哺乳動(dòng)物DNA甲基化及其在體細(xì)胞誘導(dǎo)重編程中的作用

宋紅衛(wèi), 安鐵洙, 樸善花, 王春生

東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 哈爾濱 150040

哺乳動(dòng)物DNA甲基化及其在體細(xì)胞誘導(dǎo)重編程中的作用

宋紅衛(wèi), 安鐵洙, 樸善花, 王春生

東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 哈爾濱 150040

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cell, iPS)技術(shù)提供了將終末分化的細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為多潛能干細(xì)胞的可能, 在干細(xì)胞基礎(chǔ)理論研究和再生醫(yī)學(xué)中具有重要意義。然而, 目前體細(xì)胞誘導(dǎo)重編程方法效率極低, 常發(fā)生不完全的重編程。研究表明, 在不完全重編程的細(xì)胞中存在體細(xì)胞的表觀遺傳記憶, 而DNA甲基化作為相對長期和穩(wěn)定的表觀遺傳修飾, 是影響重編程效率和iPS細(xì)胞分化能力的重要因素之一。哺乳動(dòng)物 DNA甲基化是指胞嘧啶第五位碳原子上的甲基化修飾, 常發(fā)生于CpG位點(diǎn)。DNA甲基化能夠調(diào)節(jié)體細(xì)胞特異基因和多能性基因的表達(dá), 因此其在哺乳動(dòng)物基因調(diào)控、胚胎發(fā)育和細(xì)胞重編程過程中發(fā)揮著重要作用。此外, 異常DNA甲基化可能導(dǎo)致iPS細(xì)胞基因印記的異常和X染色體的失活。文章重點(diǎn)圍繞DNA甲基化的機(jī)制、分布特點(diǎn)、及其在體細(xì)胞誘導(dǎo)重編程中的作用進(jìn)行了綜述。

DNA甲基化; 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞; 體細(xì)胞重編程

哺乳動(dòng)物是由受精卵經(jīng)過分裂和分化最終形成的復(fù)雜的多細(xì)胞生命體。不同類型的細(xì)胞含有相同的基因組, 但基因的表達(dá)具有時(shí)空特異性。與原核生物不同, 哺乳動(dòng)物的DNA、組蛋白、非組蛋白和少量 RNA形成特殊的染色體結(jié)構(gòu)。在染色體中, DNA的甲基化、組蛋白修飾和染色體重塑等表觀遺傳因素都能夠影響相應(yīng)基因的表達(dá), 在細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育中具重要作用[1～3]。

1957年, Waddington提出的表觀遺傳模型描述了表觀遺傳在哺乳動(dòng)物發(fā)育過程中的作用[4]。模型中將分化中的細(xì)胞比作山坡上滾落的石頭。受精卵具有全能性, 位于山坡的最頂端; 細(xì)胞沿著不同的路徑“滾落”, 最終形成某些成體干細(xì)胞和各種終末分化細(xì)胞。該模型認(rèn)為, 細(xì)胞不同的分化狀態(tài)由不同的表觀遺傳組所限定和維持, 這就決定了細(xì)胞分化的單向性和不可逆性。因此, 分化成熟的體細(xì)胞逆轉(zhuǎn)成多能干細(xì)胞的過程中必然發(fā)生表觀遺傳重編程[5,6], 而核移植、細(xì)胞融合和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞等體細(xì)胞重編程技術(shù)的出現(xiàn), 證明了體細(xì)胞的終末分化狀態(tài)在一定條件下能夠發(fā)生逆轉(zhuǎn), 從而重編程為多能干細(xì)胞。

綜上所述, 細(xì)胞發(fā)生重編程必須克服自身的表觀遺傳障礙。DNA甲基化作為一種關(guān)鍵的表觀遺傳因素, 能夠維持細(xì)胞長期的表觀遺傳記憶, 在細(xì)胞重編程中具有重要作用[7,8]。本文重點(diǎn)論述了 DNA甲基化的相關(guān)機(jī)制及其在細(xì)胞誘導(dǎo)重編程中的作用。

