CuSO4對(duì)阿爾茨海默病模型行為學(xué)和病理學(xué)的影響

周美琴，何遠(yuǎn)宏，余 列，李 魁，王 楠

銅(Cu)和AD 的關(guān)系目前暫不清楚。一些研究提示銅可以影響β 淀粉樣前體蛋白(APP)的轉(zhuǎn)運(yùn)、釋放以及重新分布，并促進(jìn)細(xì)胞表面APP 水平的增高;但另有研究認(rèn)為Cu 對(duì)腦脊液中tau 蛋白及磷酸化tau 蛋白無(wú)明顯影響，不但能夠降低Aβ 的含量［1］，患者腦脊液中β 淀粉樣蛋白(Aβ)的濃度還與Cu 水平呈負(fù)相關(guān)［2］。AD 患者血漿Cu 濃度較正常均明顯增高，但是輕度與中重度AD 患者之間的Cu 濃度無(wú)顯著差異，且AD 患者的認(rèn)知功能與Cu無(wú)相關(guān)性［3］。因此，AD 患者腦內(nèi)Cu 是缺乏還是過(guò)量一直存在爭(zhēng)議，有必要設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討銅與AD 的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF 級(jí)健康雄性成年大鼠，體重平均(250 ±20)g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào):SCXK(豫)2010～0002)經(jīng)水迷宮淘汰有記憶障礙的大鼠后隨機(jī)分為6 組:正常組、PBS 組、AD 模型組、低、中、高劑量CuSO4組，每組6 只，共72 只。

1.1.2 主要試劑及儀器 Tau 蛋白抗體及GSK-3β 抗體(美國(guó)Santa 公司)，Aβ1-42(北京博奧森公司;HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG，HRP 羊抗雞IgG(自上海生工)，水迷宮系統(tǒng)(SLY-WMS 北京碩林苑科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 制備AD 模型，水合氯醛腹腔麻醉后固定，參考Paxinos 和Watson 大鼠腦立體定位圖譜［4］確定進(jìn)針部位(3.8 mm(A/P)、2.5 mm(L/R)、3 mm(H)，兩側(cè)各注射質(zhì)量濃度為2 μg/μl的Aβ1-425 μl，(Aβ1-42粉劑溶于無(wú)菌生理鹽水，于37 ℃水浴鍋中孵育36 h，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài))，留針6 min，使藥物充分進(jìn)入局部組織。PBS 組注射5 μl的無(wú)菌PBS，低中高劑量CuSO4組在造AD 模型成功后，坐標(biāo)參照包新明［5］確定側(cè)腦室坐標(biāo)(1.5 mm(A)、1.5 mm(L/R)、3.5 mm(H)注入無(wú)菌CuSO4溶液(劑量分別是:1 mg/kg、3 mg/kg、5 mg/kg)，術(shù)后青霉素抗感染。

1.2.2 Morris 水迷宮行為學(xué)檢測(cè) 在術(shù)后第9天進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，(1)定位航行實(shí)驗(yàn)(place navigation)共4 d，每只大鼠4 次/d，將大鼠隨機(jī)從4 個(gè)象限面向池壁放入水中，大鼠爬上平臺(tái)所用的時(shí)間記為逃避潛伏期，如果大鼠在120 s 未爬上平臺(tái)，潛伏期則記錄為120 s;(2)空間探索實(shí)驗(yàn)(spatial probe)第5 天撤除平臺(tái)，隨機(jī)選取一個(gè)象限放入大鼠，觀察在其原平臺(tái)象限穿越次數(shù)及停留時(shí)間比，數(shù)據(jù)由Morris 水迷宮自動(dòng)監(jiān)視系統(tǒng)處理并完成。

