超高效液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定配方奶粉中的泛酸

渠 巖，崔亞娟，李全霞，陳兆天，李 東，梁敏慧

（1.北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所，北京 100050；2.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100022）

超高效液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定配方奶粉中的泛酸

渠 巖1，崔亞娟1，李全霞1，陳兆天1，李 東1，梁敏慧2

（1.北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所，北京 100050；2.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100022）

建立測(cè)定配方奶粉中泛 酸的超高效液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜方法。樣品經(jīng)乙酸銨溶液提取、三氯甲烷除蛋白后，進(jìn)行超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，采用HSS T3液相色譜柱分離，以10 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）和乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明：方法定量限為0.040 mg/100 g，線性范圍內(nèi)低、中、高3 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)添加水平的回收率為96.9%～104.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.78%～5.04%。該方法操作過(guò)程簡(jiǎn)單、分析周期短、靈敏度高、重復(fù)性好，適用于奶粉中泛酸的測(cè)定。

泛酸；超高效液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜方法；配方奶粉

泛酸又稱VB5或遍多酸，廣泛存在于生物體內(nèi)，是生理代謝所必需的酸類物質(zhì)。泛酸在酸、堿、熱及光等條件下都不穩(wěn)定。泛酸是輔酶A的組成部分，參與體內(nèi)蛋白質(zhì)、碳水化合物的生理代謝，尤其是對(duì)脂肪的合成和代謝起著十分重要的作用[1]。根據(jù)《中國(guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量》[2]，泛酸每日適宜攝入量為：嬰幼兒1.7～1.8 mg，未成年人2.0～4.0 mg，成年人5.0 mg，孕婦6.0 mg，乳母7.0 mg。

目前，配方奶粉中泛酸的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法是微生物法和高效液相色譜法[3]。其中，微生物法[4-5]是測(cè)定泛酸的經(jīng)典方法，但是該方法復(fù)雜費(fèi)時(shí)，對(duì)環(huán)境條件要求高。高效液相色譜法[6-12]常用來(lái)檢測(cè)強(qiáng)化食品中的泛酸，但其所用的流動(dòng)相均為磷酸鹽緩沖溶液，需要調(diào)節(jié)溶液pH值，過(guò)程復(fù)雜且容易受到其他添加劑的影響。除此以外，也有報(bào)道用免疫法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、高效毛細(xì)管電泳法、超臨界流體色譜法等[13-17]方法檢測(cè)泛酸。超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MSMS）法是一種在定性和定量方面都具有優(yōu)勢(shì)的方法，具有較高的靈敏度和較強(qiáng)的分離能力，可以在短時(shí)間內(nèi)分析低含量、多組分的樣品[18-20]。近年來(lái)，國(guó)外有報(bào)道利用泛酸的穩(wěn)定同位素結(jié)合UPLC-MS-MS法測(cè)定食品中的泛酸[21-25]，該方法被證實(shí)是一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的方法，然而國(guó)內(nèi)相關(guān)研究卻鮮有報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泛酸鈣（純度≥98.0%） 美國(guó)Supelco公司；泛酸鈣-[13C3,15N]（純度≥99.5%） 美國(guó)IsoSciences公司；乙酸銨、甲酸（均為色譜純） 美國(guó)Sigma公司；乙腈（色譜純） 美國(guó)Fisher公司；三氯甲烷（分析純）北京化學(xué)試劑公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity＠UPLC-Xevo TQ 型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀、Acquity＠HSS T3柱 美國(guó)Waters公司；高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；Vortex-Genie 2型漩渦振蕩器 美國(guó)Scientific Industries公司；BS224S型分析天平 德國(guó)Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

泛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）：稱取泛酸鈣10.87 mg，加水溶解至100 mL（泛酸質(zhì)量濃度=泛酸鈣質(zhì)量濃度×0.92）；泛酸同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）：稱取泛酸鈣-[13C3,15N] 1.09 mg，加水溶解至10 mL；10 mmol/L乙酸銨緩沖液：稱取乙酸銨0.385 4 g于500 mL容量瓶中，加水溶解并定容。

1.3.2 樣品處理

稱取奶粉樣品約5 g（精確至0.000 1 g）于150 mL三角瓶中，加入100 mL 40～50 ℃溫水，振搖溶解后超聲萃取10 min。取試樣溶液1 mL于50 mL離心管中，加入泛酸同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液（由初步實(shí)驗(yàn)確定添加量，確保試樣中泛酸和同位素泛酸質(zhì)量相近），用10 mmol/L乙酸銨緩沖液定容至20 mL。渦旋振蕩1 min，超聲10 min。加入10 mL三氯甲烷，渦旋振蕩1 min，10 000 r/min離心10 min。上清液用0.22 μm gHP濾膜過(guò)濾，并轉(zhuǎn)移至棕色自動(dòng)進(jìn)樣瓶中。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；樣品溫度15 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相A：10 mmol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）溶液；流動(dòng)相B：乙腈。梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 1 Elution conditions for PA

