脂聯(lián)素受體1結(jié)合蛋白表達(dá)抑制對(duì)脂聯(lián)素抗小鼠心肌缺血／再灌注損傷作用的影響

王 正，金振曉，易 蔚，易定華

·基礎(chǔ)研究·

脂聯(lián)素受體1結(jié)合蛋白表達(dá)抑制對(duì)脂聯(lián)素抗小鼠心肌缺血／再灌注損傷作用的影響

王 正，金振曉，易 蔚，易定華

目的 觀(guān)察脂聯(lián)素（APN）受體1結(jié)合蛋白（APPL1）表達(dá)抑制對(duì)APN抗小鼠心肌缺血／再灌注（MI／R）保護(hù)作用的影響。方法 采用小鼠在體MI／R動(dòng)物模型，APPL1表達(dá)抑制采用心肌內(nèi)注射特異性小干擾RNA（APPL1 SiRNA）1 μg／g體重方法實(shí)現(xiàn)，再灌注前10 min經(jīng)腹腔注射給予APN蛋白球狀片段（gAPN）2 μg／g體重或等量生理鹽水。70只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組（Control），MI／R＋Scramble SiRNA（無(wú)關(guān)對(duì)照SiRNA）組，MI／R＋APPL1 SiRNA組，MI／R＋Scramble SiRNA＋gAPN組，MI／R＋APPL1 SiRNA＋gAPN組。再灌注3 h后（n＝6），取心肌組織進(jìn)行Western Blot分析APPL1含量，再灌注24 h后（n＝8）對(duì)小鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖心功能檢測(cè)和心肌梗死面積測(cè)定。結(jié)果 再灌注3 h后，APPL1 SiRNA注射小鼠的心肌組織中APLL1表達(dá)量較Control組及無(wú)關(guān)對(duì)照SiRNA組注射小鼠明顯降低（P＜0.01）。MI／R＋APPL1 SiRNA組與MI／R＋Scramble SiRNA組比較，左室射血分?jǐn)?shù)和心肌梗死面積無(wú)顯著差異。與MI／R＋Scramble SiRNA組相比，MI／R＋Scramble SiRNA＋gAPN組和MI／R＋APPL1 SiRNA＋gAPN組的左室射血分?jǐn)?shù)明顯升高（P＜0.01），心肌梗死面積明顯降低（P＜0.01）。與MI／R＋Scram?ble SiRNA＋gAPN組相比，MI／R＋APPL1 SiRNA＋gAPN組的左室射血分?jǐn)?shù)明顯降低（P＜0.01），心肌梗死面積明顯增加（P＜0.01）。結(jié)論 APPL1表達(dá)抑制可導(dǎo)致APN抗小鼠MI／R損傷保護(hù)作用的明顯減弱。

