金線吊烏龜?shù)慕M織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究

苗 爽， 袁卓婷，王長(zhǎng)春，胡海濤

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004）

金線吊烏龜（Stephania cepharanthaHayata）為防己科千金藤屬多年生草質(zhì)落葉藤本植物，其塊根為民間常用草藥，稱白藥、白藥子或白大藥，味苦性寒，有清熱解毒、消腫止痛之功效，常用于治療癰疽腫毒、腮腺炎、毒蛇咬傷等[1-2]。現(xiàn)代藥理學(xué)試驗(yàn)表明，金線吊烏龜塊根中含有多種生物堿[3-4]，具有多種臨床藥理活性，如增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)血管舒張、抗HIV-1、抗癌、抑制過(guò)敏性休克等功效[5-7]。隨著藥理學(xué)研究的深入，金線吊烏龜?shù)拈_(kāi)發(fā)應(yīng)用和物種資源保護(hù)的矛盾將日益突出，開(kāi)展金線吊烏龜?shù)慕M培快繁非常必要。研究以種質(zhì)快繁為目的，對(duì)金線吊烏龜組培快繁關(guān)鍵技術(shù)開(kāi)展研究，以期為其種質(zhì)資源的保護(hù)，以及其開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

金線吊烏龜?shù)闹仓瓴勺院虾馍?，種植在浙江師范大學(xué)生物園內(nèi)。取其幼嫩的帶腋芽莖段，去除葉片，先用清潔劑清洗，再用流水沖洗1 h，在超凈工作臺(tái)上用75 %乙醇處理1 min，0.1% HgCl2溶液處理10 min，再用無(wú)菌水清洗5次，將莖段切成長(zhǎng)約2.0 cm的帶腋芽莖段，接種到腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：1/2 MS+5 μmol/L KT+0.5 μmol/L NAA。繼代增殖培養(yǎng)基：1/2 MS+（1.0、5.0、10.0、20.0）μmol/L KT +0.5 μmol/L NAA；1/2 MS+（1.0、5.0、10.0、20.0）μmol/L 6-BA+0.5 μmol/L NAA。生根培養(yǎng)基：1/4 MS+（1.0、5.0、10.0、20.0） μmol/L NAA+1.0 g/L活性炭。附加蔗糖30 g/L、瓊脂粉6 g/L，pH值5.8，配制分裝后，121℃滅菌20 min。培養(yǎng)溫度為（26±2）℃，光照強(qiáng)度1 500 lx，光照時(shí)間16 h/d。

1.3 芽的增殖培養(yǎng)

取健壯、無(wú)菌的試管苗，剪成2.0 cm的帶節(jié)小段，接種到增殖培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種6瓶，每瓶接種6個(gè)芽，定期觀察記錄，30 d統(tǒng)計(jì)叢生芽增殖系數(shù)。增殖系數(shù)的計(jì)算采用平均從一個(gè)芽上產(chǎn)生的新芽數(shù)。根據(jù)增殖系數(shù)分析各因素、各水平差異顯著性，并對(duì)效果顯著的因子做多重比較。

1.4 生根培養(yǎng)

選用苗高5 cm左右的小苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，每種處理6瓶，每瓶接種6株，3次重復(fù)，30 d統(tǒng)計(jì)生根情況。

1.5 生根苗的煉苗與移栽

生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后，苗高5～8 cm、根系發(fā)達(dá)的生根苗，預(yù)先室內(nèi)開(kāi)蓋煉苗3 d，小苗從培養(yǎng)瓶中取出后，用清水洗去根部殘留的培養(yǎng)基，栽植于下列基質(zhì)中，種后澆透水，適當(dāng)保濕遮陰，30 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素濃度配比對(duì)金線吊烏龜叢生芽增殖的影響

從表1中可以看出，在金線吊烏龜?shù)慕M培快繁試驗(yàn)中， 6-BA對(duì)金線吊烏龜離體培養(yǎng)可能有毒害作用，即便在低濃度下也影響芽的誘導(dǎo)和增殖。KT為適宜的細(xì)胞分裂素，在添加KT的培養(yǎng)基上，叢生苗長(zhǎng)勢(shì)比較好，而且隨著KT濃度的增加芽增殖倍數(shù)也相應(yīng)提高，但KT濃度達(dá)20.0 μmol/L以上時(shí)誘導(dǎo)出的芽出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。因此綜合考慮，10 μmol/L KT，0.5 μmol/L NAA為適宜金線吊烏龜增殖培養(yǎng)的激素組合。