1.2.3 病理染色觀察神經(jīng)元凋亡情況 (1)尼氏染色:術(shù)后第14 天大鼠麻醉后灌注取全腦，梯度蔗糖脫水固定，包埋，切邊的部位:冠狀切至視交叉到乳頭體之間的腦片，厚度20 μm，酒精脫脂，水洗，入尼氏染色液染色，鏡下觀察染色時(shí)間，尼氏小體清晰背景淺即終止反應(yīng)。蒸餾水洗，甩干，鹽酸乙醇分化，脫水，晾干，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。鏡下射片觀察，分析計(jì)數(shù)。(2)HE 染色:取材同尼氏染色，冰凍切片水洗，Harris 蘇木素染色，水洗，鹽酸乙醇分化，水洗，促藍(lán)液返藍(lán)，沖洗，伊紅染色，鏡下觀察顏色變化控制染色時(shí)間，水洗，脫水二甲苯透明，晾干，封片。鏡下射片觀察。

1.2.4 Western blot 測(cè)定GSK-3β 及tau 蛋白的表達(dá) 術(shù)后14 d 大鼠斷頭，取CuSO4注射側(cè)腦組織，勻漿，裂解，離心，取上清，加入上樣緩沖液，沸水煮5 min。測(cè)蛋白濃度，調(diào)至濃度一致，-80 ℃凍存待用，制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，上樣電泳，半干轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉，加入鼠抗GSK-3β抗體(1∶ 500)、非磷酸化兔抗tau 抗體(1∶ 500)，4 ℃孵育過(guò)夜。PBST 洗膜，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶ 5000)或山羊抗小鼠二抗(1∶ 5000)，室溫下孵育2 h。洗膜后加入ECL 發(fā)光液，在Chemi scope Mini 系統(tǒng)中掃描成像，并用成像分析系統(tǒng)對(duì)各蛋白條帶及內(nèi)參條帶進(jìn)行灰度掃描，獲得光密度(OD)值，兩者比值作為該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，做計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)成績(jī) 正常組和PBS 組比較，AD 模型組大鼠的逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)象限次數(shù)減少，平臺(tái)象限停留時(shí)間縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。各CuSO4處理組與AD 模型組比較，逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)象限次數(shù)減少，平臺(tái)象限停留時(shí)間縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。隨著CuSO4注射劑量的增加，潛伏期延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少，平臺(tái)象限停留時(shí)間進(jìn)一步縮短(P ＜0.05)。具體數(shù)據(jù)(見(jiàn)表1)。

2.2 病理染色 HE 染色結(jié)果:與正常組及PBS 組比較，AD 模型組海馬區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)目明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，CuSO4處理進(jìn)一步減少了錐體細(xì)胞數(shù)目(P ＜0.05)，隨著CuSO4注射劑量的增加，錐體細(xì)胞數(shù)目減少進(jìn)一步加劇(P ＜0.05)，具體數(shù)據(jù)(見(jiàn)表2)。

2.3 GSK-3β 及總tau 蛋白表達(dá)情況 與正常組和PBS 組比較，AD 模型組GSK-3β 及總tau 蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P ＜0.05)。3 組CuSO4處理組較AD 模型組兩種蛋白表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。隨著CuSO4注射劑量的增加，GSK-3β 及總tau 蛋白的表達(dá)量進(jìn)一步上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。尼氏染色結(jié)果比較及分析:正常組和假手術(shù)組大鼠的海馬錐體細(xì)胞胞漿內(nèi)尼氏體豐富，細(xì)胞排列整齊;AD 模型組大鼠的海馬錐體細(xì)胞胞漿內(nèi)尼氏體減少或缺如，核固縮深染，海馬錐體細(xì)胞喪失明顯，表明有大量的海馬錐體細(xì)胞凋亡。3 組CuSO4處理組大鼠海馬錐體細(xì)胞中尼氏體丟失嚴(yán)重，細(xì)胞核固縮深染，與AD 模型組大鼠相比，錐體細(xì)胞凋亡明顯(見(jiàn)表3)。

表1 各組水迷宮檢測(cè)成績(jī)比較()

表1 各組水迷宮檢測(cè)成績(jī)比較()

