去整合素Echistatin抑制糖尿病兔遠(yuǎn)期后發(fā)性白內(nèi)障△

錢光霞 譚少健 梁皓 陳迎迎

后發(fā)性白內(nèi)障(posterior capsular opacification，PCO)是白內(nèi)障術(shù)后最常見的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致術(shù)后視力再次下降的主要原因。糖尿病患者PCO的發(fā)生率明顯高于正常血糖患者，且隨著時間的推移而增加［1］。已有研究證明去整合素(Echistatin，Ecs)可明顯抑制體外晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cell，LEC)的黏附、遷移和增殖［2］。因此，本實驗旨在觀察不同濃度Ecs在糖尿病兔眼晶狀體摘出術(shù)后對PCO LEC增殖的抑制作用及適宜濃度，為Ecs治療PCO提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新西蘭大白兔16只(購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)，雌雄不限，體質(zhì)量2.4～2.8 kg，眼部檢查無異常。

1.1.2 儀器與試劑 Ecs(美國Sigma公司，以高壓滅菌蒸餾水新鮮配制成實驗所需濃度);四氧嘧啶(美國Sigma公司);長效胰島素注射液(甘精胰島素注射液，德國);小鼠抗兔增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)單克隆抗體(武漢博士德);SABC(即用型羊抗小鼠IgG)試劑盒及DAB顯色試劑盒(武漢博士德);TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒(德國Roche公司);血糖分析儀、血糖試紙條(美國強生公司);手術(shù)顯微鏡、眼科顯微手術(shù)器械、裂隙燈顯微鏡(蘇州醫(yī)療器械廠);病理圖像分析系統(tǒng)(德國萊卡公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立及分組 建立糖尿病兔動物模型［3］，將新西蘭大白兔用四氧嘧啶按90 mg· kg－1建立糖尿病兔模型，當(dāng)血糖持續(xù)2周高于12 mmol·L－1者為建模成功。對于血糖濃度高于16 mmol·L－1者，根據(jù)血糖值給予皮下注射長效胰島素，使其血糖控制在12～16 mmol·L－1。16只16眼(右眼)糖尿病兔按隨機數(shù)字表法分為對照組(A組)和3組實驗組(B組、C組、D組)，每組4只(4眼)。

1.2.2 藥物處理 16只建模成功的糖尿病兔，每只兔右眼由同一術(shù)者行透明晶狀體囊外摘出術(shù)。A組術(shù)畢前房注入蒸餾水0.2 mL，B組、C組、D組分別注入 5.0×10－3μg·L－1、7.5×10－3μg·L－1、10.0×10－3μg·L－1Ecs溶液。術(shù)后用慶大霉素地塞米松眼液和阿托品眼液滴術(shù)眼7～10 d，每天4次。夜間涂四環(huán)素可的松眼膏，直至角膜水腫、前房滲出消失。

1.2.3 臨床觀察 術(shù)后1 d、3 d、7 d、10 d、6周分別用裂隙燈顯微鏡檢查角膜、前房和PCO發(fā)生情況。對PCO發(fā)生情況按Odrich PCO分級［4］:0級:透明; 1級:輕度混濁，能看清眼底或混濁面積小于1/2后囊膜面積;2級:中度混濁，能模糊看見眼底或混濁面積大于1/2后囊膜面積;3級:完全混濁，不能看見眼底。

1.2.4 組織病理學(xué)檢查 術(shù)后6周［5］用空氣栓塞法處死各組兔，摘取術(shù)眼用40 g·L－1多聚甲醛固定6～7 d，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯清洗，石蠟包埋，切片。HE染色:切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水洗，蘇木素染色5 min，自來水沖洗，鹽酸酒精分化30 s，自來水浸泡15 min，置伊紅液2 min，常規(guī)脫水，透明，封片。免疫組織化學(xué)SABC法:二甲苯脫蠟，梯度酒精至水，體積分?jǐn)?shù)30%H2O2室溫封閉10 min;抗原修復(fù)，在0.01 mol·L－1枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)中修復(fù)10 min;滴加體積分?jǐn)?shù)5%BSA封閉液封閉30 min，PCNA一抗4℃過夜;山羊抗小鼠IgG 50 μL，37℃孵育30 min;SABC復(fù)合物37℃孵育20 min。每步驟間隔均用0.01 mol·L－1PBS (pH=7.2～7.6)沖洗。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，烘干，封片。結(jié)果判定:PCNA陽性表達(dá)為細(xì)胞核呈棕黃色。計算陽性細(xì)胞平均光密度值(average optical density，AOD)=總OD值/總面積，普通光學(xué)顯微鏡下每張切片隨機選取6個高倍視野，求均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.5 TUNEL法檢測角膜內(nèi)皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡 術(shù)后6周糖尿病兔術(shù)眼取材，常規(guī)二甲苯脫蠟;梯度酒精至水，體積分?jǐn)?shù)3%H2O2室溫封閉10 min;抗原修復(fù)，在0.01 mol·L－1枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)中修復(fù)10 min;TUNEL反應(yīng)液(TdT反應(yīng)液+標(biāo)記液)50 μL濕盒37℃孵育60 min;轉(zhuǎn)化劑-POD混合液50 μL濕盒37℃孵育30 min;DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，烘干，封片。普通光學(xué)顯微鏡下隨機選取6個高倍視野(×400)，凋亡細(xì)胞呈棕黃色，計算角膜內(nèi)皮凋亡細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)及內(nèi)核層凋亡細(xì)胞的AOD值，AOD=總OD值/總面積。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后觀察情況 A組、B組、C組及D組術(shù)后均出現(xiàn)不同程度的角膜水腫及前房滲出，4組角膜水腫均于術(shù)后3～5 d基本恢復(fù)正常;A組與B組術(shù)后前房滲出較少，于術(shù)后3～5 d基本消失，C組、D組前房滲出于術(shù)后6～7 d恢復(fù)正常。

