兩株豬博卡病毒的檢測及遺傳演化分析

周 宇，唐連飛，朱事康，朱中武，佟鐵鑄，禹思宇，劉 星，陳燕忠，鄒東輝，羅卓軍

（1.惠州出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，廣東 惠州516006；2.湖南出入境檢驗檢疫局，湖南，長沙410004）

豬博卡病毒（Porcine Bocavirus，PBoV）屬于細(xì)小病毒科、博卡病毒屬，為單股線狀無囊膜DNA病毒，基因組在5.2 kb左右[1]，包括3個開放閱讀框（ORFs），分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，結(jié)構(gòu)蛋白VP1/VP2和磷酸化的非結(jié)構(gòu)蛋白NP1[2-3]，NP1基因的功能尚不清楚，VP1/VP2基因是其主要的抗原基因。該病毒的理化性質(zhì)、致病機(jī)理和能引起的臨床癥狀尚不清楚，對該病毒的研究仍處于起步階段。2009年，瑞典科學(xué)人員首先發(fā)現(xiàn)了世界上第一例豬博卡病毒[4]，2010年，翟少倫等[5]首次在我國191份疑似患高熱病的病料中檢出PBoV，胡軍勇等[10]在對豬腹瀉樣品進(jìn)行檢測時發(fā)現(xiàn)PBoV的陽性率達(dá)到69.35%，表明該病毒在發(fā)生腹瀉的豬腸道內(nèi)普遍存在，雖然該病的致病性仍然存有爭議，但其經(jīng)常會與豬圓環(huán)病毒2型、豬輸血傳染病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒等在豬體內(nèi)同時被檢出。此后在中國北京市、上海市、湖北省等相繼檢測到豬博卡病毒。2010年Shan等[9]在無臨床癥狀的豬糞便樣品中檢測到PBoV的廣泛存在，2011年張志等[6]從河南某豬場表觀健康豬樣品中檢測到PBoV，表明我國內(nèi)地已經(jīng)存在豬博卡病毒的感染。在基因分型上，翟少倫[7]等將其分為4個基因型，郝飛等[8]將其暫時分為7個基因型，國際病毒學(xué)分類委員會關(guān)于博卡病毒的分類方法按照非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)NS1基因進(jìn)行分類，但也有學(xué)者提出人博卡病毒應(yīng)按照結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)VP1/VP2基因進(jìn)行分類。其基因分型還需要進(jìn)一步完善。

1 材料與方法

1.1 樣品 200份豬糞便樣本，分別采集自廣東粵東地區(qū)的豬群。用1mL PBS稀釋震蕩混勻，12 000 r/min離心5 min，取200μL上清液進(jìn)行病毒DNA抽提（采用天根生化科技（北京）有限公司的病毒DNA提取試劑盒）。

1.2 引物設(shè)計與合成 參照GenBank發(fā)表的豬博卡病毒序列，登錄號為：HQ223038和HM053693，使用Primer5.0引物設(shè)計軟件，分別針對NS1、NP1、VP1/VP2基因設(shè)計引物（如表1所示）。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 豬博卡病毒不同基因的PCR引物

1.3 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為25μL，反應(yīng)體系中含：上游引物、下游引物各2.5μL，2*Mix 12.5μL，模板2.0μL，ddH2O 5.5μL。PCR擴(kuò)增條件為：NP1：95℃5min；94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)；72℃10 min；NS1和VP1/VP2：95℃5 min；94℃30 s，58℃45 s，72℃90 s，35個循環(huán)；72℃10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.4 測序和分析 將陽性PCR產(chǎn)物送交英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序，然后將序列進(jìn)行BLAST分析，并用DNAStar，MEGA5.1軟件進(jìn)行比對和進(jìn)化樹分析。參考序列選擇了自2010-2013年已公布的豬博卡病毒全基因序列。登錄號分別為：HQ223038，HM053693，HM053694，HM053672，HM053673，HM031134，JN831651，HQ291308，HQ29 1309，JF429834，JF429835，JF429836，JF512472，JF5 12473，JF713715，JF713714，JX854557，KC473563，KF206165，KF206155，KF206157，KF206167。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增 利用引物對所有樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有2份樣品可以擴(kuò)增出特異性條帶（見圖1，圖2，圖3），將兩份樣品分別命名為GD4和GD18。

2.2 遺傳分析

2.2.1 同源性比較 對GD4株和GD18株的NS1基因、NP1基因、VP1/VP2基因分別進(jìn)行測序，測得的片段長度與預(yù)期的目的片段長度一致。應(yīng)用BLAST和DNAStar分析軟件進(jìn)行相關(guān)全基因序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)GD4株和GD18株相關(guān)基因同源性較低，在34.9%～50.5%之間。GD4株與HQ223038、JX854557、HQ291308相關(guān)基因的同源性較高，96%～99.8%之間，與其他毒株同源性較低，在60%以下；GD18株與KF206167、HM053693、HM053694、HQ29 1309、KF206165、KF206155同源性較高，在89.6%～96%之間，與其他分離株的同源性較低，在60%以下。兩個毒株屬于不同的基因型，GD4株基因突變率較低，GD18株基因突變率較高。

