慢性HBV攜帶孕婦產(chǎn)后自發(fā)HBeAg和HBsAg血清清除或轉(zhuǎn)換的病毒學(xué)因素分析*

馮振華，張姝，劉景麗，畢永春，夏挺，許碧云，胡婭莉，周乙華

·乙型肝炎·

慢性HBV攜帶孕婦產(chǎn)后自發(fā)HBeAg和HBsAg血清清除或轉(zhuǎn)換的病毒學(xué)因素分析*

馮振華，張姝，劉景麗，畢永春，夏挺，許碧云，胡婭莉，周乙華

目的探討影響慢性乙型肝炎病毒（HBV）攜帶孕婦產(chǎn)后自發(fā)HBeAg和HBsAg血清清除或轉(zhuǎn)換的相關(guān)病毒學(xué)特征。方法2002年8月～2004年7月本院診斷的慢性HBV攜帶孕婦，自2009年10月～2010年3月間隨訪，檢測HBV血清學(xué)標(biāo)志和病毒相關(guān)特性。結(jié)果在本組419例慢性HBV攜帶孕婦中，經(jīng)隨訪平均6.4年，失訪155例。在接受隨訪的264例（63.0%）中，76例（28.8%）孕期在入組時(shí)HBeAg陽性，其中42例（55.3%）隨訪時(shí)發(fā)生自發(fā)HBeAg轉(zhuǎn)換,這些孕婦孕期HBV DNA、HBeAg和HBsAg均低于34例未轉(zhuǎn)換組（P值均＜0.01）。在6例血清HBV DNA＜1×106IU/ml、17例HBeAg＜700 S/CO和13例HBsAg＜1×104IU/ml孕婦中，隨訪時(shí)自發(fā)HBeAg轉(zhuǎn)換分別高達(dá)100.0%、100.0%和92.3%。隨訪時(shí)，38例（14.4%）孕婦自發(fā)HBsAg清除，HBsAg清除組孕期HB-sAg水平明顯低于226例未清除組（P＜0.001）。在25例血清HBsAg＜100 IU/mL孕婦中，隨訪時(shí)56.0%自發(fā)HBsAg清除。結(jié)論外周血HBV DNA載量低（＜1×106IU/ml）、HBeAg水平低（＜700 S/CO）或HBsAg水平低（＜1× 104IU/ml）是自發(fā)HBeAg血清轉(zhuǎn)換的有利因素，而當(dāng)HBsAg＜100 IU/mL時(shí)，更易發(fā)生自發(fā)HBsAg血清清除。

乙型肝炎病毒攜帶者；孕婦；HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換；HBsAg血清學(xué)清除

研究表明，自發(fā)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換以及HBsAg清除受多種因素的影響，如年齡、性別、病毒基因型、前C區(qū)突變、ALT水平、HBV DNA載量以及HBsAg水平等[1，2]。血清HBV DNA載量低，易發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換[3，4]；HBsAg水平低，易發(fā)生HBsAg清除、甚至出現(xiàn)抗-HBs陽轉(zhuǎn)[5～7]，但我國對慢性HBV感染者自發(fā)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換和HBsAg清除的研究較少。本研究圍繞HBV感染孕婦，分析產(chǎn)后發(fā)生自發(fā)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換和/或HBsAg清除的婦女在孕期的病毒學(xué)指標(biāo)，探討這些指標(biāo)預(yù)測血清學(xué)轉(zhuǎn)換或清除的可行性。

1 對象與方法

1.1 研究對象2002年8月～2004年7月，我們在實(shí)施“江蘇省人口出生缺陷干預(yù)項(xiàng)目”時(shí)[8]，收集了江蘇省14個縣市共19 904例年齡為（25.1±3.2）歲（20～40歲）、孕15～20周的孕婦血清，-30℃凍存。2009年7月～9月，隨機(jī)選取其中6 398例孕期血清，檢測HBV血清學(xué)標(biāo)志，確定慢性HBV感染419例（6.55%），其中HBeAg陽性125例（29.8%）[9]。2009年10月～2010年3月期間，計(jì)劃對上述419例孕期HBsAg陽性婦女進(jìn)行隨訪，記錄一般資料和治療情況，同時(shí)采集外周血，-30℃凍存。本研究獲得南京市鼓樓醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象簽署知情同意書。

1.2 血清HBV標(biāo)志物檢測采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司）定性檢測HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe和抗-HBc；采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法（AxSYM AUSAB，美國雅培）定量檢測HBsAg和HBeAg。對HBsAg滴度大于檢測上限250 IU/mL的樣本，進(jìn)一步用含15%小牛血清的PBS稀釋后檢測。