2.2 晶狀體PCO情況 各組糖尿病兔眼晶狀體囊外摘出術(shù)后6周，可見隨著藥物濃度的增加，PCO程度減輕，各組間PCO分級差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2= 11.134，P=0.011，見表1)，故可認(rèn)為晶狀體PCO級別與前房注射Ecs濃度有關(guān)。

表1 術(shù)后6周時各組PCO分級情況Table 1 PCO grading in each group at postoperative 6 weeks

2.3 HE染色情況 術(shù)后6周從形態(tài)學(xué)上觀察可見各組角膜內(nèi)皮細(xì)胞均排列整齊、未見水腫，視網(wǎng)膜內(nèi)界膜及各層組織結(jié)構(gòu)完整(圖1)，未見藥物引起明顯組織損傷反應(yīng)。

2.4 免疫組織化學(xué)法檢測后囊膜PCNA表達(dá) 術(shù)后6周免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示(圖2)，A組后囊膜可見大量PCNA陽性表達(dá)，B組也可見較多PCNA陽性表達(dá)，C組及D組可見少量PCNA陽性表達(dá)，尤其是D組較少。術(shù)后6周，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.638，P=0.012);B組與A組PCNA陽性表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，余組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＜0.05，見表2)。

Figure 1 Pathologic graph at postoperative 6 weeks(HE，×400;1:Cornea;2:Retina).A:Control group;B:Group D 術(shù)后6周兔眼病理圖片(HE ×400;1:角膜;2:視網(wǎng)膜)。A:對照組;D:D組

Figure 2 Expression of PCDA in LEC at posterior capsule in each group(SP，×400)，LEC nucleus was positive stained with brown-yellow.A-D: Group A to group D 各組后囊膜上LEC中PCNA的表達(dá)(SP，×400)，LEC細(xì)胞核陽性反應(yīng)呈棕黃色。A、B、C、D分別為A組、B組、C組、D組

表2 術(shù)后各組后囊膜LEC PCNA的表達(dá)結(jié)果Table 2 PCNA expression in LEC at posterior capsule in each group (s)

表2 術(shù)后各組后囊膜LEC PCNA的表達(dá)結(jié)果Table 2 PCNA expression in LEC at posterior capsule in each group (s)

Note:Compared with group A，*P＞0.05，#P＜0.05

Group AOD P A 0.499±0.043 －B 0.484±0.055 0.581* C 0.422±0.012 0.016# D 0.340±0.031 0.000#

2.5 角膜內(nèi)皮細(xì)胞及視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡情況TUNEL法原位檢測凋亡陽性細(xì)胞核呈棕褐色，非凋亡細(xì)胞核呈藍(lán)色。各組間角膜內(nèi)皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層細(xì)胞凋亡情況比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＞0.05，見表3-表4)。

3 討論

有研究表明，糖尿病患者行白內(nèi)障手術(shù)治療后PCO的發(fā)生率為10.0%～57.7%，且隨時間的推移而逐漸增加［6］。本課題前期研究也證明:正常血糖兔眼術(shù)后2周為PCO形成最早期，3個月為PCO形成的最顯著期［7］。糖尿病兔發(fā)生PCO的最早期為術(shù)后10 d，最顯著期為術(shù)后6周［5］，PCO發(fā)生及發(fā)展最早及最顯著時間均早于正常兔，說明高血糖可能是加重PCO形成的一個重要因素。

表3 各組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層細(xì)胞的凋亡情況Table 3 Average optical density of retinal ganglion cells and inner nuclear layer cells apoptosis in each group (s)

表3 各組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層細(xì)胞的凋亡情況Table 3 Average optical density of retinal ganglion cells and inner nuclear layer cells apoptosis in each group (s)

Note:Comparison among all groups，F(xiàn)=1.180，P=0.358;Compared with group A，*P＞0.05

Group AOD P A 0.241±0.018 －B 0.251±0.013 0.543* C 0.255±0.032 0.366* D 0.269±0.021 0.090*

