p53、PUMA、MCL-1對于凋亡途徑的調(diào)控

師迎旭(綜述)，蘇秀蘭(審校)

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，呼和浩特 010050)

自1979年以來，p53被證實(shí)主要在維護(hù)基因組的穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。目前，p53在其他方面的作用也逐步被發(fā)現(xiàn)[1]。激活的p53可以抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)細(xì)胞生長停滯、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)和分化受損。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的p53靶基因超過16個，但目前仍不清楚哪一個是起決定作用的。p53能激活多條信號途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡：Fas、PIDD、DR5；Bax、Noxa、p53基因上調(diào)凋亡調(diào)控因子(the p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA)、p53AIP；PIGs；Soctin、PERP、PAG608、Siah；IGF-BP3。關(guān)于p53基因如何抑制腫瘤的發(fā)展仍是研究的熱點(diǎn)。

1 p53的凋亡通路

腫瘤抑制基因p53和原癌基因Bcl-2是p53凋亡通路中兩個最早被確定的基因。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，這兩種基因和蛋白之間具有很強(qiáng)的遺傳和生理關(guān)系。越來越多的報(bào)道顯示，p53主要通過與Bcl-2家族蛋白相互作用發(fā)揮促凋亡與抗凋亡的功能[2]。Bcl-2最初是在非霍奇金濾泡狀B細(xì)胞淋巴瘤中分離并命名的。Bcl-2家族成員具有較高的同源性，具有一個或多個Bcl-2的同源性(Bcl-2 homology，BH)結(jié)構(gòu)域(BH1、BH2、BH3、BH4)，可以形成異二聚體。根據(jù)作用其可分為兩類：①抗凋亡作用，如Bcl-2、Bcl-xL、髓細(xì)胞白血病基因1(myeloid cell leukemia-1，MCL-1)、Bcl-w、秀麗線蟲基因9等；②促凋亡成員，如Bax、Bak、PUMA、Noxa、Bim、Bcl-xs、Bad、Bik、Bid等。抗凋亡和促凋亡家族蛋白之間平衡的改變決定了細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡過程。

促凋亡的Bcl-2蛋白家族成員共同含有BH3結(jié)構(gòu)域(BH3-only)，能夠編碼Bid。接受凋亡信號后，Bid與Bcl-2家族蛋白Bax和Bak相互作用，使Bax蛋白嵌入到線粒體外膜中，增強(qiáng)線粒體外膜的通透性，導(dǎo)致釋放細(xì)胞色素C和其他促凋亡因子,如第二線粒體衍生的胱天蛋白酶(caspase)激活劑/低等電點(diǎn)凋亡抑制蛋白直接結(jié)合蛋白的釋放[3]。Bid可誘導(dǎo)Bcl-2或Bcl-xL釋放出Bid和Bim促進(jìn)凋亡。p53蛋白在細(xì)胞應(yīng)急情況下被激活，同樣具有BH3-only相似的功能和轉(zhuǎn)錄因子作用，p53致Bid的表達(dá)上調(diào)，調(diào)節(jié)下游靶基因參與p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程調(diào)。此外，在細(xì)胞凋亡中p53還具有獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄作用。p53通過與Bax的相互作用，促進(jìn)Bax的活化和Bax蛋白插入到線粒體膜中，使線粒體通透性增加。

2 PUMA對于p53凋亡通路的調(diào)控

Bcl-2在細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制中起著十分重要的作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Noxa和PUMA(bbc3)編碼的BH3也較為重要[4-6]。PUMA和Noxa基因的轉(zhuǎn)錄均受p53正性調(diào)控，參與全部的p53介導(dǎo)的凋亡信號。Noxa由PMAIP1(佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酰引導(dǎo)蛋白1)基因編碼，具有2個BH3結(jié)構(gòu)域，可以泛素化降解Mcl-1[7]。X射線照射小鼠后可激活依賴p53的凋亡途徑，從而誘導(dǎo)Noxa表達(dá)。Noxa是唯一編碼BH3的Bcl-2家族成員，只具有BH3區(qū)域，而沒有其他BH域。研究發(fā)現(xiàn)，Noxa在非依賴p53的凋亡途徑中起重要作用[8]。Noxa通過介導(dǎo)非p53的凋亡過程，經(jīng)BH3與線粒體和抗凋亡的Bcl-2家族成員相互作用，直接激活Noxa及其他凋亡蛋白，導(dǎo)致caspase-9的激活，但此過程并不會增強(qiáng)PUMA水平。