1.3 血清HBV DNA檢測采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（上海申友生物技術(shù)有限責(zé)任公司）檢測血清HBV DNA載量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國Stratagene公司。HBV DNA檢測下限為500 IU/ml。

1.4 HBV前C區(qū)G1896A突變及基因分型鑒定取蛋白酶K，加入待測血清200 μl，過夜消化，加酚/氯仿，提取DNA。以此為模板，用巢式PCR法擴(kuò)增前C區(qū)/C區(qū)基因片段，第一輪PCR引物C1為:5'-CATGGAA/GACCACCGTGAACG-3'，C2:5'-CAGGATTAAA-

GACAGGTACAG-3'；第二輪PCR引物C3為:5'-GCCCAAGGTCTTAC/TATAAGAG-3'，C4:5'-AGTTTCCCACCTTATGAGT-3'。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，采用BigDye Terminator v3.1測序試劑（美國ABI公司）進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)，其產(chǎn)物在基因分析儀（ABI 3130型）上進(jìn)行DNA序列測定，確定第1896位堿基G是否突變?yōu)锳（G1896A）。采用Lasergene軟件進(jìn)行基因分型，將前C區(qū)/C區(qū)序列與GenBank中已知的不同基因型HBV（A～H基因型）進(jìn)行比較，構(gòu)建分子進(jìn)化樹[10]，確定其HBV基因型。對前C區(qū)/C區(qū)突變較多，不能判斷基因型的HBV病毒株，采用巢式PCR法進(jìn)一步擴(kuò)增其S區(qū)，進(jìn)行基因分型，方法與前C區(qū)/C區(qū)基因分型類似。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。當(dāng)血清HBV DNA小于檢測下限時(shí)，按照500 IU/mL計(jì)算[11]。將HBV DNA（IU/ml）、HBeAg（S/CO）和HBsAg（IU/ml定量水平轉(zhuǎn)化為對數(shù)值后進(jìn)行兩組間比較，組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，率的比較采用x2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。不同HBV DNA、HBeAg和HBsAg水平間轉(zhuǎn)換/清除率的比較采用趨勢x2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象基本特征納入隨訪的419例婦女，孕期血清HBsAg陽性，ALT水平正常。在隨訪過程中，失訪155例。在隨訪的264例中，孕期平均年齡（24.9± 3.3）歲，現(xiàn)平均年齡（31.3±3.2）歲，平均隨訪時(shí)間（6.4±0.8）年，其中76例（28.8%）入組時(shí)HBeAg陽性。所有婦女均未接受過抗病毒治療。在264例婦女中，13例因血清不足或HBV DNA陰性而未確定基因型，在其余251例中，173例（68.9%）為C型，77例（30.7%）為B型和1例（0.4%）為G型。

2.2 決定自發(fā)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的因素分析在76例孕期HBeAg陽性婦女，平均隨訪6.4年后，42例（55.3%）自發(fā)HBeAg轉(zhuǎn)陰，且抗-HBe陽轉(zhuǎn)。根據(jù)隨訪時(shí)HBeAg血清學(xué)是否轉(zhuǎn)換，將這些病例分為HBeAg轉(zhuǎn)換組和未轉(zhuǎn)換組。兩組人群年齡、病毒基因型以及有無G1896A突變均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）；與未轉(zhuǎn)換組比，轉(zhuǎn)換組婦女孕期HBV DNA、HBsAg和HBeAg水平均較低（P值均＜0.01）。

表1 HBeAg轉(zhuǎn)換與未轉(zhuǎn)換婦女孕期資料（）比較

表1 HBeAg轉(zhuǎn)換與未轉(zhuǎn)換婦女孕期資料（）比較

①2例因血清量不足，未確定基因型

轉(zhuǎn)換（n=42）未轉(zhuǎn)換（n=34）P值年齡（歲）24.1±2.824.5±2.60.516 HBV DNA（lg IU/mL）7.0±1.38.0±0.5＜0.001 HBsAg（lg IU/mL）4.4±0.84.8±0.30.018 HBeAg（lg S/CO）2.8±0.43.1±0.2＜0.001病毒基因型①B型（%）13（65.0）7（35.0）0.250 C型（%）27（50.0）27（50.0）前C區(qū)1896野生型（G）41340.345突變型（A或G/A）10

我們進(jìn)一步比較了孕期不同HBV DNA、HBsAg和HBeAg水平婦女在隨訪時(shí)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換情況。表2顯示，孕期HBV DNA、HBeAg或HBsAg水平越低的人群，HBeAg轉(zhuǎn)換率越高。

表2 孕期不同HBV DNA、HBsAg和HBeAg水平人群自發(fā)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率比較

在隨訪時(shí)，HBeAg轉(zhuǎn)換人群血清HBV DNA和HBsAg水平都較孕期明顯降低，而在未轉(zhuǎn)換人群，兩者水平較孕期均無顯著性下降（表3）。