表4 各組角膜內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡情況Table 4 Average optical density of corneal endothelial cells apoptosis in each group (s)

表4 各組角膜內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡情況Table 4 Average optical density of corneal endothelial cells apoptosis in each group (s)

Note:Comparison among all groups，F(xiàn)=1.851，P=0.192

Group AOD P A 0.296±0.040 －B 0.304±0.035 0.722 C 0.332±0.024 0.137 D 0.342±0.025 0.067

在PCO的發(fā)生及發(fā)展過程中，整合素起著重要作用。PCO主要是由于術(shù)后殘留的LEC遷移、增殖并纖維化，導(dǎo)致晶狀體PCO發(fā)生［8］。整合素廣泛存在于各種細(xì)胞表面，包括LEC表面，也是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分的主要受體［9］。Ecs屬于Disintergrin家族的一員，具有其家族相似的分子機制和作用特性［10］。體內(nèi)外實驗均表明［11-12］，使用與Ecs有相似結(jié)構(gòu)的Salmosin和Kistrin干預(yù)后，與對照組相比，可明顯抑制LEC的黏附、遷移和增殖，從而抑制PCO的發(fā)展，并且對角膜、虹膜及視網(wǎng)膜均無明顯副作用。范鵬舉等［13］研究發(fā)現(xiàn) Ecs可抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，抑制膠原分泌，減少ECM沉積。周星等［2］研究證明濃度為(5～20)×10－3μg·L－1Ecs對體外人LEC細(xì)胞株SRA01/04的生長具有抑制作用，呈明顯的劑量依賴性及時間依賴性，但濃度為20×10－3μg·L－1時細(xì)胞完全失去正常形態(tài)，出現(xiàn)崩解壞死。同時本課題組前期研究了(5.0～15.0)×10－3μg·L－1Ecs對糖尿病兔早期(10 d)PCO的抑制作用，結(jié)果證明15.0×10－3μg·L－1Ecs對角膜內(nèi)皮細(xì)胞及視網(wǎng)膜細(xì)胞具有明顯的促凋亡作用，因此本實驗研究了濃度為(5.0～10.0)×10－3μg·L－1Ecs對糖尿病兔PCO發(fā)生高峰期(6周)的抑制作用。

通過檢測在不同濃度Ecs的干預(yù)下，糖尿病兔行晶狀體囊外摘出術(shù)后后囊膜LEC中PCNA的表達(dá)，作為判斷Ecs是否能抑制后囊膜LEC增殖的依據(jù)，從而選擇Ecs在糖尿病兔PCO模型中的有效濃度。PCNA是一種僅在增殖細(xì)胞中合成或表達(dá)的核內(nèi)多肽，在細(xì)胞周期G期的晚期開始增加，S期達(dá)到高峰，因此PCNA是細(xì)胞周期S期的特異性標(biāo)記，故檢測PCNA可以很好地評價細(xì)胞的增殖狀態(tài)，可作為檢測LEC增殖的敏感指標(biāo)［14］。本研究結(jié)果顯示: C組、D組均可明顯抑制后囊膜LEC中PCNA表達(dá)，但后者抑制作用較強，說明Ecs對糖尿病兔后囊膜上LEC增殖具有明顯抑制作用，而B組后囊膜LEC中PCNA表達(dá)與A組無明顯差異。同時在裂隙燈下觀察PCO分級同樣證明D組Ecs對糖尿病兔PCO的形成抑制作用較明顯。其發(fā)生機制可能為Ecs與LEC表面整合素受體結(jié)合而抑制了整合素與ECM結(jié)合，細(xì)胞增殖受到抑制，減少了LEC與后囊膜的黏附作用，使LEC增殖及移行能力進(jìn)一步下降，凋亡增加，因而抑制了PCO的形成。由此說明，10.0× 10－3μg·L－1Ecs在糖尿病兔PCO模型中使用是有效的，但還需進(jìn)一步探討其安全性。

采用HE染色法觀察各組角膜及視網(wǎng)膜的變化發(fā)現(xiàn)，B組、C組、D組與A組角膜和視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)均無明顯差異，未見組織結(jié)構(gòu)有明顯損傷。同時通過TUNEL法檢測角膜內(nèi)皮細(xì)胞及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層細(xì)胞的凋亡時發(fā)現(xiàn)，B組、C組、D組對眼內(nèi)相鄰組織(角膜)及重要光感受結(jié)構(gòu)(視網(wǎng)膜)均未造成損害，且細(xì)胞未發(fā)生明顯凋亡，說明10.0×10－3μg·L－1Ecs在眼內(nèi)使用是安全的。

總之，本研究證明10.0×10－3μg·L－1Ecs在PCO的形成中對LEC的增殖具有抑制作用，且對眼內(nèi)相鄰及重要組織無明顯毒性作用，因此可以選用此濃度在眼內(nèi)進(jìn)行后續(xù)實驗研究，但其在臨床應(yīng)用的可能性尚需進(jìn)一步探討。

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