心肌保護(hù)；脂聯(lián)素；缺血／再灌注損傷；APPL1

脂聯(lián)素（Adiponectin，APN）是一種主要由脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)代謝、血管內(nèi)皮保護(hù)、抗炎癥反應(yīng)、以及抗心肌缺血／再灌注（myocar?dia ischemic／reperfusion，MI／R）損傷等多種生物學(xué)功能［1－2］。APN蛋白球狀片段（globular domain of Adiponectin，gAPN）是 APN的蛋白酶裂解產(chǎn)物。gAPN是APN主要的活性區(qū)域，在心肌保護(hù)、調(diào)節(jié)糖、脂代謝等方面具有比全長(zhǎng)型APN更強(qiáng)的生物學(xué)作用［3］。APN的受體主要包括 APN受體 1（AdipoR1）、APN受體2（AdipoR2）、T－鈣粘蛋白（TCadherin）等，其中AdipoR1是心肌細(xì)胞中APN的主要受體，脂聯(lián)素受體結(jié)合蛋白（adaptor protein contai?ning PH domain，PTB domainand leucine zipper motif1，APPL1）是AdipoR1的一個(gè)關(guān)鍵結(jié)合蛋白［4－5］。AP?PL1通過(guò)與AdipoR1的蛋白－蛋白相互作用，介導(dǎo)了APN在多種細(xì)胞內(nèi)的多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［6－7］。而關(guān)于A(yíng)PPL1和AdipoR1的相互作用是否參與調(diào)節(jié)APN的抗MI／R損傷保護(hù)作用，尚未見(jiàn)報(bào)道。心肌內(nèi)注射APPL1特異性小干擾RNA（APPL1 SiRNA）可以顯著降低心肌APPL1的表達(dá)，繼而使APPL1和AdipoR1的相互作用減弱。超聲心動(dòng)圖左室射血分?jǐn)?shù)（Left ventricular ejection fraction，LVEF）可以反映心功能的改變，心肌梗死面積可以反映心肌損傷程度。本研究將以小鼠在體心肌缺血／再灌注（myocardial ischemi?a／reperfusion，MI／R）模型為研究對(duì)象，探討APPL1表達(dá)抑制狀態(tài)下APN抗MI／R損傷保護(hù)作用的變化。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 成年雄性C57BL／6J小鼠（8～10 w），由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑和儀器 異氟烷（魯南貝特制藥有限公司，中國(guó)），gAPN（Sigma，美國(guó)），伊文氏藍(lán)（Sigma，美國(guó)），2，3，5－三苯基氯化四氮唑，TTC（Sigma，美國(guó)）。SiRNA及相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑均從Invitrogen公司（美國(guó)）購(gòu)得，小鼠特異性APPL1 SiRNA序列：AA?GAGTGGATCTGTACAATAA；小鼠無(wú)相關(guān)對(duì)照（Scramble）SiRNA序列：AATATTATTAAGGCGA?CAGAG。吸入麻醉機(jī)（Matrx，美國(guó)）。Visualson?icVevo 2100高分辨率小動(dòng)物在體超聲成像系統(tǒng)（Visualsonic，美國(guó)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 70只小鼠隨機(jī)分為5組，假手術(shù)組（Control），MI／R＋ScrambleSiRNA（無(wú)關(guān)對(duì)照SiRNA）組，MI／R＋APPL1 SiRNA組，MI／R＋ScrambleSiRNA＋gAPN組，MI／R＋APPL1 SiRNA＋gAPN組，每組14只。每組隨機(jī)取出6只小鼠，作為MI／R 3 h組，進(jìn)行蛋白分析（n＝6）。每組剩下的8只小鼠作為MI／R 24 h組，進(jìn)行超聲心動(dòng)圖心功能檢測(cè)（n＝8）和心肌梗死面積檢測(cè)（n＝8）。

1.4 小鼠在體MI／R模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)文獻(xiàn)所述［8］，2%異氟烷麻醉小鼠，通過(guò)左胸廓手術(shù)將心臟暴露于第五肋間隙，三點(diǎn)式心肌內(nèi)注射APPL1 SiRNA（15 μl；1 μg／g體重）和 Scramble SiRNA（15 μl；1 μg／g體重）。SiRNA注射48 h后用2%異氟烷麻醉小鼠，通過(guò)左胸廓切口再次暴露心臟，用6－0手術(shù)線(xiàn)在冠脈左前降支距根部2～3 mm處打一活結(jié)造成心肌缺血，缺血20 min時(shí)，經(jīng)小鼠腹腔注射gAPN（2 μg／g體重）或等量生理鹽水，缺血30 min時(shí)，通過(guò)留在切口外的線(xiàn)頭松開(kāi)結(jié)扎線(xiàn)，造成心肌再灌注。心肌再灌注時(shí)間為3 h或24 h，3 h組進(jìn)行蛋白分析，24 h組進(jìn)行心臟功能和心肌梗死面積的測(cè)定。假手術(shù)組小鼠經(jīng)過(guò)相同的手術(shù)過(guò)程，只是不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈。

1.5 小鼠超聲心動(dòng)圖測(cè)定LVEF 小鼠MI／R 24 h后，用2%異氟烷麻醉，應(yīng)用Visualsonicvevo 770高分辨率在體超聲成像系統(tǒng)，記錄小鼠超聲心動(dòng)圖，LVEF。

1.6 伊文氏藍(lán)／TTC染色法檢測(cè)心肌梗死面積 根據(jù)文獻(xiàn)所述［9］，小鼠MI／R 24 h后，再次原位結(jié)扎冠脈，伊文氏藍(lán)顏料（2%）注入主動(dòng)脈內(nèi)，非藍(lán)色染區(qū)為缺血區(qū)域（areaatrisk，AAR），藍(lán)色者為正常灌注區(qū)域。摘取整個(gè)心臟，濾紙吸除多余染料，將左心室從心尖部位開(kāi)始向上切為1～2 mm厚切片。切片用1%的2，3，5－三苯基氯化四氮唑（2，3，5－tripheny?ltetrazolium chloride，TTC）磷酸鹽緩沖液在37℃孵箱中孵育20 min。TTC紅染區(qū)為缺血但仍存活組織，蒼白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ佬募。↖nfarction area，INF）。每層切片前后均拍照片，使用Image Pro Plus圖像軟件分析照片不同區(qū)域面積大小，每層切片兩邊的區(qū)域面積取平均值，心肌梗死范圍以每一心臟總INF占總?cè)毖獏^(qū)（AAR）的百分比表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Prism統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，比較二組間差異用LSD－t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 心肌蛋白Western Blot分析 為了研究APPL1表達(dá)抑制對(duì)APN抗MI／R損傷保護(hù)作用的影響，筆者通過(guò)心肌點(diǎn)注射APPL1 SiRNA來(lái)抑制小鼠心肌APPL1的表達(dá)。Western Blot檢驗(yàn)結(jié)果顯示，MI／R＋APPL1 SiRNA組和MI／R＋APPL1 SiRNA＋gAPN組的小鼠心肌組織中APPL1表達(dá)量較Control組和無(wú)關(guān)SiRNA組顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖1。

