正交試驗(yàn)法優(yōu)選痛風(fēng)顆粒醇提工藝

陳梓賢，李建利，2，羅悅，王利潔

·炮制制劑·

正交試驗(yàn)法優(yōu)選痛風(fēng)顆粒醇提工藝

陳梓賢1，李建利1，2，羅悅1，王利潔1

目的：優(yōu)選痛風(fēng)顆粒的醇提取工藝。方法：采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝條件，以蒼術(shù)素，鹽酸小檗堿和干膏收率的綜合評(píng)分為指標(biāo)，考察乙醇用量，乙醇濃度、提取次數(shù)和提取時(shí)間對(duì)醇提工藝條件的影響。結(jié)果：最佳提取工藝為加6倍量60%的乙醇，提取3次，每次0.5小時(shí)。結(jié)論：優(yōu)選所得提取工藝條件穩(wěn)定可行，適用于痛風(fēng)顆粒的工業(yè)化生產(chǎn)。

痛風(fēng)顆粒；醇提工藝；正交設(shè)計(jì)

蒼術(shù)為菊科植物茅蒼術(shù)Atractylodes lancea(Thunb.) DC.或北蒼術(shù)Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.的干燥根莖，具有燥濕健脾，祛風(fēng)散寒、明目的功效，其化學(xué)成分有蒼術(shù)素、蒼術(shù)酮等，且含量相對(duì)較高[1]。關(guān)黃柏為蕓香科植物黃檗Phellodndron amurense Rupr.的干燥樹(shù)皮，具有清熱燥濕，瀉火除蒸，解毒療瘡的作用，其主要含小檗堿類生物堿[2]。川牛膝為莧科植物川牛膝Cyathula offcinalis Kuan.的干燥根，具有逐瘀通經(jīng)，通利關(guān)節(jié)，利尿通淋的功能，植物甾酮類成分為川牛膝中的主要有效組分[3]。

痛風(fēng)顆粒為四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)研究所承擔(dān)研發(fā)的第六類新藥，由金銀花、板藍(lán)根、蒼術(shù)、川牛膝、關(guān)黃柏等13味中藥組成，具有清熱解毒，祛風(fēng)止痛，燥濕健脾之功效，主要用于痛風(fēng)痹痛證的治療。復(fù)方中蒼術(shù)，關(guān)黃柏和川牛膝均含有較多的脂溶性成分，與其清熱祛風(fēng)，燥濕健脾的功能關(guān)系密切。本試驗(yàn)根據(jù)藥物的性質(zhì)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選提取工藝，采用高效液相色譜法測(cè)定提取工藝中指標(biāo)性成分蒼術(shù)素和鹽酸小檗堿的含量，以蒼術(shù)素含量、鹽酸小檗堿含量及干膏收率為考察對(duì)象進(jìn)行綜合評(píng)分，確定痛風(fēng)顆粒最佳提取工藝條件，從而為痛風(fēng)顆粒的成型工藝研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀（儀器包括：Agilent色譜工作站、VMD紫外檢查器，美國(guó)安捷倫公司）；DJ600-2型電子天平（成都倍塞克儀器表研究所）；電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；GHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 材料

關(guān)黃柏飲片、川牛膝飲片、蒼術(shù)飲片均購(gòu)于四川省中藥飲片有限責(zé)任公司，并經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室盧先明教授鑒定，蒼術(shù)為菊科植物茅蒼術(shù)Atractylodes lancea(Thunb.)DC.或北蒼術(shù)Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.的干燥根莖，關(guān)黃柏為蕓香科植物黃檗Phellodndron amurense Rupr.的干燥樹(shù)皮，川牛膝為莧科植物川牛膝Cyathula offcinalis Kuan.的干燥根，均符合《中國(guó)藥典》2010年版一部及《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》2002年版相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定。蒼術(shù)素對(duì)照品（購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111924-201102，供含量測(cè)定用）；鹽酸小檗堿對(duì)照品（購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110713-200911，供含量測(cè)定用）；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)影響該工藝的主要因素：加醇量，加醇濃度，提取次數(shù)，提取時(shí)間，用L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行優(yōu)選。以鹽酸小檗堿、蒼術(shù)素、干膏收率為考察指標(biāo)；各指標(biāo)的權(quán)重評(píng)分為，干膏收率占20分，鹽酸小檗堿占40分，蒼術(shù)素占40分，總分為100分。因素與水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2.2 干膏收率的測(cè)定

