逆向累積分布圖及其在疫苗免疫原性數(shù)據(jù)分析中的應(yīng)用

東南大學(xué)流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系（210009） 陳召青 王詩(shī)遠(yuǎn) 楊舒靜 劉 沛

逆向累積分布圖及其在疫苗免疫原性數(shù)據(jù)分析中的應(yīng)用

東南大學(xué)流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系（210009） 陳召青 王詩(shī)遠(yuǎn) 楊舒靜 劉 沛△

在疫苗臨床試驗(yàn)中，接種后血清抗體水平的高低與該疫苗能否產(chǎn)生保護(hù)作用及保護(hù)水平的高低有著直接關(guān)系，因此對(duì)免疫原性的分析是疫苗臨床試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析的重要部分。就體液免疫反應(yīng)而言，這類數(shù)據(jù)的一個(gè)重要特征是數(shù)據(jù)的取值范圍較大，變化范圍?？缭蕉鄠€(gè)數(shù)量級(jí)，觀察值間呈現(xiàn)倍數(shù)關(guān)系。雖然其原始觀測(cè)數(shù)值呈右偏態(tài)分布［1］，但經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，免疫原性值一般滿足正態(tài)或近似正態(tài)分布。對(duì)這類數(shù)據(jù)，目前國(guó)內(nèi)通用的方法是首先計(jì)算其描述性統(tǒng)計(jì)指標(biāo)如幾何均數(shù)和對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差，而后對(duì)經(jīng)對(duì)數(shù)變換后的數(shù)據(jù)采用假設(shè)檢驗(yàn)和區(qū)間估計(jì)等方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷［1-2］。這些方法雖然行之有效，但其結(jié)果表達(dá)方式均為在特定點(diǎn)（如幾何均數(shù)）和較抽象的范圍（如95%可信區(qū)間）表達(dá)其臨床試驗(yàn)結(jié)果，這樣一方面使研究工作者難以從體液免疫原性的整體數(shù)據(jù)變化上（如不同滴度的抗體水平上）把握數(shù)據(jù)的變化趨勢(shì)和分布狀況，另一方面也使非統(tǒng)計(jì)工作者難以理解一些組間比較的假設(shè)檢驗(yàn)結(jié)果。為解決這些問題，Reed、Meade和Steinhoff于1995年提出了逆向累積分布圖（reverse cumulative distribution，RCD）的概念和方法，這一方法因具有結(jié)果表達(dá)直觀、傳達(dá)信息量大等優(yōu)點(diǎn)，一經(jīng)提出就受到了疫苗臨床試驗(yàn)工作者的青睞并在國(guó)外得到了較廣泛的應(yīng)用［3］。然而國(guó)內(nèi)對(duì)此法卻少有介紹，本文將從概念、方法及應(yīng)用實(shí)例上對(duì)這一數(shù)據(jù)表達(dá)方式進(jìn)行介紹。

原理與方法

逆向累積分布圖（以下簡(jiǎn)稱RCD曲線）是用來顯示免疫原性數(shù)據(jù)分布的圖形工具，特別適合于疫苗組間分布的可視性圖形比較。該圖的橫軸為經(jīng)過對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的抗體滴度或濃度，縱軸代表至少有此抗體水平個(gè)體所占百分比。根據(jù)定義，圖中的曲線從100%開始，然后從左到右逐漸下降至0，曲線最低點(diǎn)就是抗體水平最大時(shí)的觀察者比例。逆向累積分布函數(shù)的表達(dá)形式為

式（1）中Rx（x）表示變量X大于等于某一數(shù)值x的概率。而通常的累積分布函數(shù)為

式（2）中Cx（x）表示變量X小于等于其某一數(shù)值x的概率。由此可知，逆向累積分布圖之所以被稱為逆向，是因?yàn)樗抢鄯e分布圖（cumulative distribution plot）的逆轉(zhuǎn)。而正是這一逆轉(zhuǎn)，使得它特別適合于對(duì)疫苗免疫原性數(shù)據(jù)的直觀表達(dá)［4-5］。

與逆向累積分布圖相似的是Kaplan-Meier生存曲線（survival curve），只不過生存曲線多以生存時(shí)間為橫軸、生存率為縱軸，隨著生存時(shí)間的遞增，生存率曲線從1到0逐漸下降，與逆向累積分布圖不同的是它不是一條平滑的曲線，而是階梯狀逐漸下降的圖形［2］。

繪制RCD曲線時(shí)，首先要根據(jù)每一抗體水平在y軸上找出至少有此抗體水平個(gè)體所占的百分比，然后將這些點(diǎn)用折線連接起來。第一個(gè)繪制的點(diǎn)通常表示在最低抗體水平下個(gè)體所占的百分比，一般為100%。曲線從左至右，x值越來越大，y值越來越小，最后會(huì)無限接近于0。利用RCD曲線可以估計(jì)各種百分位數(shù)，如求第50分位數(shù)所對(duì)應(yīng)的抗體滴度對(duì)數(shù)值，就可在y軸上找到50%，畫一條水平線與曲線相交，然后再找出交點(diǎn)所對(duì)應(yīng)x軸上的值，就是所求值，即中位抗體滴度的對(duì)數(shù)值。另外，通過已知x值也可求得y值，這一般用于已知保護(hù)水平或最低檢測(cè)限估計(jì)觀察對(duì)象所占的累積百分比［3］。

