香煙對(duì)大鼠肺白介素-8、谷胱甘肽及組蛋白去乙?；?的影響*

王玉梅 黃瓊 羅鵬 段鴻俠

吸煙是導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾?。–hronic obstructive pulmonary disease， COPD）的重要因素[1]。慢性氣道炎癥是COPD的典型特征，香煙煙霧通過(guò)激活吸煙者和COPD患者肺部的氧化應(yīng)激反應(yīng)觸發(fā)了氣道的慢性炎癥[2]。本文利用煙熏大鼠造成大鼠COPD模型，分析吸煙及戒煙后大鼠支氣管肺泡灌洗液中谷胱甘肽（Glutathione， GSH）及肺組織中組蛋白去乙酰化酶2（histone deacetylase 2， HDAC2）的變化，進(jìn)一步探討吸煙導(dǎo)致COPD的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 GSH ELIASA試劑盒（美國(guó)RD公司），兔抗鼠HDAC2抗體及免疫組化SP試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 健康清潔級(jí)雄性大鼠40只（安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），隨機(jī)分五組，對(duì)照組、吸煙1月組、吸煙2月組、戒煙1月組和戒煙2月組。

1.3 模型制備 紅三環(huán)牌過(guò)濾嘴香煙：焦油含量11 mg/支，煙氣一氧化碳量15 mg/支，煙堿量0.8 mg/支，由安徽中煙工業(yè)公司滁州卷煙廠(chǎng)出品。各實(shí)驗(yàn)組均在自制吸煙箱（80 cm×70 cm×50 cm）每天兩次，每次10支香煙持續(xù)煙熏半小時(shí)。戒煙組在煙熏兩個(gè)月后停止并繼續(xù)飼養(yǎng)1月及2月。

1.4 取材 大鼠腹腔注射10%的水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，開(kāi)胸分離肺后結(jié)扎左主支氣管，右肺注入10 mL生理鹽水后抽取肺泡灌洗液，重復(fù)3次，回收液離心后留上清液于-70 ℃冰凍備檢。左肺組織送病理和免疫組化檢測(cè)。

1.5 指標(biāo)檢測(cè) IL-8、GSH和HDAC2嚴(yán)格按照ELIASA試劑盒操作。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 13.0軟件，不同組間差異性采用單因素方差分析，兩變量間的相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理改變 實(shí)驗(yàn)組大鼠雙肺有不同程度氣腫及淤血。光鏡下：對(duì)照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常連續(xù)；吸煙1月組肺泡結(jié)構(gòu)受損，可見(jiàn)支氣管黏膜上皮纖毛倒伏、粘連，肺泡內(nèi)見(jiàn)淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)；吸煙2月組損害加重，肺泡腔擴(kuò)大融合，彈力纖維層破壞，肺泡數(shù)量減少；戒煙組仍可見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)受損、肺泡融合，淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)較吸煙組減少；戒煙2月組較1月組病理改變輕。

2.2 支氣管肺泡灌洗液（BALF）IL-8的變化對(duì) 照 組（39.85±8.83）pg/mL、 吸 煙 1月 組（50.29±5.60）pg/mL、吸煙2月組（56.29±4.81）pg/mL，戒 煙 1月 組（54.31±6.43）pg/mL、 戒 煙 2月 組（51.35±7.47）pg/mL。吸煙組與戒煙組各組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.300）。對(duì)照組與吸煙組和戒煙組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 大鼠BALF中GSH的變化 對(duì)照組BALF中GSH含量（133.42±10.33）mg/L、吸煙 1 月組（125.42±9.54）mg/L、吸煙2月組（116.96±6.85）mg/L、戒煙1月組（120.51±8.58）mg/L、戒煙 2月組（130.94±6.96）mg/L。對(duì)照組與吸煙組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對(duì)照組與戒煙組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；吸煙組與戒煙組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.4 大鼠肺組織HDAC2的變化 HDAC2的累積光密度值（IOD）：對(duì)照組（0.87±0.03），吸煙1月組（0.78±0.02），吸煙2月組（0.73±0.01），戒煙1月組（0.75±0.01），戒煙2月組（0.76±0.04）。對(duì)照組與吸煙組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其余兩兩組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

表1 BALF中IL-8、GSH及肺組織HDAC2的表達(dá)水平（±s）

表1 BALF中IL-8、GSH及肺組織HDAC2的表達(dá)水平（±s）

*與對(duì)照組比較，P<0.05；△與吸煙1月組比較，P<0.05；#與吸煙2月組比較，P<0.05；▲與戒煙1月組比較，P<0.05

組別 IL-8（pg/mL） GSH（mg/L） HDAC2（IOD）對(duì)照組 39.85±8.83 133.42±10.33 0.87±0.03吸煙1月 50.29±5.60*▲ 145.42±9.54*▲ 0.78±0.02*吸煙2月 56.29±4.81* 116.96±6.85* 0.73±0.01*戒煙1月 54.31±6.43*△ 120.51±8.58*△ 0.75±0.01戒煙2月 51.35±7.47*△# 130.94±6.96*△# 0.76±0.04

2.5 BALF 中IL-8、GSH與肺組織HDAC2蛋白相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，大鼠支氣管肺泡灌洗液IL-8與GSH呈負(fù)相關(guān)（r=-0.63，P<0.05），大鼠肺組織HDAC2蛋白表達(dá)與支氣管肺泡灌洗液IL-8水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.59，P<0.05），與GSH水平呈正相關(guān)（r=0.43，P<0.05）。

