犬細(xì)小病毒山東流行株分離鑒定及其全基因組測(cè)序分析

于永樂，宮文妮，楊海燕，趙秀美，張傳美，張洪亮，單 虎

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266109；2.無錫出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 無錫214101；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京210095）

犬細(xì)小病毒（canine parvovirus，CPV）自1978年發(fā)現(xiàn)以來，已在全世界多個(gè)國(guó)家迅速傳播和蔓延，是目前公認(rèn)的引起犬及犬科動(dòng)物出血性腸炎和心肌炎的重大病原之一。在我國(guó)，1982年最早報(bào)道了此病的發(fā)生，此后的30多年伴隨著該病毒的不斷進(jìn)化和變異，給我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)帶來越來越大的損失[1]。

CPV是單股、負(fù)鏈、線性DNA病毒，基因組全長(zhǎng)5.2 kb，包含兩個(gè)大開放閱讀框ORF1(編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2)和ORF2(編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2)[2-3]，其中VP2蛋白是主要的衣殼蛋白和病毒保護(hù)性抗原蛋白，同時(shí)具有自我裝配形成病毒樣顆粒（VLPS）的能力[4]。NS1蛋白是主要的非結(jié)構(gòu)蛋白，也是一個(gè)多功能的基因表達(dá)調(diào)控蛋白，而且目前研究證實(shí)NS1蛋白與CPV致細(xì)胞凋亡有關(guān)[5]。犬細(xì)小病毒最顯著的生物學(xué)特性就是其VP2基因高的進(jìn)化速率（2×10-4次/位點(diǎn)·年），已達(dá)到某些RNA病毒的進(jìn)化速率[6-7]。這主要表現(xiàn)在新的抗原變異體的不斷出現(xiàn)，從1979-2000年，CPV-2發(fā)生了幾次重要的基因變異，先后產(chǎn)生了CPV-2a、CPV-2b、New CPV-2a和New CPV-2b、CPV-2c(a)和CPV-2c(b)以及CPV-2c七種抗原變異株[8-9]，每一種抗原變異株的出現(xiàn)都對(duì)犬細(xì)小病毒進(jìn)化機(jī)制的深入研究產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。本研究通過對(duì)山東地區(qū)犬細(xì)小病毒流行株分離鑒定和全基因組分析，從而確定分離株的來源和遺傳變異情況，為山東地區(qū)犬細(xì)小病毒的遺傳進(jìn)化、流行病學(xué)等進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)，為疫苗的研制提供新的材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 病毒分離樣品來自山東各地區(qū)寵物醫(yī)院發(fā)病犬，CPV膠體金抗原檢測(cè)試紙條檢測(cè)為CPV陽性，采集糞便，用于病毒分離培養(yǎng)。F81細(xì)胞由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。犬細(xì)小病毒參考毒株為犬細(xì)小病毒滅活疫苗，購自Intervet公司。

主要試劑有DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，購自美國(guó)Gibco公司；DNAiso Reagent、rTaq DNA聚合酶、DNA Marker DL 2 000、pMD 18-TVector、膠回收試劑盒、大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，均購自寶生物工程(大連)有限公司；其余所使用試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 病毒增殖與分離 取患病犬的糞便，按1∶9的比例加入滅菌的PBS，研磨離心取上清液，按1∶9的比例加入氯仿，混勻離心取上部水層加入青霉素和鏈霉素，濾膜過濾除菌，-70℃保存?zhèn)溆?。采取同步接毒法，?0mL細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液中加入病料上清500μL，試驗(yàn)過程中設(shè)對(duì)照。培養(yǎng)接毒細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞，觀察有無病變產(chǎn)生。待80%細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變（CPE）時(shí)，收獲病毒。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank登錄的犬細(xì)小病毒VP2基因序列，利用軟件設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性檢測(cè)引物，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為685 bp；P1：5'-GAAGAGTGGTTGTAAATAATTTGG-3'；P2：5'-AACCAAAGTTAGTACCTCCTTCAGC-3'。全基因引物參考郭偉等[12]設(shè)計(jì)的6對(duì)引物進(jìn)行全基因的擴(kuò)增，引物均由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 病毒DNA提取 取500μL F81細(xì)胞培養(yǎng)的病毒液，按照DNAiso Reagent說明書方法提取DNA，用30μL滅菌超純水溶解后儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 病毒鑒定和全基因組克隆