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；毛細(xì)管電壓1.5 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度500 ℃；錐孔氣流量（氮?dú)猓?0 L/h；脫溶劑氣流量（氮?dú)猓? 000 L/h；碰撞氣流速（氬氣）0.17 mL/min。

泛酸和同位素泛酸的定量和定性離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 泛酸和同位素泛酸的定性和定量離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量Table 2 Qualitative and quantitative ion pairs, cone voltages and collision energy for PA and PA-

表2 泛酸和同位素泛酸的定性和定量離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量Table 2 Qualitative and quantitative ion pairs, cone voltages and collision energy for PA and PA-

注：*.定量離子對(duì)。

化合物 定性定量離子對(duì)（m/z）錐孔電壓/V碰撞能量/eV泛酸220.1＞90.0*2212 220.1＞202.02212泛酸-[13C3,15N]224.1＞94.0*2514 224.1＞206.02514

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理的優(yōu)化

考察了不同提取劑的提取效果，用水和乙酸銨緩沖液分別提取，泛酸的回收率均在90%～110%之間。但由于不同樣品在水中的pH值不同，會(huì)影響泛酸在色譜柱上的保留時(shí)間和峰形。而利用乙酸銨緩沖液提取可以得到較穩(wěn)定的保留時(shí)間和較好的峰形，因此選擇其作為提取劑。

奶粉中含有大量蛋白質(zhì)，如不除去會(huì)使樣品混濁、無(wú)法進(jìn)樣，更會(huì)縮短色譜柱壽命。因此，考察了三氯甲烷、高氯酸和調(diào)節(jié)pH值的除蛋白效果和對(duì)泛酸回收率的影響。結(jié)果顯示，3種方式都可以使蛋白沉淀，獲得澄清的樣品溶液。但高氯酸對(duì)泛酸的破壞性很大，處理過(guò)后的泛酸響應(yīng)值顯著降低。而三氯甲烷和調(diào)節(jié)pH值這2種方式均對(duì)泛酸回收率無(wú)顯著影響，回收率分別為99.3%和96.3%?？紤]到操作簡(jiǎn)易省時(shí)，選擇添加三氯甲烷去除蛋白。

2.2 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

比較了BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、BEH Amide柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）的分離效果（圖1）。因?yàn)榉核釋儆跇O性較強(qiáng)的化合物，它在C18柱和Amide柱上的保留較差，峰形也較差。而在對(duì)極性化合物有特殊保留能力的HSS T3柱上得到了較好的分離效果，且峰形好，響應(yīng)值高，因此選擇HSS T3柱。

圖1 泛酸在3種色譜柱上的離子色譜圖Fig.1 Ion chromatograms of PA by using three columns

2.2.2 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件的選擇

本研究使用UPLC-MS-MS方法，通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式進(jìn)行采集。選擇目標(biāo)物質(zhì)的2對(duì)母離子＞子離子，其中響應(yīng)值較強(qiáng)的離子對(duì)作為定量離子對(duì)，另一對(duì)作為定性離子對(duì)。泛酸和同位素泛酸的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖、子離子掃描圖見(jiàn)圖2、3。

圖2 泛酸和同位素泛酸的離子色譜圖Fig.2 Ion chromatograms of PA and PA-[13C3,15N]

圖3 泛酸（A）和同位素泛酸（B）的子離子掃描圖Fig.3 Mass spectra of PA (A) and PA-[13C3,15N] (B)

2.3 方法的驗(yàn)證

2.3.1 回收率

取已知泛酸含量的奶粉樣品，進(jìn)行3 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)添加水平（樣品中泛酸含量的50%、100%、150%）的回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6次，分別計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表3。泛酸3個(gè)水平的加標(biāo)回收率在96.9%～104.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.78%～5.04%，能夠滿足檢測(cè)實(shí)際樣品需要。

表3 泛酸加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Average recoveries and relative standard deviations of PA