表1 不同激素濃度配比對(duì)金線吊烏龜叢生芽的增殖效果Table 1 Multiplication effects of different concentrations of hormones on cluster shoots of Stephania cepharantha Hayata

2.2 不同濃度的CCC對(duì)金線吊烏龜壯苗的影響

在離體培養(yǎng)中，生長(zhǎng)抑制劑類物質(zhì)可以使苗木矮化健壯，抑制過(guò)高生長(zhǎng)，對(duì)培育壯苗、提高試管苗質(zhì)量具有較好的效果。在1/2 MS+10 μmol/L KT+0.5 μmol/L NAA為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的CCC，培養(yǎng)30 d后，觀察到不同濃度CCC處理均對(duì)試管苗的生長(zhǎng)有抑制作用，且抑制作用隨濃度增加而增強(qiáng)，植株明顯變矮，葉色逐漸加深，苗木逐漸變粗，使用濃度以20.0 μmol/L CCC效果最好（見(jiàn)表2）。

表2 不同濃度CCC對(duì)金線吊烏龜壯苗的效果Table 2 Effects of different concentrations of CCC on strong shoots of Stephania cepharantha Hayata

2.3 不同濃度的NAA對(duì)金線吊烏龜生根的影響

表3顯示，培養(yǎng)基中不同濃度的NAA對(duì)金線吊烏龜不定根誘導(dǎo)影響比較明顯，生根率及根數(shù)隨NAA濃度增高而升高，其中不加激素的培養(yǎng)基不能誘導(dǎo)生根，在15號(hào)培養(yǎng)基中的芽生根率為100%，平均根數(shù)為4.3條。雖然在16號(hào)培養(yǎng)基上接種的芽生根率比在15號(hào)培養(yǎng)基接種的芽生根率平均根數(shù)高，但誘導(dǎo)出來(lái)的根有部分表現(xiàn)出生長(zhǎng)不正常，因此選擇15號(hào)培養(yǎng)基作為金線吊烏龜?shù)纳囵B(yǎng)基。

表3 不同濃度NAA對(duì)金線吊烏龜生根的影響Table 3 Effects of different concentrations of NAA on plantlet rooting of Stephania cepharantha Hayata

3 小結(jié)與討論

在建立經(jīng)濟(jì)植物組培快繁體系的研究中，為了達(dá)到快速繁殖的目的，通常需要在培養(yǎng)基中添加一定質(zhì)量濃度的植物激素，培養(yǎng)基中添加的植物激素種類和濃度是決定組培快繁體系成功的關(guān)鍵。6-BA是經(jīng)濟(jì)植物組培快繁體系中常用的細(xì)胞分裂素，廣泛應(yīng)用于大多數(shù)植物組培快繁殖研究中，無(wú)論是誘導(dǎo)腋芽的萌動(dòng)成苗，還是試管苗的增殖。然而在金線吊烏龜組培快繁中，發(fā)現(xiàn)6-BA的生物學(xué)效應(yīng)與其在其他植物材料上的有明顯區(qū)別。在添加了不同濃度6-BA的叢生芽增殖培養(yǎng)基上都不能誘導(dǎo)出叢生芽，即便是在較低濃度下，也出現(xiàn)新芽萎縮、難以伸長(zhǎng)、難以長(zhǎng)高等癥狀，嚴(yán)重影響金線吊烏龜植株的生長(zhǎng)。黃寧珍等[8]在金線吊烏龜?shù)耐瑢僦参飶V西地不容的組培快繁殖中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。一系列篩選試驗(yàn)表明，在金線吊烏龜?shù)睦^代增殖過(guò)程中KT的效果明顯優(yōu)于6-BA，誘導(dǎo)出的叢生芽長(zhǎng)勢(shì)良好。在培養(yǎng)基中適當(dāng)添加CCC能顯著改善金線吊烏龜試管苗的品質(zhì)，經(jīng)適量質(zhì)量濃度CCC處理，有利于金線吊烏龜形成壯苗及有效嫩莖的比例，可以提高金線吊烏龜?shù)纳鶖?shù)量和移栽成活率。

試驗(yàn)以金線吊烏龜莖段作為外植體，獲得了較高的增殖系數(shù)、生根率和移栽成活率，篩選出了金線吊烏龜快繁過(guò)程中各個(gè)階段所需的適宜培養(yǎng)基，最佳叢生芽增殖培養(yǎng)基為1/2 MS+ 10 μmol/L KT + 0.5 μmol/L NAA+ 20 μmol/L CCC，芽苗生根的最適培養(yǎng)基為1/4 MS+ 10 μmol/L NAA 。該組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)體系為金線吊烏龜快速育苗提供了技術(shù)支持。

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