圖1 Western Blot檢測(cè)各組小鼠心肌中APPL1的表達(dá)量

2.2 超聲心動(dòng)圖心功能測(cè)定 MI／R＋APPL1 SiR?NA組與MI／R＋Scramble SiRNA組比較，LVEF無(wú)顯著差異。MI／R＋Scramble SiRNA＋gAPN組的LVEF值明顯高于MI／R＋Scramble SiRNA組和MI／R＋AP?PL1 SiRNA組（P＜0.01），而MI／R＋APPL1 SiRNA＋gAPN組的LVEF值雖然高于MI／R＋Scramble SiRNA組和MI／R＋APPL1 SiRNA組（P＜0.05），卻明顯低于MI／R＋Scramble SiRNA＋gAPN組（P＜0.01）見(jiàn)圖2。

圖2 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組LVEF值

2.3 心肌梗死面積的測(cè)定 MI／R＋APPL1 SiRNA組與MI／R＋ScrambleSiRNA組比較，心肌梗死面積無(wú)顯著差異。MI／R＋Scramble SiRNA＋gAPN組和MI／R＋APPL1 SiRNA＋gAPN組小鼠的心肌梗死面積明顯小于MI／R＋Scramble SiRNA組和MI／R＋APPL1 SiRNA組（P＜0.01），而 MI／R＋APPL1 SiRNA＋gAPN組的心肌梗死面積明顯大于MI／R＋Scramble?SiRNA＋gAPN組（P＜0.01）見(jiàn)圖3。

圖3 伊文氏藍(lán)／TTC染色檢測(cè)心肌梗死面積

3 討 論

APN是一種在循環(huán)系統(tǒng)中大量存在的脂肪細(xì)胞因子，具有顯著的抗MI／R損傷功能［1－2］。其主要通過(guò)兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑保護(hù)心?。阂粭l是腺通過(guò)苷酸活化蛋白激酶（AMP－activated protein kinase，AMPK）途徑啟動(dòng)心肌細(xì)胞抗凋亡機(jī)制；另一條是通過(guò)非AMPK依賴(lài)的抗硝基化／抗過(guò)氧化途徑，顯著降低MI／R產(chǎn)生的心肌毒性極高的過(guò)氧亞硝酸基陰離子（Peroxynitrite，ONOO－）［10－11］。

AdipoR1是心肌細(xì)胞中APN的主要受體，AP?PL1是首個(gè)被證明可與AdipoR1發(fā)生蛋白－蛋白相互作用的轉(zhuǎn)接分子，其PTB結(jié)構(gòu)域（phosphotyrosine－binding，磷酸酪氨酸結(jié)合域）可直接與AdipoR1的胞內(nèi)段結(jié)合［7］。多項(xiàng)研究表明APPL1通過(guò)與Adi?poR1的蛋白－蛋白相互作用，介導(dǎo)了APN在多種細(xì)胞內(nèi)的多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括AMPK激活的抗凋亡作用［7，12－13］，而在體動(dòng)物模型中關(guān)于A(yíng)PPL1是否參與調(diào)節(jié)APN的抗MI／R損傷作用尚未得到驗(yàn)證。