1 DNA甲基化

在哺乳動(dòng)物中, 胞嘧啶第五位碳原子可在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的催化作用下, 由 S-腺苷甲硫氨酸提供甲基, 最終產(chǎn)生5-甲基胞嘧啶(5mC)[9]。DNA甲基化與基因沉默、基因組的穩(wěn)定性、X染色體失活和遺傳印記等多種生命現(xiàn)象有關(guān)[10,11]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和催化DNA主動(dòng)去甲基化酶對于維持和調(diào)節(jié)不同分化階段細(xì)胞的DNA甲基化水平具有重要作用。此外, DNA甲基化可發(fā)生于基因組的不同區(qū)域, 并通過抑制轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合等方式影響基因的表達(dá)。異常的DNA甲基化能夠?qū)е屡咛グl(fā)育的異常和某些疾病(如癌癥)的產(chǎn)生, 但其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

1.1 DNA甲基化的分子機(jī)制

與DNA甲基化修飾相關(guān)的酶有兩種：維持甲基轉(zhuǎn)移酶(Maintenance methyltransferase)和從頭甲基轉(zhuǎn)移酶(De novo methyltransferase)。DNMT1是維持甲基轉(zhuǎn)移酶, 在DNA復(fù)制過程中催化新合成鏈的甲基化, 從而維持親代與子代DNA甲基化修飾的一致性[12]。UHRF1蛋白能夠識別并結(jié)合半甲基化的DNA鏈, 招募 DNMT1完成甲基化的修飾[13]。Dnmt1在終末分化的細(xì)胞中高表達(dá), 而在胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells, ESCs)中幾乎不表達(dá)。Dnmt1缺失突變的小鼠細(xì)胞中 5mC的水平降低約 2/3, 并導(dǎo)致胚胎死亡[14]。與 DNMT1不同, 從頭甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3a和DNMT3b的作用不依賴DNA的復(fù)制,而在原先未發(fā)生甲基化的特定位點(diǎn)上進(jìn)行新的甲基化修飾[12,15]。小鼠Dnmt3b高表達(dá)于囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和胚外組織中, Dnmt3b敲除的小鼠胚胎在著床前因發(fā)育異常而死亡。Dnmt3a在胚胎發(fā)育第10.5 d(E10.5)才開始廣泛表達(dá)于各種組織細(xì)胞中, 而 Dnmt3a表達(dá)缺陷的小鼠在出生后的早期死亡[16]。維持甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3L沒有催化活性, 但能結(jié)合到未甲基化的 H3K4(組蛋白 H3第四位賴氨酸)上, 并招募DNMT3a和DNMT3b催化相應(yīng)DNA位點(diǎn)重新甲基化[17,18]。因此, DNMTs在調(diào)節(jié)和維持胚胎發(fā)育過程中正常的DNA甲基化水平中具有重要作用。

Dnmt1的異常表達(dá)與某些腫瘤的生長具有相關(guān)性, 如淋巴瘤和乳腺癌等[19]。低劑量的 5-氮雜胞苷(5-Azacitidine, 5-Aza)能夠通過抑制DNMT1降低腫瘤干細(xì)胞(CSCs)的數(shù)量, 并延長小鼠的存活時(shí)間[20],其原因可能是DNMT1催化了某些抑癌基因和干性相關(guān)通路基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化, 從而維持了CSCs的致癌性和增殖能力。

1.2 DNA去甲基化的分子機(jī)制

DNA去甲基化有被動(dòng)和主動(dòng)兩個(gè)不同的途徑。DNA被動(dòng)去甲基化是由于 Dnmt1表達(dá)的缺失, 在DNA復(fù)制時(shí)新合成的鏈不能被甲基化修飾, 因而全基因組的甲基化隨著細(xì)胞分裂被“稀釋”[15]。例如,小鼠早期卵裂時(shí)Dnmt1表達(dá)水平很低, 而DNA甲基化水平隨著細(xì)胞的分裂逐漸降低[21]。DNA主動(dòng)去甲基化需要特定的酶參與, 如 TET家族(Ten-eleven translocation family)蛋白(包括TET1、TET2和TET3)能使 5mC氧化形成 5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC), 并且5hmC能被TETs進(jìn)一步氧化形成 5-甲酰胞嘧啶(5-formylcytosine, 5fC)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine, 5caC)[15,22]。5fC和5caC被胸腺嘧啶 DNA糖基化酶(Thymine-DNA glycosylase, TDG)進(jìn)一步修飾, 最終通過堿基修復(fù)途徑轉(zhuǎn)變?yōu)榘奏23]。另外, 激活誘導(dǎo)胞啶脫氨酶(Activation-induced cytidine deaminase, AID)可能使5mC發(fā)生脫氨基作用, 形成 5-羥甲基尿嘧啶(5-hydroxymethyluracil, 5hmU), 再通過堿基切除修復(fù)最終完成DNA主動(dòng)去甲基化[22～24]。