表3 HBeAg轉(zhuǎn)換與未轉(zhuǎn)換人群血清和病毒學(xué)指標(biāo)()變化比較

表3 HBeAg轉(zhuǎn)換與未轉(zhuǎn)換人群血清和病毒學(xué)指標(biāo)()變化比較

①突變?yōu)锳或G/A共存

孕期隨訪P值轉(zhuǎn)換組（n=42）HBV DNA（lg IU/ml）7.0±1.33.5±1.3＜0.001 HBsAg（lg IU/ml）4.4±0.83.5±0.5＜0.001 G1896A突變①（%）1（2.4）28（66.7）＜0.001未轉(zhuǎn)換組（n=34）HBV DNA（lg IU/ml）8.0±0.58.0±0.50.922 HBsAg（lg IU/ml）4.8±0.34.7±0.40.368 G1896A突變①（%）0（0.0）2（5.9）0.493

2.3 決定自發(fā)HBsAg血清清除的因素分析在264例孕期HBsAg陽性婦女中，隨訪時(shí)38例（14.4%）出現(xiàn)自發(fā)HBsAg清除，其中16例出現(xiàn)抗-HBs陽轉(zhuǎn)。HBsAg清除與未清除人群孕期一般情況和病毒學(xué)特征的比較見表4。與未清除組比，清除組孕期HBsAg水平較低。

表4 HBsAg清除與未清除婦女孕期資料（）比較

表4 HBsAg清除與未清除婦女孕期資料（）比較

①13例未確定基因型

清除組（n=38）未清除組（n=226）P值年齡（歲）24.4±3.125.0±3.30.281 HBsAg（lg IU/mL）2.8±1.33.7±0.9＜0.001 HBV DNA（lg IU/mL）4.2±2.14.2±2.30.994基因型①B型（%）8（10.4）69（89.6）0.129 C型（%）21（12.1）152（87.9）G型（%）1（100.0）0（0.0）

我們進(jìn)一步比較了孕期不同HBsAg水平婦女，在隨訪時(shí)自發(fā)HBsAg清除情況。如表5所示，孕期低水平HBsAg（＜100 IU/ml）的婦女，HBsAg清除率較高。

表5 孕期不同HBsAg水平人群自發(fā)血清HBsAg清除率比較

3 討論

本研究對264例慢性HBV攜帶孕婦平均隨訪6.4年，發(fā)現(xiàn)55.3%自發(fā)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，年均轉(zhuǎn)換率約為8.6%；14.4%自發(fā)HBsAg血清清除，年均清除率約為2.3%。該結(jié)果與其他報(bào)道亞洲人群年自發(fā)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率1.6%～12.5%[3，4，12～14]和年自發(fā)HBsAg清除率0.12%～2.38%一致[2]。當(dāng)孕婦孕期HBVDNA＜1×106IU/ml、HBeAg＜700S/CO或HBsAg＜1×104IU/ml時(shí)，產(chǎn)后隨訪期間自發(fā)HBeAg血清轉(zhuǎn)換率分別高達(dá)100.0%、100.0%和92.3%；當(dāng)孕期HBsAg＜100 IU/ml0時(shí)，產(chǎn)后自發(fā)HBsAg清除率為56.0%。

相關(guān)研究表明，血清HBV DNA水平低者，易發(fā)生HBeAg血清轉(zhuǎn)換。但因研究對象、HBV基因型和隨訪時(shí)間等差異，預(yù)測HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的HBV DNA閾值（2×104IU/ml或2×106IU/ml）不盡相同[4]。本研究為1×106IU/ml，與這些結(jié)果類似。Bae et al研究表明，當(dāng)HBeAg＜100 PEI U/ml時(shí)，未來1年內(nèi)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率高達(dá)47.6%。本研究也證實(shí)，當(dāng)HBeAg＜700 S/CO時(shí)（按1 S/CO= 0.222 PEI U/ml計(jì)算，約等于155 PEI U/mL），100%自發(fā)HBeAg血清轉(zhuǎn)換。此外，本研究顯示，當(dāng)HBsAg＜1×104IU/ml時(shí)，隨訪期間自發(fā)HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率為92.3%，與低水平HBsAg反映機(jī)體對HBV的免疫控制狀況較好有關(guān)。

本研究表明，血清HBsAg＜100 IU/ml的攜帶者容易自發(fā)HBsAg清除，這與近期相關(guān)研究結(jié)果一致[7，11]。本研究中HBsAg清除組與未清除組HBV DNA水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與清除組病例數(shù)較少有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)換組在隨訪6年時(shí)有66.7%婦女HBV發(fā)生G1896A突變，而未轉(zhuǎn)換組僅5.9%。但因我們僅隨訪一次，不能確定G1896A突變發(fā)生與HBeAg血清轉(zhuǎn)換的時(shí)間順序。有研究顯示，以G1896A突變株感染為主的患者比僅感染野生株的患者容易出現(xiàn)HBeAg血清清除/轉(zhuǎn)換（OR=1.53；P=0.043）[4]。