圖1 NS1基因的檢測結(jié)果

圖2 VP1/VP2基因的檢測結(jié)果

圖3 NP1基因的檢測結(jié)果

2.2.2 氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 應(yīng)用MEGA5.1分析軟件分別對GD4株和GD18株的NS1、NP1、VP1/VP2基因編碼的氨基酸序列與參考株進(jìn)行比對，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)只有HM031134（中國江蘇）株處于1個較遠(yuǎn)的分支。其他豬博卡病毒分為2個大分支，3個小分支，GD4株和GD18株的NS1和NP1處于1個大分支，不同的次分支，與多個歐洲株具有共同的祖先，在進(jìn)化的過程中出現(xiàn)分化；而與美國、香港株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；VP1/VP2卻處于不同的大分支上。尤其是GD4株的VP1/VP2明顯的處于1個獨立的分支，預(yù)示其有自己獨立的遺傳演化趨勢（見圖4，圖5，圖6）。

3 討論

圖4 NS1氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖5 NP1氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖6 VP1/VP2氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹

當(dāng)前對PBoV的研究還處于初級階段，主要研究病毒的形態(tài)和基因組情況，并建立了相關(guān)的檢測方法。本研究摘錄了NCBI公布的PBoV具有代表性的全部22條PBoV的全基因序列。通過核苷酸序列的同源性比較和進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，HM031134株與其他PBoV株的同源性很低，同源性在5.0%以內(nèi)，而且在進(jìn)化分支上相距較遠(yuǎn)并處于獨立分支。而PBoV的各不同分離株大體可分為3大分支，并且同一分支序列的相似性較高，同源性在80.0%以上，變異性較低，而在不同分支之間的核苷酸序列相似性較低；地域性差異并不大，如美洲、歐洲、亞洲、非洲的毒株處于同一個進(jìn)化分支；從目前公布的序列發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)存在的PBoV存在多樣性和在一個地區(qū)同時存在多個毒株的情況，如上海的兩個毒株HQ291308和HQ291309之間的差異顯著；河南株與香港、美國等某些毒株同源性較高，而與其他國內(nèi)毒株同源性較低，距離較遠(yuǎn)。本研究所得的兩個毒株之間具有明顯差異，分屬不同的基因型，并且兩個毒株均與歐洲株親緣關(guān)系較近，與美國、香港毒株關(guān)系較遠(yuǎn)，推測認(rèn)為是由于豬的引種和貿(mào)易往來導(dǎo)致的；氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹表明GD4株的VP1/VP2處于獨立的分支而其他兩個基因編碼的氨基酸卻在同一大分支上，懷疑該毒株可能存在基因重組的可能，并且該毒株與其他毒株的致病性可能不同。雖然已經(jīng)證實多種博卡病毒能夠感染并且導(dǎo)致宿主發(fā)生急性腹瀉[11-12]，并且該病毒在發(fā)病豬群中的檢出率明顯高于健康豬群的檢出率，但對于豬博卡病毒是否能導(dǎo)致宿主腹瀉仍然存有爭議[13-14]，需要進(jìn)一步深入研究。

[1]Blomstrom A L，Belák S，F(xiàn)ossum C，et al.Detection of a novel porcine boca-like virus in the background of porcine circovirus type 2 induced postweaning multisystemic wasting syndrome[J].Virus Res，2009，146（1-2）：125-129.

[2]Zeng SL，Wang D，F(xiàn)ang L R，et al.Complete coding sequencesand phylogenetic analysis of porcine bocavirus（PBoV）[J].JGen Virol，2011，10：1099.

[3] Manteufel J，Truyen U.Animal bocaviruses：a brief rewiew[J].Intervirology，2008，51：328-334.

[4] Blomstrom A，Belak S，F(xiàn)ossum C，et al.Detection of a novel porcine boca-like virus in the background of porcine circovirus type 2 induced postweaning multisystemic wasting syndrome[J].Virus Research，2009，146：125-129.

[5]翟少倫，岳城，韋祖樟，等.豬博卡病毒PCR檢測方法的建立及其應(yīng)用[J].中國動物傳染病學(xué)報，2010，18（2）：14-17.

[6]張志，王賽賽，李嵐，等.健康屠宰豬中博卡病毒的檢測及遺傳演化分析[J].畜牧與獸醫(yī)，2012，44（10）：9-11.

[7]翟少倫，陳勝男，魏文康，等.豬博卡病毒的研究進(jìn)展[J].病毒學(xué)報，2012，28（2）：190-193.

[8]郝飛，湯德元，李春燕，等.豬博卡病毒流行病學(xué)研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2012.43（10）：1609-1617.

[9]Shan Tong-ling，Lan Dao-liang，Li Lin-lin，et al.Genomic characterization and high prevalence of bocaviruses in swine[J].PLoS One，2011，6（4）：e17292.

[10]胡軍勇，張倩，王丹丹，等.豬博卡病毒PCR檢測方法的建立及其初步流行病學(xué)調(diào)查[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2012，34（8）：632-636.

[11]Chen Jian-fei，Liu Xiao-zhen，Shi Da，et al.Complete genome sequence of a porcine epidemic diarrhea virus variant[J].JVirol，2012，86（6）：3408-3412.

[12]Sun Rui-Qin，Cai Ru-Jian，Chen Ya-Qiang，et al.Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets，China[J].Emerg Infect Dis，2012，18（1）：61-163.

[13]Meng，X J.Emerging and re-emerging swine viruses[J].Transbound Emerg Dis，2012，9（10）：1865-1682.

[14]ChengWei-Xia，Li Jin-Song，Huang Can-Ping，et al.Identification and nearly full-length genome characterization of novel porcine bocaviruses[J].PLoSOne，2010，5（10）：e13583.