DNA主動(dòng)去甲基化對胚胎的正常發(fā)育具有重要影響。TET3是成熟卵母細(xì)胞中的一種重要的母源性因子, 在受精后雄原核DNA主動(dòng)去甲基化過程中具有重要作用[25]。小鼠囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中Tet1和Tet2表達(dá)豐富, 但隨著細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育而逐漸降低[26]。TET1能通過去甲基化作用調(diào)節(jié)多能性基因(如Nanog、Esrrb、Klf4和 Prdm14等)的表達(dá), 而利用siRNA技術(shù)干擾Tet1的表達(dá)后, ESCs的多潛能性降低, 并且容易分化為胚外組織[22,27]。因此, TET1和TET2可能是 ESCs多能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一部分。TETs和5hmC的水平能夠影響胚胎的正常發(fā)育, 如造血干細(xì)胞、腦組織和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育[28], 而人類中 TET1和 TET2的異常表達(dá)可能與某些腫瘤相關(guān),如前列腺癌和結(jié)腸癌等[29]。

1.3 DNA甲基化的分布特點(diǎn)

哺乳動(dòng)物體細(xì)胞中 5mC幾乎全部發(fā)生于 CpG位點(diǎn)上, 但在人類胚胎干細(xì)胞(hESCs)中發(fā)現(xiàn), 約有25%的 5mC發(fā)生于非 CpG(Non-CpG)位點(diǎn)上, 如CpA和CpT[6,30]。非CpG位點(diǎn)5mC的發(fā)生與DNMT3a和DNMT3b的作用有關(guān)[31]。已經(jīng)有研究證實(shí)非CpG位點(diǎn)的甲基化對 ESCs多能性的維持具有一定作用,但其具體的分布情況和功能仍有待進(jìn)一步的研究。

DNA甲基化可發(fā)生于基因組的不同區(qū)域, 如基因的啟動(dòng)子、遠(yuǎn)端調(diào)控序列、轉(zhuǎn)錄區(qū)和側(cè)翼序列等[3,32,33]。這些不同區(qū)域的甲基化對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)有所不同。例如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的高甲基化常引起基因的轉(zhuǎn)錄沉默, 而基因轉(zhuǎn)錄區(qū)的甲基化則可能與基因的轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)。當(dāng)基因的啟動(dòng)子含有高水平的甲基化時(shí), 其附近的染色體結(jié)構(gòu)常發(fā)生凝聚, 暗示 DNA甲基化與組蛋白修飾因子或染色體重塑因子的相互作用, 但其具體機(jī)制尚不清楚。

某段 DNA序列的甲基化水平往往與該段序列CpG的密度呈負(fù)相關(guān)[32]。低密度 CpG(low-CpG)序列常發(fā)生高甲基化, 見于大多數(shù)組織特異性基因(Tissue-specific genes)中[15,32,34]。而高密度CpG(high-CpG)序列常維持相對低水平的甲基化, 主要包括持家基因和發(fā)育相關(guān)基因等[15,35]。低密度CpG序列的高甲基化可能作為一種比較長期和穩(wěn)定的表觀遺傳修飾, 從而在相當(dāng)長的時(shí)期內(nèi)維持體細(xì)胞正常的表觀遺傳特征。某段DNA序列中CpG密度大于50%且長度大于200 bp時(shí)稱為CpG島(CpG island, CpGi)[36]。多能性基因和發(fā)育相關(guān)基因的啟動(dòng)子常含有 CpG島[15,37]。Mohn等[38]將小鼠ESCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)祖細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞后, 利用甲基化DNA免疫沉淀技術(shù)(MeDIP)分析全基因組啟動(dòng)子的甲基化, 發(fā)現(xiàn)某些含CpG島的基因啟動(dòng)子在神經(jīng)發(fā)育的早期即被甲基化, 并且這些基因的甲基化大部分是神經(jīng)細(xì)胞所特有的, 對于其命運(yùn)的決定具有重要作用。