但本研究仍有不足之處，只進(jìn)行了單個時(shí)間點(diǎn)隨訪，不能確定這些HBeAg和HBsAg清除/轉(zhuǎn)換者的具體清除/轉(zhuǎn)換時(shí)間。不過，血清HBeAg和HBsAg血清學(xué)清除/轉(zhuǎn)換情況仍可反映總體婦女病毒清除/轉(zhuǎn)換率概況。

本研究結(jié)果對決定慢性HBV攜帶孕婦產(chǎn)后是否需要抗病毒治療有較大的指導(dǎo)意義。綜合本研究結(jié)果，我們認(rèn)為，當(dāng)孕產(chǎn)婦血清HBV DNA＜1×106IU/ml或HBeAg＜700 S/CO或HBsAg＜1×104IU/m l時(shí)，產(chǎn)后易發(fā)生自發(fā)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。特別是當(dāng)血清HBsAg＜1×100 IU/ml時(shí)，婦女容易出現(xiàn)自發(fā)HBsAg清除。因此，如果此類患者無明顯肝纖維化或肝硬化等其他需要抗病毒治療的指征，可暫時(shí)不使用抗病毒藥物，而對于有肝功能異常情況時(shí)，則須按一般處理原則加強(qiáng)隨訪，及時(shí)作出必要的處理。

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（收稿：2013-12-23）

（校對：陳從新）

Virologic determinants of postpartum spontaneous HBeAg and/or HBsAg seroclearance or seroconver-sion in pregnant women who are chronic hepatitis B virus carriers

Feng Zhenhua，Zhang Shu，Liu Jingli，etal.Departments of Scientific Research，Nanjing Drum Tower Hospital，Affiliated to Nanjing University Medical School，Nanjing 210008，Jiangsu Province，China

ObjectiveTo study the virologic determinants of spontaneous seroclearance or seroconversion of HBeAg and/or HBsAg in pregnant women who are chronic hepatitis B virus（HBV）carriers.MethodsThe pregnant women diagnosed as chronic HBV carriers between August，2002 and July，2004 were included and followed up between October，2009 and March，2010.The HBV serologic markers and HBV DNA were detected. ResultsA total of 419 individuals were recruited in this study，and the average follow-up period was 6.4 years. Although 155 women lost，a total of 264（63.0%）women were successfully followed up，of whom 76（28.8%）were HBeAg-positive at presentation.55.3%（42/76）of HBeAg-positive women were seroconverted to anti-HBe spontaneously at the follow-up.Compared with 34 women without seroconversion，42 with HBeAg/anti-HBe seroconversion had lower levels of serum HBV DNA，HBeAg and HBsAg（all P＜0.01）.The postpartum HBeAg seroconversion rate in 6 pregnant women with HBV DNA＜1×106IU/ml，17 with HBeAg＜700 S/CO，and 13 with HBsAg＜1×104IU/ml were 100.0%，100.0%and 92.3%，respectively.The spontaneous HBsAg seroclearance was found in 38（14.4%）women at the follow-up.The serum HBsAg levels at presentation were significantly lower in women with HBsAg seroclearance than 226 without HBsAg seroclearance（P＜0.001）.The postpartum HBsAg seroclearance rate in 25 pregnant women with HBsAg＜100 IU/ml was as high as 56.0%.ConclusionsHBeAg-positive women with serum HBV DNA＜1×106IU/ml，HBeAg＜700 S/CO and/or HB-sAg＜1×104IU/ml are more likely to undergo spontaneous HBeAg seroconversion，and those with serum HBsAg＜100 IU/ml have a higher chance of spontaneous HBsAg seroclearance.

HepatitisBviruscarrier；Pregnant women；HBeAg seroconversion；HBsAg seroclearance

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.04.011

南京市第一層次衛(wèi)生人才項(xiàng)目（編號：2011024）；南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院青年科研啟動基金（編號：QJ2012013）

210008南京市南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院科研部（馮振華，劉景麗，周乙華）；檢驗(yàn)科（畢永春，夏挺）；婦產(chǎn)科（張姝，胡婭莉）；統(tǒng)計(jì)室（許碧云）

馮振華,女，30歲，碩士研究生，研究實(shí)習(xí)員。主要從事病毒性肝炎的研究。E-mail：fengzhenhua1222@163.com

周乙華，E-mail：zgr03summer@126.com