圖1給出了四條頗具代表性的RCD曲線。大部分RCD曲線是倒S型，如曲線D，直到在x軸上到達(dá)某一數(shù)值時(shí)迅速下降至最小值。曲線A呈現(xiàn)近似直角形，開始保持高且平坦，直到一個(gè)在橫軸上達(dá)到較大數(shù)值時(shí)迅速下降至最小值，表示抗體水平較高者所占比例較大。如果曲線以一條相對(duì)直的斜線降到x軸如曲線C，說明抗體滴度的變異較大。曲線的陡峭程度反映了觀察值的伸展程度和變異性。中部和尾部一樣陡，說明較少的變異，而此時(shí)曲線C比較淺的中部表示較大的伸展性和變異性。在極端的例子中，RCD曲線以垂直的曲線結(jié)束，說明數(shù)據(jù)集中，幾乎沒有變異，所有余下的數(shù)據(jù)都相等［3］。曲線B比曲線C陡峭，但是又不及曲線D，表示其變異性比曲線D大，但又小于曲線C。曲線B和曲線C相交，兩者有一個(gè)相同的百分位值，如圖1中，該點(diǎn)為當(dāng)抗體滴度對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換值為6時(shí)，累積頻率百分比為40%，在小于抗體水平6時(shí)，B組更占優(yōu)勢(shì)，但是超過6時(shí)，C組就更占優(yōu)勢(shì)了。

圖1 逆向累積分布圖

實(shí)例分析

我們以腸道病毒71型滅活疫苗（Vero細(xì)胞）做試驗(yàn)組和安慰劑做對(duì)照組進(jìn)行的III期臨床試驗(yàn)為例說明RCD曲線和目前通用的統(tǒng)計(jì)描述和統(tǒng)計(jì)推斷方法相結(jié)合，以提高統(tǒng)計(jì)結(jié)果形象化和增加數(shù)據(jù)信息量之效果。研究人群按發(fā)病特征分成6～11月齡和12～35月齡兩層。

從表1我們可以看出在腸道病毒71型（EV71）疫苗組免疫前后經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)t＝60.92，P＜0.0001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以可認(rèn)為試驗(yàn)組疫苗在免疫前后抗體水平不同，提示EV71疫苗對(duì)健康人群可能有保護(hù)作用；安慰劑組經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)t＝-2.34，P＝ 0.0194，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以安慰劑組在免疫前后抗體水平也不同。從表1我們還可以看出免疫前EV71疫苗組和安慰劑組經(jīng)過兩樣本t檢驗(yàn)t＝-0.51，P＝0.6103，P＞0.05，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以尚不能認(rèn)為在免疫前后兩組疫苗的受試者抗體水平不同；免疫后EV71疫苗組和安慰劑組同樣經(jīng)過兩樣本t檢驗(yàn)t＝30.73，P＜0.0001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以可以認(rèn)為在免疫前后兩組疫苗的受試者抗體水平不同。面對(duì)上述統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，有時(shí)難以使人一下子得到試驗(yàn)疫苗是否有效的清晰結(jié)論。此時(shí)借助RCD曲線（圖2）不但可增加統(tǒng)計(jì)結(jié)果的直觀性，方便理解，而且可有效把握數(shù)據(jù)的變化趨勢(shì)和分布狀況。由圖2可知，免疫前試驗(yàn)組和免疫前后安慰劑組的曲線，在抗體水平較小時(shí)就迅速下降，說明試驗(yàn)組免疫前以及安慰劑組免疫前后抗體水平都較低，而免疫后試驗(yàn)組曲線開始保持高而且平坦，直到達(dá)到一個(gè)在橫軸上較大數(shù)值時(shí)才下降，表示試驗(yàn)組免疫后抗體水平較高者所占比例較大，安慰劑組免疫前后抗體水平變化不大，這也說明了雖然安慰劑組統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果有意義（P＝0.0194），但是實(shí)際意義不大，從而從實(shí)際角度直觀地解釋了表1中一系列（4個(gè)）假設(shè)檢驗(yàn)結(jié)果的實(shí)際意義。