1.2.4.1 病毒PCR鑒定 反應(yīng)體系為25μL：模板DNA 3μL，10 X PCR Buffer 2.5μL，dNTP 2.0μL，P1 0.5μL，P2 0.5μL，Taq酶0.5μL，ddH20 16μL。95℃預(yù)變性5min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4.2 病毒電鏡形態(tài)學(xué)觀察 將盲傳至第4代的病毒液，8 000 r/min離心10min后，取上清液，將上清液病毒濃縮后，0.5%磷鎢酸負(fù)染，電鏡下放大60 000倍，觀察病毒粒子形態(tài)。

1.2.4.3 病毒全基因組克隆 按照郭偉等[10]建立的PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增，回收各個(gè)目的片段，將其連接到pMD l8-T載體上，轉(zhuǎn)化至DH-5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于氨芐青霉素瓊脂平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單個(gè)菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)PCR鑒定后送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

1.2.5 全基因組序列比較與分析 將所分離到細(xì)小病毒株各個(gè)基因片段用DNAStar軟件進(jìn)行序列拼接，得到的全基因序列與GenBank參考毒株進(jìn)行比對(duì)分析。對(duì)所獲得的各VP2基因序列的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離培養(yǎng)及PCR鑒定 20份病料同步接種到正常生長(zhǎng)的F81細(xì)胞，盲傳至第3代72 h，有4份出現(xiàn)明顯的變形、聚堆、拉網(wǎng)結(jié)絲等細(xì)胞病變，繼續(xù)帶毒盲傳至第5代均能出現(xiàn)典型細(xì)胞病變，而對(duì)照組細(xì)胞未出現(xiàn)任何病變。以F5代病毒液DNA做模板，應(yīng)用設(shè)計(jì)的特異性引物從疫苗株和分離毒株中均擴(kuò)增出685 bp的目的片段，與理論設(shè)計(jì)值大小相符(圖1)。結(jié)果證實(shí)分離到了4株CPV，分別命名QN1/QN2/QN3/QN4。

2.2 電鏡觀察結(jié)果 將第5代F81細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后進(jìn)行電鏡形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)呈立體對(duì)稱的，直徑約20～25 nm的空心病毒粒子（圖2）。

圖1 病毒分離PCR結(jié)果

圖2 電鏡負(fù)染后的病毒粒子

2.3 CPV分離株全基因組克隆與序列分析 除QN3株序列總長(zhǎng)為4 756 bp，其余3株為4 757 bp，其中5，UTR長(zhǎng)153 bp，3，UTR長(zhǎng)335 bp，ORF1全長(zhǎng)2 007 bp，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1、NS2；ORF2全長(zhǎng)2 255 bp，編碼結(jié)構(gòu)蛋白基因VP1、VP2；四株CPV之間全序列核苷酸同源性為99.31%，與國(guó)際參考毒株（CPV-N）的同源性分別為：98.9%、98.9%、99.0%和99.4%；與GenBank登錄的10株具有代表性的CPV核苷酸序列比對(duì)，同源性為98.2%～99.9%，其中，四株CPV與6株國(guó)內(nèi)參考毒株的同源性比4株國(guó)外參考毒株的同源性高，說明本分離株與國(guó)內(nèi)分離毒株可能具有相同的起源。此外，本研究發(fā)現(xiàn)分離株在3，UTR有堿基插入和缺失存在，與CPV-N相比：QN1、QN2和QN3株在4 574～4 636、4 702～4 763和4 844～4 905位點(diǎn)以及QN4株在4 574～4 616和4 700～4 824位點(diǎn)有堿基缺失；與CPV-Y1相比：QN4株在4 844～4 905位點(diǎn)有堿基插入。

2.4 CPV分離株全基因系統(tǒng)進(jìn)化分析 全基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析如圖3所示，QN1、QN2和QN3株與廣西分離株CPV-2a處于同一分支，親緣關(guān)系較近；QN4株與甘肅分離株CPV LZ1處于同一分支，親緣關(guān)系較近，與CPV Laika-1993株進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)，其親源關(guān)系較為疏遠(yuǎn)?？傮w而言，4株CPV與國(guó)內(nèi)其他幾株分離毒親緣關(guān)系較近，尤其是與國(guó)內(nèi)近期分離毒株間高度同源，同屬一個(gè)亞型，而與CPV-N等國(guó)外毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，說明所分離毒株可能由國(guó)內(nèi)流行毒株進(jìn)化而來。