PUMA是于2001年被發(fā)現(xiàn)的一種具有促凋亡作用的p53靶基因，高度保守[9-11]。PUMA在正常狀況下低表達(dá)，應(yīng)激后可以迅速誘導(dǎo)激活PUMA，參與p53依賴性和非依賴性細(xì)胞凋亡過程，受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，而不是翻譯后修飾調(diào)控。被激活后，PUMA與抗凋亡Bcl-2家族成員相互作用，從而釋放Bax和(或)Bak，啟動線粒體凋亡信號。線粒體功能障礙將激活caspase級聯(lián)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。實(shí)驗(yàn)證明，PUMA在DNA損傷激活的p53介導(dǎo)的凋亡途徑中更為重要，而Noxa作用相對有限[12]。PUMA具有4種亞型(α、β、γ、δ)，其中γ、δ缺少BH3結(jié)構(gòu)域，無法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。PUMA的促凋亡作用：一方面，PUMA介導(dǎo)p53依賴的所有凋亡信號[14-16]。研究發(fā)現(xiàn)，DNA損傷誘導(dǎo)的凋亡過程中，p53和PUMA啟動子上p53結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合是必不可少的[17]。PUMA的啟動子具有兩個p53結(jié)合區(qū)，對于PUMA與p53的結(jié)合，PUMA的活化至關(guān)重要。p53與PUMA啟動子的結(jié)合有利于核心組蛋白的修飾，如乙?；M蛋白H3和H4，促進(jìn)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)開放和轉(zhuǎn)錄激活。PUMA基因缺失的動物或細(xì)胞，導(dǎo)致p53喪失誘導(dǎo)凋亡功能，而其他的p53靶基因(如Bak基因)缺失，不會阻礙p53的誘導(dǎo)凋亡作用。小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)，盡管僅剔除PUMA能夠抵制etoposide(拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑足葉乙苷)與γ射線的促凋亡作用，不會使淋巴細(xì)胞死亡，但Noxa或PUMA的任何一個因子的降解都會減少成纖維細(xì)胞中由于DNA降解引起的細(xì)胞凋亡[14]。另一方面，PUMA可介導(dǎo)p53非依賴的凋亡信號[18-20]。缺少PUMA，人結(jié)腸癌細(xì)胞的p53依賴凋亡過程被抑制。缺失PUMA的淋巴細(xì)胞還可以抵制細(xì)胞因子缺失、地塞米松、星形孢菌素引發(fā)的凋亡過程[21-24]。PUMA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可通過激活多種凋亡蛋白如Bax和(或)通過其抗凋亡的Bcl-2家族成員，從而引發(fā)線粒體功能障礙和caspase激活。PUMA也可以直接激活Bax/Bak或細(xì)胞質(zhì)的p53誘導(dǎo)的線粒體功能障礙，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡途徑。此外，PUMA也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白的下游分子，介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78的表達(dá)，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[25-26]。

3 MCL-1對于p53凋亡通路的調(diào)控

研究顯示，PUMA對于細(xì)胞凋亡發(fā)揮著重要作用，它除了受p53的調(diào)控，還受其他因子的調(diào)節(jié)，如MCL-1[27-28]。MCL-1屬于抗凋亡Bcl-2家族蛋白的一員，通過不同的剪接方式可生成兩種變體：選擇性剪接較長的變體(異構(gòu)體1)可通過抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞的存活；而剪接較短的變體(異構(gòu)體2)則促進(jìn)細(xì)胞凋亡和死亡誘導(dǎo)。MCL-1可以作為上游的分子，通過阻止細(xì)胞色素C的釋放從而阻斷多種凋亡誘導(dǎo)劑所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，然而MCL-1抑制細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制尚未闡述清楚。研究顯示，缺失MCL-1可以破壞p53-Bak復(fù)合物的形成，過表達(dá)MCL-1可以促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞生存[29]。MCL-1是一個很不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，它的快速誘導(dǎo)表達(dá)和降解表明，它在細(xì)胞為適應(yīng)周圍環(huán)境迅速變化的凋亡調(diào)控中具有重要作用。其蛋白表達(dá)水平受到極其嚴(yán)格而復(fù)雜的調(diào)控，提示其在細(xì)胞受到應(yīng)激發(fā)生變化時(shí)，對細(xì)胞的存活與否發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

