表達(dá)降低等病理改變，補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方能減輕這些病理?yè)p害［1］。因此，本研究擬進(jìn)一步在RGC與視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞共存模式下，研究在缺氧和(或)高糖狀態(tài)下對(duì)體外共同培養(yǎng)的RGC和Müller細(xì)胞活力及谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)活性影響，以及補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方血清對(duì)其有何干預(yù)作用?以期進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制、揭示補(bǔ)腎活血?jiǎng)┓乐蜠R新的藥物干預(yù)途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要實(shí)驗(yàn)材料 Sprague-Dawley (SD)新生7 d及1 d大鼠各30只，雌雄不限，均由成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為清潔級(jí)。SIRP(克隆號(hào):OX-41)、Thy-1.1(克隆號(hào):OX-7) (Chemicon，美國(guó));乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)以及GS檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程公司)。

1.2 RGC的純化及與視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的共同培養(yǎng) 視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞原代及傳代培養(yǎng)方法與我們前期實(shí)驗(yàn)相同［2］。將P2代視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板中，密度為106mL－1，每孔200 μL，共3板;置于含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用于純化RGC的培養(yǎng)板的處理:用OX-41抗體(1∶100，PBS稀釋)包被6孔板，室溫2 h，4℃過夜，PBS輕漂，備用。用OX-7抗體(1∶300，PBS稀釋)包被6孔板及96孔板，室溫孵育2 h，4℃過夜，PBS洗3次，1 g·L－1BSA孵育0.5 h，PBS輕漂備用。RGC的純化:將出生后1 d的SD大鼠用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡15 min溺死，無(wú)菌取眼球，用含100 U·mL－1青霉素、100 U·mL－1鏈霉素的PBS沖洗3次，于解剖顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜神經(jīng)層，置于2.5 g·L－1胰蛋白酶中37℃孵育20 min，充分吹打。含血清培養(yǎng)基終止消化，200目不銹鋼網(wǎng)過濾，800 r·min－1離心5 min，含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的DF12液重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液置于OX-41抗體包被的培養(yǎng)皿中，37℃孵育30 min，每10 min輕晃一次。輕輕吸掉未黏附的細(xì)胞懸液置于OX-7抗體包被6孔培養(yǎng)板中，室溫孵育30 min;吸掉細(xì)胞懸液，PBS沖洗3次，用含2.5 g·L－1胰蛋白酶的無(wú)血清培養(yǎng)基輕輕沖洗6孔板，黏附于6孔板的細(xì)胞脫落于培養(yǎng)基中，含血清的培養(yǎng)基終止消化;800 r· min－1離心5 min，含血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以40× 103mL－1的細(xì)胞密度種植于包被好視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的96孔板，加入含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的DF12液，置于含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)分組［3-7］。

1.3 補(bǔ)腎活血中藥血清的制備 補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方由生地黃、丹參等組成，成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制備提供。將體質(zhì)量120～150 g的SD大鼠20只隨機(jī)分為2組，即中藥組與空白對(duì)照組。具體方法同我們前期研究［2］。中藥組及空白對(duì)照組所制備的血清分別簡(jiǎn)稱中藥含藥血清、空白血清。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 將按1∶25比例共同培養(yǎng)好的細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將含有體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的DF12液棄掉，換用無(wú)血清的DF12培養(yǎng)液，孵育24 h后再棄掉無(wú)血清的培養(yǎng)液，按下列分組情況換含有不同培養(yǎng)條件的培養(yǎng)液，將三板細(xì)胞隨機(jī)分為24 h板、48 h板、72 h板，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后24 h、48 h、72 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定。正常對(duì)照組:含體積分?jǐn)?shù)20%空白血清的DF12液;中藥干預(yù)正常組:含體積分?jǐn)?shù)20%中藥含藥血清的DF12液;高糖組:含體積分?jǐn)?shù)20%空白血清的DF12液及終濃度為50 mmol·L－1葡萄糖;中藥干預(yù)高糖組:含體積分?jǐn)?shù)20%中藥含藥血清的DF12液和終濃度為50 mmol·L－1葡萄糖;缺氧組:含體積分?jǐn)?shù)20%空白血清的DF12液及終濃度1.0 mmol·L－1連二亞硫酸鈉;中藥干預(yù)缺氧組:含體積分?jǐn)?shù)20%中藥含藥血清的DF12液和終濃度1.0 mmol·L－1連二亞硫酸鈉;高糖缺氧組:含體積分?jǐn)?shù)20%空白血清的DF12液、終濃度為50 mmol·L－1葡萄糖和終濃度1.0 mmol·L－1連二亞硫酸鈉;中藥干預(yù)高糖缺氧組:含體積分?jǐn)?shù)20%中藥含藥血清的DF12液、終濃度1.0 mmol·L－1連二亞硫酸鈉和終濃度為50 mmol·L－1葡萄糖。