1.4 DNA甲基化與基因的表達(dá)

DNA甲基化是影響基因表達(dá)調(diào)控的重要因素?；騿?dòng)子的甲基化能夠阻礙轉(zhuǎn)錄因子與 DNA的結(jié)合, 從而抑制轉(zhuǎn)錄。例如, 多能性轉(zhuǎn)錄因子c-Myc的識別靶序列CACGTG中含有CpG, 后者被甲基化后降低了 c-Myc與靶序列的親和力, 影響基因轉(zhuǎn)錄[39]。而FoxA1蛋白能夠結(jié)合到被甲基化的基因遠(yuǎn)端調(diào)控序列上[40]。此外, 基因側(cè)翼序列的甲基化可使染色體結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定, 不利于轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合從而抑制轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成。因此對于不同的轉(zhuǎn)錄因子, 在基因組上結(jié)合的區(qū)域(如啟動(dòng)子和遠(yuǎn)端調(diào)控序列等)不同, DNA甲基化對其調(diào)節(jié)作用也不同。此外, 甲基化的DNA可通過甲基化CpG結(jié)合蛋白影響相關(guān)基因表達(dá)。例如, 甲基化 CpG結(jié)合蛋白2(Methyl-CpG-binding protein2, MeCP2)是人類神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子, 能夠結(jié)合5mC并招募組蛋白去乙?；?HDACs)使組蛋白去乙酰化, 最終使基因處于沉默狀態(tài)[41]。甲基化 CpG 結(jié)合蛋白MBD3能識別并結(jié)合5hmC, 是核小體重塑去乙?；?Nucleosome remodeling deacetylase, NuRD)復(fù)合物的一部分[42]。TET1催化 5mC轉(zhuǎn)變?yōu)?5hmC后, MBD3作為DNA序列上5hmC的“閱讀器”(Reader of 5hmC)介導(dǎo) NuRD對組蛋白的去乙?；饔? 進(jìn)而導(dǎo)致基因沉默[6,42,43]。因此, 甲基化CpG結(jié)合蛋白能將兩個(gè)重要的表觀遺傳因素——DNA甲基化和組蛋白修飾聯(lián)系起來, 共同調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。目前DNA甲基化和組蛋白修飾相互作用的具體機(jī)制仍不清楚, 相關(guān)領(lǐng)域的研究對于進(jìn)一步揭示DNA甲基化在基因調(diào)控中的作用具有重要意義。

2 DNA甲基化在體細(xì)胞誘導(dǎo)重編程中的作用

2.1 體細(xì)胞誘導(dǎo)重編程

Waddington的表觀遺傳模型認(rèn)為動(dòng)物細(xì)胞的分化是不可逆的。而1962年, Gurdon[44]將蝌蚪(Xenopus laevis)中腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞核移植到去核卵母細(xì)胞中并成功發(fā)育為性成熟的蛙, 首次在理論上證明了動(dòng)物終末分化的細(xì)胞能夠發(fā)生逆轉(zhuǎn)。1987年, Lassar等[45]通過外源表達(dá)一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子 MyoD, 將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌細(xì)胞。這項(xiàng)研究暗示了只需通過外源轉(zhuǎn)錄因子的誘導(dǎo)即可使細(xì)胞發(fā)生重編程。2006年, Yamanaka等[46]通過外源表達(dá) 4個(gè)多能性轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc, 將小鼠胚胎皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蓄愃朴?ESCs多向分化潛能和自我更新能力的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells, iPSCs)。目前, iPSCs可以由多種終末分化的細(xì)胞得到, 并可直接來源于病人的體細(xì)胞。iPS技術(shù)避免了人類胚胎干細(xì)胞研究的倫理和自體免疫等重大問題, 因而在細(xì)胞移植、藥物篩選和疾病模型的建立中具有巨大的應(yīng)用前景。近年來 iPS技術(shù)不斷發(fā)展, 例如減少外源誘導(dǎo)因子的使用, 以及誘導(dǎo)過程中非整合型載體、小分子化合物和 microRNA的應(yīng)用等[47～49]。然而這些方法與技術(shù)上的改進(jìn)仍無法徹底解決 iPS的低效性、致癌性和免疫原性等問題, 而這些問題的解決是未來體細(xì)胞重編程能否更廣泛地應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)的關(guān)鍵。