精密吸取按正交試驗(yàn)表試驗(yàn)得到的各份藥材醇提液20mL于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后移至干燥箱105℃干燥3h，取出，移至干燥器中，冷卻30分鐘，迅速稱重，計(jì)算干膏收率。

2.3 蒼術(shù)素含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Global Chromatography SP-120-5-C18-BI0（4.6×250mm），5μm；流動(dòng)相：甲醇-水（80:20）；流速：1mL/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：340 nm；理論塔板數(shù)按蒼術(shù)素峰計(jì)算不低于5000。見(jiàn)圖1。

圖1 陰性對(duì)照（A）、蒼術(shù)素對(duì)照品（B）、供試品（C）的HPLC色譜圖

2.3.2 對(duì)照品與供試品溶液的制備 取蒼術(shù)素對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色瓶中，加甲醇制成0.02136 mg．mL-1的溶液，即得對(duì)照品溶液。

稱取痛風(fēng)顆粒處方各味藥材，共22g，平行9份，依次按照正交試驗(yàn)表中確定的試驗(yàn)條件操作，將所得藥液濾過(guò)，濾液定容至250mL瓶中，將濾液用微孔濾膜濾過(guò)即得供試品溶液。

2.3.3 陰性對(duì)照溶液的制備 處方比例，取除蒼術(shù)以外的其他味藥，按“2.3.2”供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3.4 線性考察 分別精密吸取上述蒼術(shù)素對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、20μL，測(cè)定其峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=11584.996X－7.581，r=0.9999。結(jié)果表明蒼術(shù)素進(jìn)樣量在0.0427～0.4272mg?mL-1范圍內(nèi)，與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密稱取上述蒼術(shù)素對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定，結(jié)果蒼術(shù)素峰面積的RSD值為0.98%，表明該儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取上述蒼術(shù)素對(duì)照品溶液和“2.3.2”項(xiàng)下正交試驗(yàn) 2號(hào)樣品貯備液制成的供試品溶液，分別在0h、6h、12h、16h、24h、48h進(jìn)樣10μL，測(cè)定蒼術(shù)素的峰面積。結(jié)果對(duì)照品溶液蒼術(shù)素峰面積RSD值為0.75%（n=6），供試品溶液中蒼術(shù)素峰面積RSD值為0.83%（n=6），表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在48h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.3.2”項(xiàng)下2號(hào)樣品貯備液，按供試品溶液的制備方法，制備5份供試品溶液，分別進(jìn)樣10μL，依法測(cè)定，結(jié)果蒼術(shù)素峰面積RSD值為0.63%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的樣品溶液1mL（0.1737mg．mL-1），共6份，按《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄XVIIIA項(xiàng)下方法，計(jì)算加入等量蒼術(shù)素對(duì)照品溶液，按上述色譜條件下測(cè)定，計(jì)算蒼術(shù)素的加樣回收率。結(jié)果平均回收率99.84%，RSD值為1.72%（n=6），表明本品回收率符合要求。

2.3.9 樣品測(cè)定 取供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.4 鹽酸小檗堿含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Global Chromatography SP-120-5-C18-BI0（4.6×250mm），5μm；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～20min，73%A；20～25min，40%A；25～35min，10%A；35～40min，90%A；40～45min，73%A）；流速：1mL/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：345 nm；理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算不低于4000。見(jiàn)圖2。