1.5 細(xì)胞外液LDH含量的測(cè)定方法 收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清液50 μL，迅速加入LDH酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑(具體操作參照LDH試劑盒說(shuō)明書)，490型酶標(biāo)儀440 nm檢測(cè)吸光度(OD)值的變化，最后計(jì)算LDH活性值，單位:U·L－1。

1.6 GS活性的測(cè)定方法 收集樣本培養(yǎng)基上清液50 μL，迅速加入GS檢測(cè)試劑(具體操作參照GS試劑盒說(shuō)明書)，混勻，3500 r·min－1離心5～10 min，取上清，0.5 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，550 nm檢測(cè)各管OD值的變化，最后計(jì)算GS活性值，單位:U·mgprot－1。

2 結(jié)果

2.1 LDH漏出量測(cè)定結(jié)果 不同條件下共同培養(yǎng)RGC和Müller細(xì)胞LDH漏出量測(cè)定結(jié)果見表1，由表1可見高糖和(或)缺氧干預(yù)結(jié)果:24 h后，高糖組、缺氧組和高糖缺氧組與正常對(duì)照組相比較，LDH漏出量增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05); 48 h后，缺氧組與正常對(duì)照組比較，LDH漏出量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);72 h后，高糖組、缺氧組和高糖缺氧組與正常對(duì)照組比較，LDH漏出量均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)。中藥干預(yù)高糖和(或)缺氧狀態(tài)下結(jié)果:24 h、48 h和72 h時(shí)段中藥干預(yù)高糖組與高糖組比較，LDH漏出量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05);在24 h、48 h和72 h時(shí)段中藥干預(yù)缺氧組與缺氧組比較，LDH漏出量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05);在24 h、48 h和72 h時(shí)段中藥干預(yù)高糖缺氧組與高糖缺氧組比較，細(xì)胞LDH漏出量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)。

2.2 GS活性測(cè)定結(jié)果 不同條件下共同培養(yǎng)RGC和Müller細(xì)胞GS活性測(cè)定結(jié)果見表2。由表2可見高糖和(或)缺氧干預(yù)結(jié)果:24 h后正常對(duì)照組與缺氧組、高糖組和高糖缺氧組GS活性比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05);48 h后高糖組、缺氧組與正常對(duì)照組比較，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。72 h后，高糖組與正常對(duì)照組比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。中藥干預(yù)高糖和(或)缺氧狀態(tài)下結(jié)果:24 h、48 h及72 h時(shí)段中藥干預(yù)高糖組與高糖組細(xì)胞GS活性比較，其差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05);在24 h時(shí)段中藥干預(yù)缺氧組與缺氧組比較，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，48 h、72 h時(shí)段中藥干預(yù)缺氧組與缺氧組比較，細(xì)胞GS活性增強(qiáng)，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05);24 h、48 h及72 h時(shí)段，中藥干預(yù)高糖缺氧組與高糖缺氧組比較，GS活性增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)。

表1 不同條件下共同培養(yǎng)RGC和Müller細(xì)胞LDH漏出量測(cè)定結(jié)果Table 1 LDH leakage of co-cultured RGC and retinal Müller cells under different conditions (s，U·L－1)

表1 不同條件下共同培養(yǎng)RGC和Müller細(xì)胞LDH漏出量測(cè)定結(jié)果Table 1 LDH leakage of co-cultured RGC and retinal Müller cells under different conditions (s，U·L－1)

Note:Compared with normal group at same time，▲P＜0.05;Compared with serum with group at same time，★P＜0.05

Group n 24 hours 48 hours 72 hours Normal 6 1183.67±41.64 1452.00±24.45 1346.00±40.10 Serum with drug 6 1048.76±57.46 1263.77±40.95 1258.83±31.41 High glucose 6 1412.17±43.19▲★1303.67±65.64★ 1650.00±34.07▲★Serum with drug+high glucose 6 1055.00±83.51 1308.17±39.15 1442.17±45.26 Hypoxia 6 1446.67±19.59▲★1656.17±39.63▲★1503.83±63.26▲★Serum with drug+hypoxia 6 1348.33±39.83 1510.00±65.20 1553.17±38.61 High glucose+hypoxia 6 1626.83±73.01▲★1682.17±62.89★ 1578.50±55.71▲★Serum with drug+high glucose+hypoxia 6 1324.50±34.26 1156.50±95.74 1218.67±63.65