2.2 DNA甲基化是體細(xì)胞誘導(dǎo)重編程的重要障礙

目前的研究表明, 體細(xì)胞被誘導(dǎo)為 iPSCs的過程中經(jīng)歷了一系列有序的生物學(xué)事件, 包括外源基因的表達(dá)、全基因組組蛋白修飾的改變、間充質(zhì)細(xì)胞向上皮樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(Mesenchymal-to-epithelial transition, MET)、內(nèi)源多能性轉(zhuǎn)錄因子的激活和全集因組DNA的去甲基化等[2,3,50]。因此, 表觀遺傳的改變是誘導(dǎo)多能干細(xì)胞所必需的。相比于組蛋白修飾, DNA的去甲基化是一個(gè)相對緩慢且低效的過程。全基因組甲基化狀態(tài)的改變發(fā)生于 iPS的最后階段, 推測其可能是 iPS的限速步驟, 決定最終iPSCs產(chǎn)生的效率和分化能力。DNA甲基化在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中的作用有以下4方面：

(1) 不徹底的DNA甲基化重編程降低了iPSCs的分化能力。為探究DNA甲基化對iPSCs分化潛能的影響, Kim等[51]通過四因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)的誘導(dǎo), 經(jīng)過較少的傳代次數(shù)(Low-passage),分別將成年小鼠的血細(xì)胞和成纖維細(xì)胞重編程為iPSCs。然后在相同的誘導(dǎo)條件下, 血細(xì)胞來源的iPCSs(B-iPSCs)更傾向于分化為造血細(xì)胞, 而成纖維細(xì)胞來源的iPSCs(F-iPSCs)更易分化成骨細(xì)胞。進(jìn)一步利用基于全基因組高通量芯片的相對甲基化(Comprehensive high-throughput array-based relative methylation, CHARM)分析和比較不同細(xì)胞中全基因組的甲基化, 發(fā)現(xiàn)B-iPSCs 和F-iPSCs都與ESCs存在大量的差異甲基化區(qū)域(Differentially methylated regions, DMRs)。在B-iPSCs 和F-iPSCs 中24個(gè)最為明顯的DMRs中, 分布有11個(gè)與血細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的基因和3個(gè)骨細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的基因。因此在iPS過程中, DNA甲基化未發(fā)生徹底的重編程, 從而導(dǎo)致B-iPSCs和 F-iPSCs中都含有原初體細(xì)胞的表觀遺傳“記憶”, 并最終限制了iPSCs的分化能力。提高 iPSCs的傳代次數(shù)有利于表觀遺傳“記憶”的擦除, 但也可能增加基因突變和癌變的風(fēng)險(xiǎn)。

(2) 促進(jìn)DNA去甲基化有利于提高iPSCs的產(chǎn)生效率。體細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞通常需要幾周甚至數(shù)周時(shí)間, 并且誘導(dǎo)效率極低。在iPS過程中添加DNMT1的抑制物5-Aza, 或者利用siRNA技術(shù)干擾Dnmt1的表達(dá), 重編程效率明顯提高[50,52]。這說明重編程過程中DNA發(fā)生了被動(dòng)的去甲基化。由于DNA被動(dòng)去甲基化依賴細(xì)胞的分裂, 是一個(gè)相對緩慢的過程, 因而可能是iPS低效性的原因之一。

(3) iPS過程中細(xì)胞通過DNA去甲基化開啟多能性基因的表達(dá), 同時(shí)通過高甲基化關(guān)閉體細(xì)胞特異基因的表達(dá)。多能性基因(如Oct4和Nanog等)特異表達(dá)于ESCs中, 對iPSCs的自我更新和多向分化能力至關(guān)重要[53]。多能性基因的啟動(dòng)子在體細(xì)胞中被高甲基化并且處于轉(zhuǎn)錄沉默狀態(tài), 在 iPS過程中必須通過 DNA去甲基化而重新激活。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)TET1和TET2能通過催化DNA的主動(dòng)去甲基化作用, 促進(jìn)多能性基因(如 Nanog、Esrrb、Klf4和Prdm14等)的表達(dá)[26,54]。因此, 重編程過程中也發(fā)生了DNA的主動(dòng)去甲基化, 而TET1/2等主動(dòng)去甲基化酶能有效地提高誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的重編程效率,是未來相關(guān)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)內(nèi)容。與多能性基因不同, 體細(xì)胞特異基因在 iPS過程中必須通過啟動(dòng)子的重新甲基化而關(guān)閉其表達(dá), 否則將導(dǎo)致不完全的重編程[55]。因此在iPS過程中, DNA甲基化和去甲基化同時(shí)存在, 從而影響不同類型基因的表達(dá)。DNA甲基化與去甲基化的這種復(fù)雜的平衡對體細(xì)胞誘導(dǎo)重編程至關(guān)重要。通過促進(jìn)DNA去甲基化提高 iPS的效率, 可能會(huì)引起體細(xì)胞基因的表達(dá)從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不完全的重編程。