為了研究APPL1對(duì)APN心肌保護(hù)作用的影響，筆者采用心肌3點(diǎn)式注射APPL1 SiRNA抑制APPL1的表達(dá)，Western Blot結(jié)果顯示，注射APPL1 SiRNA的兩組APPL1表達(dá)水平明顯降低（圖1）。超聲心動(dòng)圖和伊文氏藍(lán)／TTC染色結(jié)果顯示，MI／R＋Scramble SiRNA組和MI／R＋APPL1 SiRNA組無(wú)顯著差異（圖2，3），這難道說(shuō)明APPL1的抑制對(duì)內(nèi)源性APN的心肌保護(hù)作用沒(méi)有影響嗎？分析其中的原因，筆者認(rèn)為有以下幾種可能：① 在急性MI／R損傷的情況下內(nèi)源性APN的表達(dá)水平降低［14］，在沒(méi)有外源性給予大劑量APN的情況下降低APPL1的表達(dá)，對(duì)于內(nèi)源性小劑量APN的心肌保護(hù)作用影響不明顯；② 內(nèi)源性小劑量的APN可能通過(guò)AP?PL1以外的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮了作用［15］；③ 這種情況下，可能還存在其他的內(nèi)源性心肌保護(hù)分子代償了小劑量APN作用的缺失。內(nèi)源性的fAPN（全長(zhǎng)APN）比gAPN（APN球狀片段）濃度高很多，而在生理作用方面fAPN遠(yuǎn)不如gAPN［16］，這也是筆者外源性給予gAPN的原因。

再灌注前10 min給予較大劑量gAPN 2 μg／g腹腔注射顯著減弱了小鼠MI／R損傷，超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示心臟功能得到改善（圖2），伊文氏藍(lán)／TTC染色結(jié)果顯示心肌梗死面積顯著減少（圖3）。盡管在A(yíng)PPL1表達(dá)抑制組中，APN的心肌保護(hù)作用還部分存在（圖2，3），但相對(duì)于無(wú)關(guān)對(duì)照SiRNA組，AP?PL1表達(dá)抑制組中APN的心肌保護(hù)作用明顯降低（圖2，3）。

本研究結(jié)果顯示，在A(yíng)PPL1表達(dá)抑制的情況下，APN抗MI／R損傷作用減弱，表現(xiàn)為心臟LVEF的下降和心肌梗死面積的增加。由此可以推斷，APPL1與AdipoR1的蛋白－蛋白相互作用很可能是APN在心肌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要機(jī)制。對(duì)此，筆者將繼續(xù)明確在急性MI／R損傷過(guò)程中，APPL1與AdipoR1蛋白－蛋白相互作用的變化，并探索APPL1參與調(diào)節(jié)APN抗MI／R損傷的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本研究為APPL1參與調(diào)控APN的抗MI／R損傷過(guò)程提供了理論依據(jù)，為進(jìn)一步明確APN心肌保護(hù)的機(jī)制提供了新的思路，對(duì)于尋找心肌保護(hù)的新靶點(diǎn)有著重要意義。

［1］ Chandran M，Phillips SA，Ciaraldi T，et al.Adiponectin：more than just another fat cell hormone［J］.Diabetes Care，2003，26（8）：2442－2450.

［2］ ShehzadA，Iqbal W，Shehzad O，et al.Adiponectin：regulation of its production and its role in human diseases［J］.Hormones（Athens），2012，11（1）：8－20.

［3］ Tomas E，Tsao TS，Saha AK，et al.Enhanced muscle fat oxida?tion and glucose transport by acrp30 globular domain：Acetyl－coa carboxylase inhibition and amp－activated protein kinase activation［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99（25）：16309－16313.

［4］ Yamauchi T，Iwabu M，Okada－Iwabu M，et al.Adiponectin re?ceptors：A review of their structure，function and how they work［J］.Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2014，28（1）：15－23.

［5］ Yamauchi T，Kamon J，Ito Y，et al.Cloning of adiponectin re?ceptors that mediate antidiabetic metabolic effects［J］.Nature，2003，423（6941）：762－769.

［6］ Mao X，Kikani CK，Riojas RA，et al.APPL1 binds to adiponec?tin receptors and mediates adiponectin signalling and function［J］.Nat Cell Biol，2006，8（5）：516－523.

［7］ Fang X，Palanivel R，Cresser J，et al.An APPL1－AMPK signa?ling axis mediates beneficial metabolic effects of adiponectin in the heart［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2010，299（5）：E721－729.

［8］ Gao E，Lei YH，Shang X，et al.A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse［J］.Circ Res，2010，107（12）：1445－1453.

［9］ 馬國(guó)川，夏焱，羅向陽(yáng)，等.糖尿病大鼠生存信號(hào)改變對(duì)缺血再灌注損傷及心肌細(xì)胞凋亡的影響［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版）.2006；27（5）：510－514.

［10］ Tao L，Gao E，Jiao X，et al.Adiponectin cardioprotection after myocardial ischemia／reperfusion involves the reduction of oxida?tive／nitrative stress［J］.Circulation，2007，115（11）：1408－1416.