表2 不同條件下共同培養(yǎng)RGC和Müller細(xì)胞GS活性測(cè)定結(jié)果Table 2 GS activity of co-cultured RGC and retinal Müller cells under different conditions (s，U·mgprot－1)

表2 不同條件下共同培養(yǎng)RGC和Müller細(xì)胞GS活性測(cè)定結(jié)果Table 2 GS activity of co-cultured RGC and retinal Müller cells under different conditions (s，U·mgprot－1)

Note:Compared with normal group at same time，▲P＜0.05;Compared with serum with group at same time，★P＜0.05

Group n 24 hours 48 hours 72 hours Normal 6 5.92±0.87 34.79±3.63 30.53±4.02 Serum with drug 6 7.62±1.57 44.75±8.87 50.44±3.40 High glucose 6 8.25±1.66▲ 43.99±4.96▲ 55.65±8.87▲Serum with drug+high glucose 6 9.42±1.50 40.77±6.19 49.86±5.98 Hypoxia 6 9.31±1.87▲ 24.37±4.17▲★32.66±4.83★Serum with drug+hypoxia 6 10.79±3.57 42.61±8.04 38.62±4.67 High glucose+hypoxia 6 10.58±2.18▲★ 28.97±4.98★ 36.71±6.37★Serum with drug+high glucose+hypoxia 6 12.70±2.47 38.62±5.65 50.24±7.94

3 討論

DR發(fā)病的確切機(jī)制十分復(fù)雜，迄今研究尚未取得根本性重大突破，但高血糖是其共同的起點(diǎn)［8］，而視網(wǎng)膜缺血缺氧與高血糖一樣也是DR的主要發(fā)病機(jī)制之一［9］。還有學(xué)者認(rèn)為糖尿病患者細(xì)胞膜系統(tǒng)異常是發(fā)生并發(fā)癥的重要基礎(chǔ)，是導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境改變的基本條件［10］。LDH系胞質(zhì)酶，當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，LDH會(huì)從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)漏出，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)LDH減少，培養(yǎng)液中LDH增多，測(cè)定培養(yǎng)液中LDH漏出量可反映細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，其漏出量越大，細(xì)胞膜越不穩(wěn)定［11］。因此，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞外LDH漏出量，其意義在于通過顯示活細(xì)胞細(xì)胞膜的通透性，從而反映共同培養(yǎng)下視網(wǎng)膜細(xì)胞在高糖或(和)缺氧狀態(tài)下功能受損情況。另外在視網(wǎng)膜和腦組織中，星形膠質(zhì)細(xì)胞是最初合成Glu的地方，視網(wǎng)膜中Müller細(xì)胞是神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和雙極細(xì)胞中Glu的唯一來(lái)源［12］;Müller細(xì)胞在正常狀態(tài)下對(duì)Glu有高親和力的攝取作用，Glu在Müller細(xì)胞內(nèi)GS的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝滨０?glutamine，Gln)，Gln是一種無(wú)神經(jīng)毒性的物質(zhì)，被Müller細(xì)胞釋放到胞外，神經(jīng)細(xì)胞再將Gln攝入。這個(gè)循環(huán)在維持細(xì)胞外Glu的濃度、保持正常的生理功能中起著重要的作用，其中Müller細(xì)胞在其中發(fā)揮著核心的作用［13-14］。因此從GS活性角度研究Glu的代謝機(jī)制，對(duì)預(yù)防Glu濃度過高引起的細(xì)胞損傷具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示:在僅有高糖和(或)缺氧干預(yù)條件下，共同培養(yǎng)細(xì)胞外LDH漏出量在24 h時(shí)段比正常對(duì)照組增加，表明高糖和(或)模擬缺氧條件干預(yù)持續(xù)時(shí)間為24 h時(shí)對(duì)共同培養(yǎng)細(xì)胞膜的通透性明顯增加，細(xì)胞活力明顯降低;高糖缺氧組與僅有高糖或缺氧組比較，LDH漏出量增加，說(shuō)明兩者共同作用使LDH漏出量進(jìn)一步增加。48 h時(shí)段，高糖組的LDH漏出量與正常對(duì)照組比較增加;48 h時(shí)段缺氧組與24 h時(shí)段缺氧組比較LDH漏出量明顯增加，與正常對(duì)照組比較均增加，表明高糖和(或)缺氧可引起共同培養(yǎng)細(xì)胞膜穩(wěn)定性和細(xì)胞活力下降，LDH漏出量增加，該改變?cè)?8 h尤為明顯。72 h時(shí)段，高糖組、缺氧組和高糖缺氧組的LDH漏出量均比正常對(duì)照組增加;高糖組、缺氧組與高糖缺氧組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;說(shuō)明在單純高糖或缺氧條件下均使LDH漏出量增加，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，高糖與缺氧二者可能已無(wú)協(xié)同作用。中藥血清干預(yù)正常組LDH漏出量與正常對(duì)照組比較，僅在48 h時(shí)段兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明補(bǔ)腎活血中藥血清能明顯降低正常條件下48 h時(shí)共同培養(yǎng)細(xì)胞的LDH漏出量;補(bǔ)腎活血中藥血清能明顯降低高糖組、缺氧組以及高糖缺氧組共同培養(yǎng)細(xì)胞3個(gè)時(shí)段LDH漏出量，說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)各種條件下，補(bǔ)腎活血中藥血清能明顯提高共同培養(yǎng)細(xì)胞活力、穩(wěn)定其細(xì)胞膜、降低其通透性。