圖2 陰性對(duì)照（A）、鹽酸小檗堿對(duì)照品（B）、供試品（C）的HPLC色譜圖

2.4.2 對(duì)照品與供試品溶液的制備 鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色瓶中，加60%乙醇制成0.0576 mg．mL-1的溶液，即得對(duì)照品溶液。

稱取痛風(fēng)顆粒處方各味藥材，共22g，平行9份，依次按照正交試驗(yàn)表中確定的試驗(yàn)條件操作，將所得藥液濾過(guò)，濾液定容至250ml瓶中，將濾液用微孔濾膜濾過(guò)即得供試品溶液。

2.4.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例，取除關(guān)黃柏以外的其他味藥，按“2.4.2”供試品制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.4.4 線性考察 分別精密吸取上述鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、20μL，測(cè)定其峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=3870.462X－14.693，r=0.9998。結(jié)果表明鹽酸小檗堿的進(jìn)樣量在0.0115～0.1152mg．mL-1范圍內(nèi)，與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 精密稱取上述鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定，結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積的RSD值為0.93%，表明該儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取上述鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液和“2.4.2”項(xiàng)下正交試驗(yàn)2號(hào)樣品貯備液制成的供試品溶液，分別在0h、6h、12h、16h、24h、48h進(jìn)樣10μL，測(cè)定鹽酸小檗堿的峰面積。結(jié)果對(duì)照品溶液鹽酸小檗堿峰面積RSD值為0.62%（n=6），供試品溶液中鹽酸小檗堿峰面積RSD值為0.71%（n=6），表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在48h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.4.2”項(xiàng)下2號(hào)樣品貯備液，按供試品溶液的制備方法，制備5份供試品溶液，分別進(jìn)樣10μL，依法測(cè)定，結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積RSD值為1.06%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的樣品溶液1mL（0.0151 mg．mL-1），共6份，按《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄XVIIIA項(xiàng)下方法，計(jì)算加入等量鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，按上述色譜條件下測(cè)定，計(jì)算鹽酸小檗堿的加樣回收率。結(jié)果平均回收率99.91%，RSD值為1.38%（n=6），表明本品回收率符合要求。

2.4.9 樣品測(cè)定 取供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.5 試驗(yàn)結(jié)果

依次測(cè)定每組蒼術(shù)素及鹽酸小檗堿含量，干膏收率，試驗(yàn)結(jié)果和結(jié)果分析見(jiàn)表2、表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析表

結(jié)果表明：根據(jù)綜合評(píng)分結(jié)果，由直觀分析可得影響提取效果的因素大小為：提取次數(shù)（C）＞乙醇濃度（B）＞乙醇用量（A）＞提取時(shí)間（D）；對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析結(jié)果表明，提取次數(shù)對(duì)蒼術(shù)素、鹽酸小檗堿量及干膏收率有顯著性影響，乙醇濃度、乙醇用量和提取時(shí)間對(duì)蒼術(shù)素、鹽酸小檗堿量及干膏收率無(wú)顯著性影響。綜合直觀分析和方差分析結(jié)果，結(jié)合工業(yè)化大生產(chǎn)節(jié)約能效，降低生產(chǎn)成本考慮，確定最佳提取工藝為A1B2C3D1，即加6倍量60%乙醇，提取3次，每次0.5小時(shí)。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

按正交試驗(yàn)篩選出的最佳提取工藝，重復(fù)試驗(yàn)3次，結(jié)果蒼術(shù)素平均含量為3.249mg．g-1，鹽酸小檗堿平均含量為4.066 mg．g-1，干膏平均收率為30.06%。三者的RSD值依次為0.96%，0.82%，0.69%，表明所確定的最佳工藝穩(wěn)定，合理可行。

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分的選擇

本試驗(yàn)在確定提取工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，復(fù)方中蒼術(shù)與關(guān)黃柏共為臣藥，蒼術(shù)素為主要且含量較多的有效成分，具有防止胃損傷、抗炎、利膽等作用[4]，所以作為評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，但其性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光、熱，易氧化分解[5]，定量分析會(huì)產(chǎn)生波動(dòng)，故同時(shí)選擇了關(guān)黃柏中主要有效成分鹽酸小檗堿[6]作為指標(biāo)。

