星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化加味圣愈湯的水提工藝

楊秀梅，黃勤挽，歐小群，譚茂蘭，湯朝暉，李煒弘

·炮制制劑·

星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化加味圣愈湯的水提工藝

楊秀梅，黃勤挽，歐小群，譚茂蘭，湯朝暉，李煒弘

目的：利用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化加味圣愈湯的水提工藝。方法：以經(jīng)醇提后的藥渣為原料，并以溶劑倍數(shù)、提取時間為自變量，以多糖含量及干膏收率的總評“OD”值為評價指標(biāo)，擬合二次項方程，繪制三維效應(yīng)面圖，選取最佳提取工藝。結(jié)果：最佳提取工藝為：溶劑倍數(shù)為10倍，提取2次，每次2h。結(jié)論：星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化加味圣愈湯的水提工藝方法簡便，預(yù)測性好。

加味圣愈湯；提取工藝；星點設(shè)計

加味圣愈湯用于黃褐斑的治療，具有悠久的用藥歷史，臨床效果好，為成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院臨床經(jīng)驗方。處方主要由人參、黃芪、白芷、白及等藥味組成，本方中的有效成分除皂苷類、香豆素類等極性相對較小的成分外，還含有大量多糖。研究表明，這些多糖具有促進皮膚免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老等藥理作用[1～3]，為重要的有效成分。本方有效成分的提取工藝大致分為醇提工藝和水提工藝兩部分，實驗前期已優(yōu)化出醇提的最佳工藝。本實驗在優(yōu)化醇提工藝的基礎(chǔ)上，以醇提后的藥渣為原料，采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法，以多糖含量及干膏收率為評價指標(biāo)，優(yōu)化本方的水提工藝，為后續(xù)成型工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

UV-6100紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；人參飲片（批號：1206020）、黃芪飲片（批號：1301003）、白芷飲片（批號：1304003）、白及飲片（批號：1205137）等，均購于四川新荷花中藥飲片有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定，符合《中國藥典》2010年版規(guī)定。D-無水葡萄糖對照品（批號：110833-200302，中國藥品生物制品研究所）。具塞試管、苯酚、硫酸、純水等。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取105 ℃干燥至恒重的D-無水葡萄糖10.72mg，加水溶解并定容至100mL容量瓶中，搖勻即得107.2μg/mL的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

按處方比例稱取醇提后的藥渣，以水為提取溶劑，按實驗安排進行提取，濾過。精密吸取各提取液0.1mL，加水稀釋至10mL，即得。

2.3 多糖測定方法

精密吸取純水（空白對照）、對照品、供試品溶液2mL置具塞試管中，分別加入5%苯酚溶液1mL，搖勻，再迅速加入5mL濃硫酸，搖勻，置沸水浴中加熱15min，取出冷卻，在486nm處測定吸光度。

2.4 干膏收率的測定

取各提取液25mL于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴揮干，置105℃烘箱中干燥至恒重，計算其干膏收率。

2.5 線性范圍考察

精密吸取對照品溶液0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL置具塞試管中，加水補至2mL，按“2.3”項下自“分別加入5%苯酚溶液1mL……”操作，測定其吸光度值，以吸光度對濃度進行線性回歸得回歸方程：A=0.0591C-0.0363，γ=0.9992，結(jié)果表明葡萄糖在4.02～16.08μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度考察

精密吸取葡萄糖對照品溶液6份，按“2.3”項下測定其吸光度，計算RSD=1.32%，說明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性考察

對同一樣品進行6次獨立測定吸光度，結(jié)果RSD=1.67 %。

2.8 顯色后穩(wěn)定性考察

取供試品溶液2mL，按“2.3”項下顯色完全后，分別在0、15、30、45、60min測定其吸光度，計算RSD=2.14%，表明樣品溶液顯色后1h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 單因素實驗選取因素及相關(guān)水平

2.9.1 溶劑倍數(shù)對提取效率的影響 按處方比例稱取醇提后的藥渣，分別以6、8、10、12、15、20倍量純水作為提取溶劑，提取1h，測定多糖含量。結(jié)果表明，隨著溶劑量的增加，多糖的提取效率也在提高，但當(dāng)溶劑量增大到10倍時，提取效率增大很少，因此將溶劑倍數(shù)的上限確定為10倍溶劑量，下限確定為6倍溶劑量，見圖1。

2.9.2 提取時間對提取效率的影響 按處方比例稱取醇提后的藥渣，均以8倍量純水作為提取溶劑，分別提取0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h，測定各樣品多糖含量。結(jié)果表明，隨著提取時間的增加，多糖提取效率也在增加，當(dāng)提取時間增加到1.5h時，提取效率增加不明顯，因此將提取時間的上限確定為2h，下限確定為1h，見圖2。

圖1 溶劑倍數(shù)對多糖提取效率的影響

圖2 提取時間對多糖提取效率的影響

2.9.3 提取次數(shù)對提取效率的影響 按處方比例稱取醇提后的藥渣，均以10倍量純水作為提取溶劑，分別提取1、2、3次，每次1.5h，測定各樣品多糖含量。結(jié)果表明多糖含量隨提取次數(shù)的增加而增加，但提取3次與提取2次相比，提取效率增加不明顯，從經(jīng)濟的角度考慮，將提取次數(shù)確定為2次。

2.10 星點實驗設(shè)計與結(jié)果

本實驗考察的因素有提取次數(shù)、提取時間、溶劑倍數(shù)，但因提取次數(shù)為非連續(xù)型變量，難以進行回歸處理，結(jié)合單因素實驗，將提取次數(shù)確定為2次。據(jù)星點設(shè)計原理，設(shè)計為2因素5水平的實驗。因素水平見表1，實驗安排及結(jié)果見表2。