表1 兩試驗(yàn)組抗體滴度免疫前后結(jié)果比較

圖2 不同組別抗體滴度逆向累積分布圖

隨著分組數(shù)的增加，假設(shè)檢驗(yàn)的數(shù)量也成倍增長(zhǎng)，對(duì)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果的綜合分析和判斷也更趨抽象，此時(shí)RCD曲線的優(yōu)勢(shì)則更為明顯。如在本次試驗(yàn)中每組疫苗又分成兩個(gè)年齡層，為得出試驗(yàn)結(jié)論，需要在八個(gè)組中進(jìn)行比較。從表2我們可以看出免疫前兩個(gè)年齡組6～11月齡和12～35月齡中試驗(yàn)組和安慰劑組P值分別0.4696和0.7641，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫后兩個(gè)年齡組中試驗(yàn)組和安慰劑組P值都小于0.0001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在6～11月齡中EV71疫苗組免疫前后經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)t＝-36.31，P＜0.0001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以可認(rèn)為6～11月齡試驗(yàn)組疫苗在免疫前后抗體水平不同，安慰劑組免疫前后配對(duì)t檢驗(yàn)t＝0.32，P＝0.7458，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以尚不能認(rèn)為6～11月齡安慰劑組在免疫前后抗體水平不同；在12～35月齡中EV71疫苗組免疫前后經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)t＝-50.31，P＜0.0001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以可認(rèn)為12～35月齡試驗(yàn)組疫苗在免疫前后抗體水平不同，安慰劑組免疫前后配對(duì)t檢驗(yàn)t＝-2.59，P＝0.0099，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以12～35月齡安慰劑組在免疫前后抗體水平也不同。

表2 不同年齡層兩試驗(yàn)組抗體滴度結(jié)果比較

圖3 不同組別不同年齡層抗體滴度逆向累積分布圖

圖3描述的是兩組疫苗兩個(gè)年齡層在免疫接種前后抗體滴度的RCD曲線圖，經(jīng)過觀察我們可以明顯看出免疫后試驗(yàn)組12～35月齡和6～11月齡的曲線（曲線P和Q）形狀與位置與其他曲線不同，其他曲線在抗體滴度較小時(shí)就迅速下降，而曲線P和Q開始保持高而平坦，在抗體滴度較大時(shí)才開始下降，說明兩個(gè)年齡組免疫后EV71疫苗組較高抗體水平者比例較大。同時(shí)曲線N、J和M有著多處交叉，三者總體的形狀和位置基本一樣，說明6～11月齡受試者在接種前試驗(yàn)組和對(duì)照組抗體水平無差異，并且接種了安慰劑之后抗體水平未見變化。同樣的情況也發(fā)生在曲線I、X和Y中，表示12～35月齡與6～11月齡組結(jié)果基本相似，雖然接種了安慰劑之后統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果顯示抗體水平有變化（t＝2.59，P＝0.0099），但從圖3可見，其變化幅度較小，提示其實(shí)際意義有限。所以通過解讀圖3，我們發(fā)現(xiàn)RCD曲線圖不僅可以直觀地解釋表2中一系列（8個(gè)）假設(shè)檢驗(yàn)結(jié)果的意義，讓非統(tǒng)計(jì)人員更容易理解，而且還能形象說明統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果的實(shí)際意義。

討 論

本文介紹了逆向累積分布圖的概念、制作方法及其在疫苗III期臨床試驗(yàn)中的應(yīng)用。我們可以看出逆向累積分布圖不僅增大了信息量，結(jié)果直觀，而且具有繪制簡(jiǎn)單、易于非統(tǒng)計(jì)人員理解的優(yōu)點(diǎn)，特別適合對(duì)疫苗免疫原性數(shù)據(jù)的表達(dá)。在繪制過程中需要注意的是，曲線上的點(diǎn)表示的是至少有此抗體水平個(gè)體所占的百分比，所以計(jì)算方法是先通過每一個(gè)抗體水平個(gè)體所占百分比計(jì)算出正向累積百分比，然后再算出其逆向累積百分比繪制圖形。另外，逆向累積分布圖不能提供準(zhǔn)確數(shù)據(jù)信息，因此需要和相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)和假設(shè)檢驗(yàn)方法同時(shí)使用，而這些信息常通過統(tǒng)計(jì)表的形式表達(dá)。通過圖表結(jié)合，我們不僅可以準(zhǔn)確的表達(dá)數(shù)據(jù)信息，而且可以使一些抽象的統(tǒng)計(jì)結(jié)果直觀化，有利于我們從整體上把握數(shù)據(jù)蘊(yùn)含的信息。建議在免疫原性數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表達(dá)中將傳統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)描述和統(tǒng)計(jì)假設(shè)檢驗(yàn)與RCD曲線圖示法相結(jié)合，以取得相互補(bǔ)充、相得益彰之效果。

1.方積乾.衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué).第6版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.

2.孫振球.醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué).第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010.

3.Reed GF，Meade BD，Steinhoff MC.The reverse cumulative distribution plot：A graphicmethod for exploratory analysis of antibody data.Pediatrics，1995：600-603.Jozef Nauta.Statistics in Clinical Vaccine Trials. New York：Springer，2010：19-52.

4.Edward KM，Meade BD，Decker MD，et al.Comparison of 13 acellular pertussis vaccines：overview and serologic response.Pediatrics.1995：548-557.

5.Horne AD.The Statistical Analysis of Immunognicity Data in Vaccine atials.New York：Annals of the New York Academy of Sciences，2006：2211-2215.

（責(zé)任編輯：丁海龍）

△通信作者：劉沛