3.2 提取溶劑的選擇

本復(fù)方由13味藥材組成，化學(xué)成分復(fù)雜，采用傳統(tǒng)的提取工藝可能不能發(fā)揮其最好的臨床療效，故綜合考慮藥效與化學(xué)成分的性質(zhì)，針對(duì)復(fù)方中蒼術(shù)、關(guān)黃柏、川牛膝3味藥材水溶性差的有效成分，故采用乙醇提取優(yōu)選提取工藝。復(fù)方中其余10味藥材其中的水溶性有效成分相對(duì)較多，因此選擇水煎煮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。

3.3 流動(dòng)相的選擇

在測(cè)定蒼術(shù)素含量的過(guò)程中，試驗(yàn)分別比較了甲醇-水（79:21）和甲醇-水（80:20）兩種不同的流動(dòng)相，結(jié)果甲醇-水（80:20）效果較好，故選為流動(dòng)相。

在測(cè)定鹽酸小檗堿含量時(shí)，試驗(yàn)分別比較了乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫（0～20min,25%;20～40 min,25%～65%A;40～45min,65%～90%A;45min～50min, 90%A;50～65min,25%A）和乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫（0～20min,73%A;20～25min,40%A;35～40min,9 0%A;40～45min,73%A），結(jié)果后者的效果更好，故選為流動(dòng)相。

[1] 石書(shū)江,秦臻,孔松芝,等.蒼術(shù)抗流感病毒有效成分的篩選[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2012,23(3):565.

[2] 張冠英,董瑞娟,廉蓮.川黃柏、關(guān)黃柏的化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,29(10):812.

[3] 譚玉柱,陳寶華,李敏,等.川牛膝不同變種的品質(zhì)評(píng)價(jià)[J].中成藥,2012,34(9):1770.

[4] 周軍,趙晨,王杰.藿香正氣不同制劑中蒼術(shù)素的含量測(cè)定[J].藥物分析雜志,2012,32(8):1476.

[5] 張曉蘭,李錦,李遇伯,等.高效液相色譜法測(cè)定茅蒼術(shù)藥材中β-桉葉醇與蒼術(shù)素的含量[J].藥物分析雜志,2009,29(12):2051.

[6] 喻志芳,孫璇.復(fù)方黃柏滴丸中關(guān)黃柏提取工藝研究[J].新疆中醫(yī)藥,2012,30(3):72.

（責(zé)任編輯： 胡慧玲）

Optimization of alcohol extraction technology of Tongfeng granules by orthogonal test

CHEN Zi-xian1, LI Jian-li1,2, LUO Yue1, WANG Li-jie1//(1.Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu, 611137, China; 2.Institute of Traditional Chinese Medicine, Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences, Chengdu, 610031, China)

Objective:To optimize the alcohol extraction condition of Tongfeng granules.Method:The optimum conditions were investigated by the L9(34) orthogonal design. With the content of atractylodin, berberine hydrochloride and yield of dry extract as indexes, orthogonal design was taken to investigate effects of the concentration of alcohol, the amount of alcohol, extraction time and times on extraction technology.Result:The optimal conditions were as following: refux extracted 3 times with 6 folds of 60% ethanol for 0.5 hours each time.Conclusion:This optimized process is stable and feasible, and it can be applied in industrial production.

Tongfeng granule; alcohol extraction technology; orthogonal design

R 283

A

1674-926X(2014)05-006-04

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)研究所，四川 成都610031

陳梓賢（1990-），男，碩士研究生，主要從事中藥新制劑、新劑型與新技術(shù)研究Tel:13458569717 Email:czxbangbang@163.com

李建利（1957-），男，教授，主任藥師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥新制劑、新劑型與新技術(shù)研究Tel:15902833306 Email:menguan1005@163.com

2014-01-14