2.3.2 線性范圍、檢出限和定量限

準(zhǔn)確吸取泛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別添加泛酸同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用10 mmol/L乙酸銨緩沖液稀釋成質(zhì)量濃度為1、50、100、200、300、400、500 ng/mL的泛酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，以峰面積比（A泛酸/A同位素）和同位素質(zhì)量濃度的乘積為縱坐標(biāo)、泛酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，泛酸在1～500 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y=1.038 56X+0.953 334，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。根據(jù)定量離子信噪比（RSN）結(jié)合定量限加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)（回收率92.9%），確定檢出限（RSN≥3）為0.4 ng/mL，定量限（RSN≥10）為1.0 ng/mL。當(dāng)取樣量為5 g、最終定容體積為20 mL時(shí)，檢出限和定量限分別為0.016 mg/100 g和0.040 mg/100 g。

2.3.3 方法精密度

取奶粉樣品按照1.3節(jié)中的方法，每日平行測(cè)定6次（n=6），連續(xù)測(cè)定3 d（n=3），考察方法的精密度，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品中泛酸的測(cè)定結(jié)果Table 4 Results of PA determination in samples

2.3.4 與微生物方法的比對(duì)

微生物法是檢測(cè)泛酸的經(jīng)典方法，同時(shí)也是GB 5413.17—2010《嬰幼兒食品和乳品中泛酸的測(cè)定》[3]的第一法。用微生物法和UPLC-MS-MS法同時(shí)對(duì)10種奶粉樣品做比對(duì)實(shí)驗(yàn)（表5）。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果做t檢驗(yàn)：平均差的95%置信區(qū)間，假設(shè)平均差=0（與平均差≠0），t=-0.519，P=0.309＞0.05，表明2種方法測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異，同時(shí)也證明了UPLC-MS-MS法測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

然而由于微生物法操作復(fù)雜、培養(yǎng)耗時(shí)等因素，導(dǎo)致其檢測(cè)周期較長(zhǎng)（3～4 d），不適于大量樣品的快速檢測(cè)。而UPLC-MS-MS法的樣品處理步驟簡(jiǎn)單、操作省時(shí)，在保證分析結(jié)果準(zhǔn)確的前提下，可以大幅縮短樣品的檢測(cè)周期，有利于提高檢測(cè)效率。

表5 泛酸含量測(cè)定微生物法和UPLC-MS-MS法對(duì)比Table 5 Comparison of microbiological method and UPLC-MS-MS mg/100 g

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)對(duì)樣品前處理方法和UPLC-MS-MS條件優(yōu)化，建立了一種可以快速檢測(cè)配方奶粉中泛酸的方法。本方法利用乙酸銨緩沖液提取、采用三氯甲烷除蛋白，得到了較好的提取效果。同時(shí)利用泛酸同位素作為內(nèi)標(biāo)，通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行信號(hào)采集，樣品回收率較高且穩(wěn)定。本方法結(jié)果準(zhǔn)確，與傳統(tǒng)的微生物法相比沒(méi)有顯著差異，而且方法操作過(guò)程簡(jiǎn)單、分析周期短、靈敏度高、重復(fù)性好，適用于奶粉中泛酸的測(cè)定。

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Determination of Pantothenic Acid in Formula Milk Powder Using Ultra Performance Liquid Chromatography-Isotope Dilution Mass Spectrometry

QU Yan1, CUI Ya-juan1, LI Quan-xia1, CHEN Zhao-tian1, LI Dong1, LIANG Min-hui2
(1. Beijing Research Institute for Nutritional Resources, Beijing 100050, China; 2. College of Life Science and Bio-enginee ring, Beijing University of Technology, Beijing 100022, China)

An ultra performance liquid chromatography-isotope dilution mass spectrometry (UPLC-IDMS) method has been developed for the determination for pantothenic acid (PA) in formula milk powder. Samples were extracted with ammonium acetate solution, and precipitated protein by adding chloroform for analyzing by UPLC-MS-MS. The analyte was separated using an HSS T3 column. The mobile phase consisted of 10 mmol/L ammonium acetate with 0.1% formic acid and acetonitrile. The PA was identified by multiple reaction monitoring (MRM) and quantified by internal standard method. The results showed that the limit of quantification for PA was 0.040 mg/100 g. The recoveries at three spiked levels and the relative standard deviations were 96.9%–104.3% and 3.78%–5.04%, respectively. This method proved to be simple, timesaving, sensitive and accurate for the determination of PA in formula milk powder.

pantothenic acid; ultra performance liquid chromatography-isotope dilution mass spectrometry; formula milk powder

TS207.3；O657.63

A

1002-6630（2014）08-0212-05

10.7506/spkx1002-6630-201408042

2013-08-01

北京市科技新星計(jì)劃項(xiàng)目（2011059）；衛(wèi)生行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目（201202012）；

北京市科委“雙十計(jì)劃”項(xiàng)目（Z121106002812109）；北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)資助項(xiàng)目（2011D002022000001)

渠巖（1984—），男，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称贩治?。E-mail：quyan_0220@163.com