4 MCL-1與PUMA在p53凋亡通路中的作用

MCL-1可以直接或間接地激活Bcl-2家族促凋亡蛋白Bak與Bax抑制細(xì)胞凋亡。MCL-1通過與Bim或Bak形成異源二聚體中和凋亡蛋白的作用，抑制細(xì)胞色素C的釋放及細(xì)胞凋亡。MCL-1可以通過BH1結(jié)構(gòu)域和PUMA的BH3結(jié)構(gòu)域相互作用，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中抑制MCL-1可以通過上調(diào)PUMA來激活Bak與Bax。另外，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體可以通過死亡受體途徑激活caspase-8和caspase-3，而活化的caspase-8或caspase-3可以切割抗凋亡的MCL-1，當(dāng)MCL-1被切割后，將阻止與促凋亡的Bcl-2家族成員(如Bim)間形成復(fù)合體，最終通過線粒體途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[26,30-31]。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，MCL-1和PUMA共同定位于線粒體，表明MCL-1和PUMA在線粒體上結(jié)合[32]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MCL-1可以抑制PUMA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，且MCL-1的BH1結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄淇筆UMA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起著重要的作用[33]。MCL-1的蛋白穩(wěn)定性可以被PUMA提高，而且這種MCL-1蛋白穩(wěn)定性的提高是由于和PUMA的直接結(jié)合所致。研究顯示，將PUMA的BH3結(jié)構(gòu)域去除之后，PUMA失去提高M(jìn)CL-1蛋白穩(wěn)定性的功能；同時(shí)也證明了PUMA結(jié)合MCL-1只能部分阻止MCL-1的快速降解，提示除了PEST(為一富含脯氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸的約10個氨基酸組成的結(jié)構(gòu)序列)和BH1結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)MCL-1的快速降解，還存在其他降解信號，而且位于MCL-1蛋白的C末端[34]。該項(xiàng)研究闡明了Mcl-1可以與PUMA相互作用，而且提示MCL-1可能通過與PUMA結(jié)合而提高自身穩(wěn)定性，最終行使抗凋亡的功能[35-36]。在紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程早期，p53能被激活，并作為一個轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)多種與凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。細(xì)胞接受凋亡刺激后，胞內(nèi)p53水平增加，進(jìn)入胞質(zhì)p53與MCL-1競爭結(jié)合Bak，使MCL-1釋放Bak，引起B(yǎng)ak寡聚化，MCL-1缺乏。Bak的寡聚化能增加線粒體外膜通透性，最終激活線粒體途徑的細(xì)胞凋亡[37]。

作為一種腫瘤抑制基因，p53的主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長停滯和凋亡，通過平衡這兩種細(xì)胞的生命活動，最終決定細(xì)胞的命運(yùn)。不同于其他的腫瘤抑制基因，大多數(shù)腫瘤中的p53突變的錯義類型，會導(dǎo)致單個氨基酸的變化，影響蛋白質(zhì)上的DNA結(jié)合域，表明與DNA序列特異性結(jié)合是抑制p53活性與逃脫腫瘤命運(yùn)的關(guān)鍵。

5 小 結(jié)

p53被證明在多種凋亡刺激所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，但是它的誘導(dǎo)凋亡的潛在機(jī)制還不明確。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)p53的下游分子PUMA誘導(dǎo)凋亡功能十分重要，具有重要的促凋亡作用。通過誘導(dǎo)細(xì)胞色素C從線粒體釋放，激活caspase-9從而引發(fā)凋亡。PUMA的缺失能夠阻礙DNA損傷，激活p53引發(fā)的凋亡過程。此外，PUMA的缺失也可以抑制多種凋亡因子的誘導(dǎo)凋亡途徑。p53的另一個下游分子MCL-1是一個抗凋亡分子，通過抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放，抑制caspase-9，從而阻礙凋亡的發(fā)生。Mcl-1與PUMA可以在線粒體通過Bcl-2家族蛋白的BH結(jié)構(gòu)域(BH1與BH3)發(fā)生相互作用，通過相互作用可以提高M(jìn)cl-1的穩(wěn)定性，最終抑制細(xì)胞的凋亡途徑。當(dāng)細(xì)胞受到刺激損傷時(shí)，會引發(fā)p53的凋亡通路，p53通過PUMA促進(jìn)細(xì)胞凋亡；如果細(xì)胞癌變，則細(xì)胞就會逃離凋亡的命運(yùn)，p53可能會通過調(diào)節(jié)Mcl-1的活性，阻礙細(xì)胞的凋亡過程，但具體機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步的研究。

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