(4) DNA的異常甲基化可能導(dǎo)致iPSCs基因印記的異常和X染色體的失活。例如, Akutsu等[56]比較了小鼠ESCs和iPSCs的全基因組甲基化狀態(tài), 發(fā)現(xiàn)印記位點(diǎn)Dlk1-Dio3在iPSCs中異常高甲基化并處于轉(zhuǎn)錄沉默狀態(tài)。Dlk1-Dio3的沉默降低了iPSCs的分化潛能, 而添加維生素 C有助于抑制 Dlk1-Dio3的高甲基化, 其機(jī)制可能是 Vc對于 TETs的激活,后者導(dǎo)致 DNA的主動(dòng)去甲基化[57]。人類胚胎在著床前的發(fā)育過程中, X染色體并未失活。而 Tchieu等[58]發(fā)現(xiàn), 女性來源的iPSCs中X染色體處于失活狀態(tài), 可能是XIST基因的啟動(dòng)子被高甲基化且處于轉(zhuǎn)錄沉默狀態(tài)。DNA的異常甲基化可能與iPSCs的培養(yǎng)條件有關(guān), 但其中的具體因素仍不清楚, 相關(guān)方面的研究將有助于iPS在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。

雖然 iPS的低效性、致癌性和免疫原性等問題尚未得到有效解決, 而其他體細(xì)胞重編程方法(如核移植)似乎有更大的局限性。然而, 近年來的研究表明核移植在去除體細(xì)胞表觀遺傳記憶方面比 iPS更加充分和有效。例如 Daley等[51]證明了核移植多能干細(xì)胞(ntESCs)全基因組的去甲基化比 iPSCs更為徹底, 并且具有更強(qiáng)的分化能力, 其原因可能是去核卵母細(xì)胞中所含的多能性因子和去甲基化酶更加豐富或多樣。此外最近的一項(xiàng)研究表明, 體細(xì)胞核移植能夠更有效地提高端粒酶和線粒體的活性, 并且其所得到的多能干細(xì)胞比 iPSCs有更強(qiáng)的分化潛能和自我更新能力[59]。

3 結(jié)語與展望

探索 DNA甲基化與去甲基化確切的分子機(jī)制是理解其在體細(xì)胞誘導(dǎo)重編程中作用的基礎(chǔ)。哺乳動(dòng)物能夠精確和嚴(yán)格地調(diào)節(jié)不同基因在不同發(fā)育時(shí)期的甲基化程度。然而目前發(fā)現(xiàn)的參與DNA甲基化與去甲基化的酶一般作用于全基因組, 并不具備基因或位點(diǎn)的特異性。進(jìn)一步探索DNA甲基化在細(xì)胞重編程過程中作用的關(guān)鍵在于研究細(xì)胞是如何在確保某些基因發(fā)生去甲基化的同時(shí), 而又使另外一些基因發(fā)生重新甲基化。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn), CEBPA基因轉(zhuǎn)錄的一個(gè)非編碼 RNA(Non-coding RNA, ncRNA)能夠特異性地結(jié)合并抑制 DNMT1, 從而調(diào)節(jié)CEBPA基因本身的甲基化修飾[60]。因此某些基因可特異性地調(diào)節(jié)自身的甲基化修飾進(jìn)而影響其表達(dá)狀態(tài)。此外, 一些長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs, lncRNAs)通過招募 DNMT3引起相應(yīng)位點(diǎn)DNA的甲基化, 從而進(jìn)一步導(dǎo)致染色體處于轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài), 在細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育中具有重要作用[61]。因此非編碼RNA對于特定基因甲基化修飾的調(diào)節(jié)作用, 可能有助于理解細(xì)胞是如何調(diào)節(jié)不同類型基因甲基化和去甲基化之間的平衡。另外, DNA甲基化與組蛋白修飾等其他表觀遺傳因素能夠相互影響, 在體細(xì)胞重編程過程中發(fā)揮重要作用, 但對其分子機(jī)理仍不十分清楚。研究DNA甲基化與組蛋白修飾之間的關(guān)系將有助于進(jìn)一步揭示胚胎發(fā)育和細(xì)胞重編程的表觀遺傳機(jī)制。