與正常組和PBS 組比較▽P ＜0.05;與模型組比較△P ＜0.05;與低劑量CuSO4組比較#P ＜0.05;與高劑量CuSO4組比較* P ＜0.05

表2 實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬CA3區(qū)每高倍鏡下正常錐體細(xì)胞數(shù)

表3 各組GSK-3β 及總tau 蛋白表達(dá)情況

3 討論

在本試驗(yàn)中，我們采用海馬注射Aβ 的方法建立AD 模型。Aβ 在海馬細(xì)胞的異常沉積是AD 的主要病理特征，與AD 的發(fā)病機(jī)制有著重要關(guān)系［6］，用Aβ 做AD 模型［7］能很好的模擬AD 的特點(diǎn)，此方法較成熟可靠，雖然轉(zhuǎn)基因鼠已經(jīng)問(wèn)世，國(guó)內(nèi)外也有APP、APP/PS1、SAMP8 等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用，其培育難、死亡率高、價(jià)格昂貴等特點(diǎn)，且不能囊括散發(fā)型等其他類(lèi)型的AD 模型，因此成為大量應(yīng)于基礎(chǔ)研究的羈絆。

為此進(jìn)一步探索Cu 與AD 的關(guān)系，我們采用Morris 設(shè)計(jì)的水迷宮檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。逃避潛伏期代表了大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間，反映了學(xué)習(xí)能力;原平臺(tái)象限停留時(shí)間比代表撤去平臺(tái)后大鼠在原平臺(tái)所在象限活動(dòng)的時(shí)間和原平臺(tái)跨越次數(shù)共同代表反映了短期記憶能力。Tau 蛋白具有促進(jìn)微管蛋白聚合成微管、防止其解聚和維持微管功能穩(wěn)定的作用，當(dāng)tau 蛋白被過(guò)度磷酸化、異常糖基化或泛素化時(shí)，就會(huì)喪失促微管組裝的生物活性，同時(shí)對(duì)蛋白水解酶的抗性增加，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，從而導(dǎo)致神經(jīng)退行性變和神經(jīng)纖維纏結(jié)的的形成。而神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成與AD 患者的認(rèn)知功能障礙呈明顯的正相關(guān)［8］，AD 患者血清tau 蛋白及磷酸化tau 蛋白濃度的異常情況與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)［9］，糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)，是磷酸化tau 蛋白的主要激酶，不僅能使tau 蛋白磷酸化使其具有更強(qiáng)的成纖維特性，而且可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡［10］，因此我們檢測(cè)GSK-3β 和tau 蛋白的表達(dá)，以及利用病理染色觀察Cu 處理對(duì)大鼠的影響。

研究結(jié)果顯示，AD 模型組的大鼠較正常組和PBS 組學(xué)習(xí)記憶能力下降，海馬神經(jīng)元凋亡較嚴(yán)重，說(shuō)明AD 模型建立是成功的。3 組CuSO4組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力較AD 模型組顯著下降，且隨注射劑量的增加，大鼠的學(xué)習(xí)能力越差，細(xì)胞凋亡越嚴(yán)重。GSK-3β 和tau 表達(dá)方面，CuSO4組較AD 模型組增加，且隨著CuSO4劑量的增加，GSK-3β 和tau 表達(dá)也增強(qiáng)。研究證實(shí)了高濃度Cu 對(duì)AD 大鼠的學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生損害，導(dǎo)致行為學(xué)變化，高濃度的Cu 可以對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致神經(jīng)元變性及凋亡，可以誘導(dǎo)GSK-3β 和tau 蛋白的表達(dá)，我們推測(cè)CuSO4可能是通過(guò)某種通路誘導(dǎo)了GSK-3β 和tau 蛋白的表達(dá)而使大鼠出現(xiàn)行為學(xué)的變化及病理學(xué)的變化，另外CuSO4溶液的注射導(dǎo)致腦脊液中的SO42-集聚上升，是否會(huì)大鼠的神經(jīng)功能有影響，需要進(jìn)一步探索。

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