圖3 CPV分離株全基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.5 CPV分離株VP2基因與國(guó)內(nèi)外分離株的核苷酸序列及推導(dǎo)氨基酸序列同源性比較 將4個(gè)CPV分離株與17個(gè)國(guó)內(nèi)外分離株進(jìn)行VP2基因的核苷酸序列及推導(dǎo)氨基酸序列同源性比較。結(jié)果表明，不同地域CPV分離株VP2基因序列同源性高，變異小，核苷酸同源性為98.5%～99.9%，推導(dǎo)的氨基酸同源性為97.4%～100.0%，但各分離株與疫苗株的同源性較低，差異大。與原始CPV-2a亞型相比，其VP2基因297位氨基酸發(fā)生了S到A替換，依此判定4個(gè)CPV分離株同屬New CPV-2a亞型。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)室從送檢的疑似犬細(xì)小病毒感染的發(fā)病犬糞便中分離出4株細(xì)小病毒，根據(jù)流行病學(xué)、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)證實(shí)該分離株為CPV。為分析毒株的遺傳演化，對(duì)分離株進(jìn)行了全基因測(cè)序，結(jié)果表明，除QN3株的基因組全長(zhǎng)為4 756 nt外，其余3株均為4 757 nt，4個(gè)分離株之間同源性為99.31%，與國(guó)際參考毒株（CPV-N）的同源性分別為：98.9%、98.9%、99.0%和99.4%；與GenBank登錄的10株具有代表性的CPV全基因組核苷酸序列比對(duì)，同源性為98.2%～99.9%，說明國(guó)內(nèi)外分離株基因序列差異不大，但從系統(tǒng)進(jìn)化樹分析上分析，4個(gè)分離株與國(guó)內(nèi)毒株親緣關(guān)系更近，處于同一大的分支上，說明山東地區(qū)犬細(xì)小病毒并沒有形成獨(dú)立的分支。此外，本研究發(fā)現(xiàn)分離株在3，UTR有插入和缺失位點(diǎn)存在，3，UTR是CPV mRNA翻澤的起始端，其序列的改變會(huì)影響病毒翻澤，從而可能影響病毒對(duì)細(xì)胞的感染能力[11-12]。

由于VP2基因序列涵蓋了CPV所有的中和抗原表位，VP2若干個(gè)堿基及氨基酸的非同義置換則會(huì)改變病毒的宿主范圍及抗原特性，所以對(duì)VP2基因的比較和分型具有非常重要的生物學(xué)意義[13]。結(jié)果表明，本試驗(yàn)克隆和測(cè)定的4株CPV結(jié)構(gòu)蛋白編碼的VP2全基因其核苷酸1 755 bp，編碼氨基酸585個(gè)。與17個(gè)國(guó)內(nèi)外分離株核苷酸同源性為98.5%～99.9%，推導(dǎo)的氨基酸同源性為97.4%～100.0%，說明VP2基因變異相對(duì)較少。氨基酸序列分析可知，與原始CPV-2a亞型相比，分離株297位氨基酸還發(fā)生了S到A替換，說明本次分離株同屬于New CPV-2a亞型，這與王凈等[14]分析一致，認(rèn)為目前New CPV-2a亞型在中國(guó)占主導(dǎo)地位。由于321位點(diǎn)和324位點(diǎn)位于衣殼蛋白GH環(huán)，而該環(huán)上的氨基酸大部分處在病毒粒子的外表面，因此，這兩處位點(diǎn)N到D、I到Y(jié)的替換可能會(huì)引起蛋白三維結(jié)構(gòu)的改變，從而影響到CPV的宿主范圍。此外，QN1第497位氨基酸Q到L的替換、QN2第2位氨基酸S到G的替換和QN4第151位氨基酸K到R的替換都未見報(bào)道，這可能與病毒的進(jìn)化和致病性有關(guān)，有待了解這些部位氨基酸突變的確切生物學(xué)意義。

犬細(xì)小病毒從出現(xiàn)到目前雖僅有30多年的歷史，但該病毒進(jìn)化速度快，血清型也不斷出現(xiàn)新的變異，該病毒引起的疾病仍然沒有得到有效的控制。目前普遍使用的商品化疫苗株為CPV-2亞型，而國(guó)內(nèi)主要的流行毒株為New CPV-2a亞型，這種流行毒株與疫苗毒株的差異可能是造成疫苗免疫失敗原因之一。本研究通過分離近期流行毒株并進(jìn)行一系列鑒定和分析，為有針對(duì)性地開發(fā)特異、高效的犬細(xì)小病疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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