表1 星點設(shè)計因素與水平

表2 星點實驗安排及結(jié)果

備注：9～13為重復(fù)試驗，OD為采用Hassan公式將結(jié)果歸一化后，所得的總評歸一值。

2.11 模型擬合

以總評“OD”值對提取時間(A)、溶劑倍數(shù)(B)進行多元線性回歸和二次項擬合，得多元線性方程：

Y=-1.07069+0.64123A+0.086829B，(γ=0.8810，P＜0.0001）；

二次項方程：

Y=-3.4 9 0 0 6+2.5 5 8 4 9 A+0.3 5 8 1 4 B-0.056522AB+1.50799-0.48836A2-0.011658B2，(γ=0.9830，P＜0.0001）

多元線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)γ=0.8810，二次項擬合方程復(fù)相關(guān)系數(shù)γ=0.9830，即二次項擬合方程復(fù)相關(guān)系數(shù)較高，說明響應(yīng)值與各因素間并非簡單的線性關(guān)系。因此選取可行度較大、預(yù)測性較好的二次項方程作為擬合模型。固定2個自變量之一為中值，以總評OD為因變量，繪制效應(yīng)面三維圖，見圖3。

圖3 三維效應(yīng)圖

采用Design Expert 7.0統(tǒng)計分析軟件，對工藝進行最優(yōu)化設(shè)計，預(yù)測最佳OD值為0.9586，得到最佳的水提工藝參數(shù)為：溶劑倍數(shù)為10倍，提取2次，每次2h。

2.12 驗證實驗

稱取3份樣品，分別以10倍量純水為提取溶劑，提取2次，每次2h。測定各指標(biāo)，計算出總評OD值，其結(jié)果與擬合方程預(yù)測的最佳值相比較，見表3。

表3 驗證實驗結(jié)果（n=3）

據(jù)上表結(jié)果可知，預(yù)測值與實測值偏差較小，表明建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性較好。因此，確定最佳的提取工藝為：溶劑倍數(shù)為10倍，提取2次，每次2h。

3 討論

星點設(shè)計-效應(yīng)面法是近年來在優(yōu)化中藥提取工藝方面，應(yīng)用十分廣泛的一種方法[4～6]。適用于非線性擬合，具有實驗次數(shù)少、精密度高、預(yù)測性好等優(yōu)點。本實驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選工藝，其結(jié)果更具可靠性。以擬合的二次方程為模型，得出總評OD值的預(yù)測值為0.9586，經(jīng)過3次驗證實驗，得到總評OD值的平均值為0.9596，偏差為0.11%，結(jié)果表明采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化本方的工藝預(yù)測性較好。

本實驗選取的檢測波長為486nm，這與《中國藥典》多糖檢測波長（490nm）不一致。為確定最佳檢測波長，分別吸取對照品和供試品溶液，按“2.3”項下方法顯色，于UV-6100上從400～600 nm 進行掃描，發(fā)現(xiàn)對照品和樣品溶液均在486 nm有最大吸收，故波長確定為486nm。

加味圣愈湯中人參、黃芪、白及、白芷等歷來為中醫(yī)美容常用藥材，本方以益氣補血治其本，以活血化瘀、排毒生肌以治其標(biāo)，標(biāo)本兼治，以達到消除色斑，美白養(yǎng)顏的效果。本實驗優(yōu)化出了本方水提的最佳工藝，為下一步的制劑成型奠定了基礎(chǔ)。

[1] 楊大鵬,李青,劉思杰,等.人參中人參多糖檢測方法研究[J].人參研究,2011,3:5.

[2] 朱平先,周洪,李博,等.黃芪多糖對冠心病及血管內(nèi)皮的藥理作用與研究進展[J].實用心腦肺血管病雜志,2010,18(8): 1191.

[3] 王春宏,王軍.白及多糖的藥用研究[J].中國新醫(yī)藥,2003,2(5):53.

[4] 盧君蓉,傅超美,劉芳,等.星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選丹參中丹參總酚酸的提取工藝[J].中成藥,2012,34(7):1373.

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（責(zé)任編輯： 胡慧玲）

Optimization of the water extraction process of Jiawei Shengyu Decoction by central composite design-response surface method

YANG Xiu-mei, HUANG Qin-wan, OU Xiao-qun, TAN Mao-lan, TANG Zhao-hui, LI Wei-hong //(Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, China)

Objective:To optimize the water extraction process of Jiawei Shengyu decoction by central composite designresponse surface method.Method:The dreg after alcohol extraction was used as the raw material. The extraction process of Jiawei Shengyu decoction was optimized with solvent volume and the extraction time as independent variables, and the overall desirability value of the yield of the extracta, and polysaccharide content as evaluation indexes. Then quadratic polynomial ftting and depicting of 3D-response surface were performed and from which the optimal extraction process was selected.Result:The optimal extraction process was 10 fold solvent, 2 hours for decoction, and 2 times for extraction.Conclusion:Central composite design-response surface methodology is convenient and highly predictive for the extraction of Jiawei Shengyu decoction.

Jiawei Shengyu decoction; extraction process; central composite design

R 283

A

1674-926X(2014)05-005-03

四川省科技廳支撐計劃（編號：2012FZ0017）；成都市科技局課題（編號：12DXYB310JH）

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 教育部中藥材標(biāo)準(zhǔn)化重點實驗室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

楊秀梅，女（漢），四川遂寧人，碩士研究生，主要從事中藥新制劑新技術(shù)的研究Tel:13568997942 Email:564004232@qq.com

黃勤挽，男（漢），四川成都人，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，從事中藥炮制與中藥制劑研究 Tel/Fax:13982199974 Email:36190587@qq.com

2014-03-10