高糖和(或)缺氧狀態(tài)對(duì)谷氨酸代謝的影響結(jié)果:在48 h時(shí)段，三組的GS活性均較同組24 h時(shí)段明顯升高，這與黃菊芬等［15］的研究結(jié)果一致。在單純的模擬缺氧條件下，視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的GS活性在48 h時(shí)段比正常條件下明顯降低(P＜0.05)，表明缺氧是造成視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞GS活性降低的一個(gè)重要原因。本實(shí)驗(yàn)中，在僅有高糖干預(yù)下，視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞GS活性在24 h、48 h和72 h三個(gè)時(shí)段與正常條件下比較，GS活性均增高，表明單純高糖條件對(duì)正常的視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞GS活性有明顯正向調(diào)節(jié)作用;并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，高糖造成細(xì)胞GS活性增加的作用逐漸加強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)中，高糖與缺氧共同存在條件下視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞GS活性則在48 h、72 h時(shí)段與正常對(duì)照組比較其差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05)。因此，我們認(rèn)為:缺氧可導(dǎo)致視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞GS活性的降低，而單純高糖可以促進(jìn)共同培養(yǎng)細(xì)胞的GS活性，故對(duì)高糖缺氧狀態(tài)下的共同培養(yǎng)細(xì)胞GS活性無(wú)明顯影響(與正常對(duì)照組相比)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:24 h、48 h、72 h時(shí)段補(bǔ)腎活血中藥血清對(duì)高糖條件下視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞GS活性均無(wú)明顯影響，我們推測(cè)其原因可能是:在單純高糖條件下，視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞GS活性已較正常條件下明顯增強(qiáng)，而中藥對(duì)細(xì)胞不同狀態(tài)是一種調(diào)節(jié)作用，并非單向作用;但補(bǔ)腎活血中藥血清能夠增加缺氧組及高糖缺氧組視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞GS活性，并且該作用隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明補(bǔ)腎活血中藥血清對(duì)缺氧、高糖缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的GS活性影響具有時(shí)間延續(xù)性，也可能與藥物作用持續(xù)時(shí)間有關(guān)。我們的前期研究表明［16］:補(bǔ)腎活血中藥血清對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠RGC有保護(hù)作用，同時(shí)也觀察到視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞出現(xiàn)突起增粗、代謝增強(qiáng)等反應(yīng)性膠質(zhì)化改變。有學(xué)者對(duì)短暫性腦缺血后星形膠質(zhì)化細(xì)胞內(nèi)GS活性研究發(fā)現(xiàn)，其反應(yīng)性膠質(zhì)化星形細(xì)胞的GS活性增強(qiáng)，并且其程度與改善缺血后神經(jīng)元存活的程度具有相關(guān)性［17］。

綜上所述，補(bǔ)腎活血中藥血清可能通過降低高糖和(或)缺氧狀態(tài)下共同培養(yǎng)的RGC與Müller細(xì)胞細(xì)胞膜的通透性，提高細(xì)胞活力。同時(shí)提高視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞和RGC共同培養(yǎng)時(shí)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞GS活性，轉(zhuǎn)化Glu，減輕Glu的興奮性毒性，從而起到細(xì)胞保護(hù)作用，這可能是補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方防治DR的藥物干預(yù)途徑之一。

1 馬榮，謝學(xué)軍，萬(wàn)李，馬殿偉.補(bǔ)腎活血中藥血清對(duì)高糖狀態(tài)下純化培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞活力的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，29(10):892-895.

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