iPS技術(shù)在建立疾病模型、避免自體免疫和解決倫理等問題上展現(xiàn)了巨大的優(yōu)越性。然而目前iPSCs的誘導(dǎo)效率極低, 且常發(fā)生不完全的表觀遺傳重編程。在不完全重編程的細(xì)胞中常含有體細(xì)胞的表觀遺傳記憶, 暗示DNA甲基化是體細(xì)胞誘導(dǎo)重編程的重要障礙。不徹底的DNA去甲基化使iPSCs具有分化的傾向性, 而多能干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)一直以來是干細(xì)胞及再生醫(yī)學(xué)研究的難點(diǎn), 因此利用DNA甲基化對細(xì)胞分化傾向性的影響可能有助于實(shí)現(xiàn) iPSCs的定向誘導(dǎo)。iPS過程中DNA甲基化的重編程具有雙向性, 即對于不同類型的基因, DNA甲基化和去甲基化同時(shí)發(fā)生。其中DNA去甲基化包括主動(dòng)和被動(dòng)兩個(gè)過程, 而DNA被動(dòng)去甲基化依賴DNA的復(fù)制和細(xì)胞的分裂, 可能是iPS低效性的重要原因。小分子物質(zhì)（如5-Aza）能夠促進(jìn)體細(xì)胞的重編程, 但也可能破壞iPS過程中DNA甲基化和去甲基化之間的平衡, 從而導(dǎo)致DNA的異常去甲基化。目前仍不清楚DNA甲基化對iPSCs致癌性和免疫原性等問題的影響, 而這可能成為未來相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題。進(jìn)一步探討DNA甲基化在體細(xì)胞重編程中的作用對于重編程技術(shù)的理論研究和實(shí)際應(yīng)用都具有重要意義。

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(責(zé)任編委: 張飛雄)

Mammalian DNA methylation and its roles during the induced reprogramming of somatic cells

Hongwei Song, Tiezhu An, Shanhua Piao, Chunsheng Wang

College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China

The technology of induced pluripotent stem cell (iPS) provides the possibility to reverse the terminal differentiated cells to pluripotent stem cells, and is therefore of great importance in both the theoretical research of stem cells and regenerative medicine. However, the efficiency of current induced reprogramming methods is extremely low, and the incomplete reprogramming often happens. It has been reported that some epigenetic memory of the somatic cells exists in these incomplete reprogrammed iPS cells, and DNA methylation, as a relative long-term and stable epigenetic modification, is one of the important factors that influence the efficiency of reprogramming and differentiative capacity of iPS cells. Mammalian DNA methylation, which normally appears on the CpG sites, occurs on the fifth carbon atom of the cytosine ring. DNA methylation can modulate the expression of somatic cell specific genes, and pluripotent genes; hence, it playsimportant roles in the processes of mammalian gene regulation, embryonic development and cell reprogramming. In addition, it has also been found that abnormal DNA methylation may lead to the disorder of genetic imprinting and the inactivation of X chromosome in iPS cells. Therefore, in order to provide a concise guidance of DNA methylation studies in iPS, we mainly review the mechanism, the distribution features of DNA methylation, and its roles in induced reprogramming of somatic cells.

DNA methylation; induced pluripotent stem cell (iPS); somatic reprogramming

2013-12-30;

2014-02-27

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(編號: DL13EA06-02)和國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號:31000990)資助

宋紅衛(wèi),碩士研究生, 專業(yè)方向：體細(xì)胞重編程。E-mail: songhongwei25@163.com

王春生, 博士, 副教授, 研究方向：體細(xì)胞重編程。Tel: 0451-82191785; E-mail: wangchunsheng79@163.com

10.3724/SP.J.1005.2014.0431