3 討論

慢性阻塞性肺部疾病（COPD）是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性疾病，以進(jìn)行性發(fā)展的氣流受限不完全可逆為特征，與肺部對(duì)有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)[3]。吸煙可導(dǎo)致COPD，在COPD和吸煙者的肺部均可以觀(guān)察到由于氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)觸發(fā)的炎癥反應(yīng)[4]。目前研究認(rèn)為，香煙煙霧通過(guò)激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞釋放蛋白酶和活性氧等引起細(xì)胞損傷和氣道炎癥[4]。

IL-8是一種多功能細(xì)胞因子，通過(guò)激活、趨化中性粒細(xì)胞并在氣道內(nèi)聚集，導(dǎo)致細(xì)胞變形反應(yīng)和脫顆粒反應(yīng)、呼吸爆發(fā)反應(yīng)后釋放溶酶體和形成超氧化物，參與COPD的炎癥反應(yīng)[5]。研究顯示與健康吸煙者和不吸煙者相比，COPD患者誘導(dǎo)痰中IL-8含量顯著升高，測(cè)定肺內(nèi)外的IL-8可反應(yīng)COPD患者的病情[6-7]。香煙煙霧誘導(dǎo)IL-8的釋放可能是通過(guò)氧化還原介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，特別是NF-κB的激活[8-9]。筆者的數(shù)據(jù)表明吸煙組較健康對(duì)照組肺泡灌洗液IL-8含量升高，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且隨著吸煙時(shí)間延長(zhǎng)，IL-8水平升高更為顯著。

每一口香煙煙霧中含有大約1017種氧化劑/氧自由基和4700種化合物，包括活性醛和醌類(lèi)。活性醛和醌類(lèi)還可以進(jìn)一步生成羥自由基。大量的氧化劑和自由基激活氧化應(yīng)激反應(yīng)。GSH是重要的抗氧化劑，對(duì)于保持氣道上皮細(xì)胞完整性和抵御肺部損傷與炎癥等方面有重要作用，現(xiàn)常將GSH作為評(píng)價(jià)氧化反應(yīng)的一個(gè)指標(biāo)[10]。筆者的研究發(fā)現(xiàn)吸煙后GSH含量下降，提示香煙煙霧降低GSH水平，并且GSH水平下降和IL-8水平升高具有顯著相關(guān)性（r=-0.63，P<0.05），提示GSH下降與肺泡巨噬細(xì)胞釋放IL-8有關(guān)，與相關(guān)研究一致[11-12]。Hirohiko[13]研究證明戒煙2周就可以改善長(zhǎng)期吸煙者的氧化抗氧化失衡狀態(tài)，可以檢測(cè)到GSH升高；Tavilani等研究顯示長(zhǎng)期吸煙者在戒煙1年后體內(nèi)氧化抗氧化指標(biāo)可恢復(fù)正常，但重新吸煙后GSH等指標(biāo)又再次上升[14-15]。筆者的研究也發(fā)現(xiàn)戒煙后GSH逐漸回升，與既往研究結(jié)果相似。

組蛋白去乙?；讣易灏?1種異構(gòu)體，劃分為三類(lèi)，Ⅰ類(lèi)HDACS（HDAC1，2，3，8和11）幾乎只存在于細(xì)胞核內(nèi)，Ⅱ類(lèi)HDACS（HDAC4，5，6，7，9和10）能夠響應(yīng)于某些細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間的信號(hào)穿梭，第Ⅲ類(lèi)功能尚未完全破譯。Ⅰ類(lèi)HDACS已被證明在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[16]。HDAC2主要參與炎癥反應(yīng)，是Ⅰ類(lèi)HDAC。最近的報(bào)道HDAC2是糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的抗炎活性所必需的酶，糖皮質(zhì)激素通過(guò)誘導(dǎo)組蛋白去乙?；傅鞍缀突虮磉_(dá)增加細(xì)胞HDAC2的活性[17]。筆者的研究發(fā)現(xiàn)香煙煙霧介導(dǎo)的IL-8的釋放與HDAC活性下降有關(guān)。有研究通過(guò)支氣管鏡活檢COPD患者和吸煙者的肺組織送檢，結(jié)果顯示肺泡巨噬細(xì)胞HDAC活性有顯著下降，并且HDAC活性下降幅度與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[18-19]。筆者的研究數(shù)據(jù)顯示肺組織HDAC2活性下降與早前的報(bào)道一致[20]，隨著吸煙時(shí)間的延長(zhǎng)，HDAC2活性降低越明顯，戒煙可使之有所恢復(fù)。

總之，本研究為香煙煙霧誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制提供了新的重要資料。香煙煙霧導(dǎo)致HDAC活性和HDAC2水平下降，HDAC活性下降與細(xì)胞內(nèi)GSH的消耗有關(guān)。抗氧化劑可能通過(guò)升高細(xì)胞內(nèi)GSH，恢復(fù)HDAC活性/水平和廢除香煙煙霧介導(dǎo)的IL-8的釋放來(lái)逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，因此有可能作為一種有用的治療方法來(lái)調(diào)節(jié)COPD患者細(xì)胞內(nèi)的核信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和高水平的氧化應(yīng)激反應(yīng)。此外，香煙煙霧介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是由細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)來(lái)調(diào)節(jié)的。

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