［11］ Wang Y，Gao E，Tao L，et al.AMP－activated protein kinase de?ficiency enhances myocardial ischemia／reperfusion injury but has minimal effect on the antioxidant／antinitrative protection of adi?ponectin［J］.Circulation，2009，119（6）：835－844.

［12］ Chandrasekar B，Boylston WH，Venkatachalam K，et al.Adi?ponectin blocks interleukin－18－mediated endothelial cell death via APPL1－dependent AMP－activated protein kinase（AMPK）activation and IKK／NF－kappaB／PTEN suppression［J］.J Biol Chem，2008，283（36）：24889－24898.

［13］ Zhou L，Deepa SS，Etzler JC，et al.Adiponectin activates AMP－activated protein kinase in muscle cells via APPL1／LKB1－de?pendent and phospholipase C／Ca2＋／Ca2＋／calmodulin－depend?ent protein kinase kinase－dependent pathways［J］.J Biol Chem 2009，284（33）：22426－22435.

［14］ Mahgoub KA，Abd el MA.Adiponectin in acute myocardial in?farction non obese egyptian men［J］.J Egypt SocParasitol，2010，40（2）：489－498.

［15］ Shibata R，Sato K，Pimentel DR，et al.Adiponectin protects a?gainst myocardial ischemia－reperfusion injury through AMPK－and COX－2－dependent mechanisms［J］.Nat Med，2005，11（10）：1096－1103.

［16］ Fruebis J，Tsao TS，Javorschi S，et al.Proteolytic cleavage prod?uct of 30－kDa adipocyte complement－related protein increases fatty acid oxidation in muscle and causes weightloss in mice［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98（4）：2005－2010.

Effects of APPL1 knock－down on the cardioprotective actions of adiponectin a?gainst myocardial ischemia／reperfusion injury in mouse

Wang Zheng，Jin Zhen－xiao，Yi Wei，Yi Ding－h(huán)ua
Department of Cardiovascular Surgery，Xijing Hospital，the Fourth Medical University，Xi＇an，710032，China Corresponding author：Yi Ding－h(huán)ua，Email：yidh＠fmmu.edu.cn

Objective APPL1 is an important adiponectin receptor 1（AdipoR1）binding protein.The objective of this study is to investigate the effect of APPL1 expression inhibition on adiponectin（APN）＇s cardioprotective functions against myocardial ische?mia／reperfusion（MI／R）injury in a mouse model.Methods An in vivo MI／R mice model was used.The APPL1 expression was knocked down by intramyocardial injection of APPL1 specific stealth iRNA（APPL1 SiRNA，1ug／g）.Ten minutes before reperfusion，globular domain of APN（2 μg／g）or equivalent saline was given by intraperitoneal injection.The mice were randomly divided into 5 groups：Sham operation（Control），MI／R＋Scramble SiRNA，MI／R＋APPL1 SiRNA，MI／R＋Scramble SiRNA＋gAPN，and MI／R＋AP?PL1 SiRNA＋gAPN.The myocardial APPL1 expression was detected by Western Blot after 3 hours reperfusion（n＝6）.Cardiac function was determined by echocardiography and myocardial infarction（MI）size was determined by the Evans blue／TTC double staining meth?od after 24 hours reperfusion（n＝8）.Results Compared with Control and Scramble SiRNA group，the myocardial APPL1 expressions were significantly reduced in APPL1 SiRNA group（P＜0.01）.The LVEFs and MI sizes had no significant difference between MI／R＋Scramble SiRNA group and MI／R＋APPL1 SiRNA group.Compared to MI／R＋Scramble SiRNA group，MI／R＋Scramble SiRNA＋gAPN group and MI／R＋APPL1 SiRNA＋gAPN group had better LVEFs（P＜0.01），and the MI sizes were obviously reduced（P＜0.01）.Compared to MI／R＋Scramble SiRNA＋gAPN group，MI／R＋APPL1 SiRNA＋gAPN group had much decreased LVEFs（P＜0.01），and the MI sizes were obviously increased（P＜0.01）.Conclusion The inhibition of myocardial APPL1 expression largely diminishes the cardioprotective actions of APN against MI／R injury in a mouse in vivo model.

Cardioprotection；Adiponectin；Ischemia／reperfusion injury；APPL1

2014?03?11）

2014?03?20）

10.13498／j.cnki.chin.j.ecc.2014.02.15

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81100137）

710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管外科

易定華，Email：yidh＠fmmu.edu.cn