大菱鲆胃質(zhì)子泵(H+ /K+ ATPase)與消化機(jī)能發(fā)生的關(guān)系*

遲 良 徐世宏 肖志忠 馬道遠(yuǎn) 林 帆 趙春彥肖永雙 武寧寧 劉清華① 李 軍①

(1.中國科學(xué)院海洋研究所生物技術(shù)中心 青島 266071;2.中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049;3.青島市漁業(yè)技術(shù)推廣站 青島 266071)

胃質(zhì)子泵,又稱為胃 H+/K+ATP酶(H+/K+ATPase),是胃酸分泌的關(guān)鍵性酶,它通過水解 ATP酶為離子轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量,完成 H+、K+離子轉(zhuǎn)運(yùn)和胃酸的分泌(Chowet al,1995)。H+/K+ATPase首先在上世紀(jì)70年代,由Forte等人在牛蛙的胃粘膜分離出來(Prinzet al,1992)。后來證明H+/K+ATPase具有跨膜運(yùn)輸質(zhì)子的作用,從而為胃酸分泌機(jī)理的研究奠定了基礎(chǔ)(vanDrielet al,1995;Forteet al,1996)。

質(zhì)子泵分為 α、β兩個(gè)亞單位。α亞基在胞質(zhì)內(nèi)外形成多個(gè)回褶,因此形成了胞質(zhì)區(qū)、膜區(qū)和胞質(zhì)外區(qū)三個(gè)功能區(qū)域。α亞基含有ATP結(jié)合位點(diǎn)、?；姿峄稽c(diǎn)等,是質(zhì)子泵的催化亞基,起催化和轉(zhuǎn)運(yùn)H+、K+的功能(Kakeiet al,1995;Asanoet al,1997;Besanconet al,1997)。β亞基只含有一個(gè)跨膜區(qū)域,是質(zhì)子泵的輔助亞基,主要起穩(wěn)定α亞基和輔助泌酸的功能(Horisbergeret al,1991;Tyagarajanet al,1996;CourtoisCoutryet al,1997)。另外,研究表明 H+/K+ATPase的正常分泌對于維持壁細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和發(fā)育也起到重要的作用。Spicer等通過基因打靶技術(shù)培養(yǎng)的H+/K+ATPase α亞基缺失的小鼠出現(xiàn)胃酸分泌減少,胃粘膜細(xì)胞變形,微絨毛和管泡消失,線粒體異常等癥狀(Spicer et al,2000)。Scarff等發(fā)現(xiàn) H+/K+ATPase β亞基缺失的小鼠會(huì)出現(xiàn)胃酸分泌減少,微管和管泡的結(jié)構(gòu)紊亂等特征(Scarffet al,1999)。

目前,對于 H+/K+ATPase的研究主要集中在哺乳動(dòng)物中,在海水魚類中關(guān)于 H+/K+ATPase還比較少。因?yàn)轸~類在消化過程中會(huì)受到溫度,酸堿度及海水不斷稀釋、中和的影響,所以海水魚類的消化過程較陸生動(dòng)物更為復(fù)雜。因此,研究H+/K+ATPase對了解海水魚類的消化機(jī)制重要的意義。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)屬鲆科(Bothidae)、菱鲆屬(Scophthalmus),自然分布于東北大西洋沿岸,因其肉質(zhì)鮮美,營養(yǎng)豐富,適應(yīng)水溫低,現(xiàn)在已成為我國北方重要的海水養(yǎng)殖種類。研究大菱鲆的消化機(jī)制對優(yōu)化餌料結(jié)構(gòu),合理投餌,提高苗種成活率都具有重要的意義。因此,本文以大菱鲆為材料研究H+/K+ATPase的時(shí)空表達(dá)模式及其與消化機(jī)能發(fā)生的關(guān)系,以期為研究大菱鲆乃至海水魚類的消化機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用大菱鲆魚苗及成魚取自山東煙臺(tái)東方海洋科技股份有限公司。采用腹部擠壓法獲得若干親魚成熟的卵子和精液,并采用人工受精獲得受精卵。將質(zhì)量較好的浮性卵移入孵化網(wǎng)箱中進(jìn)行孵化,孵化時(shí)水溫為(14 ± 0.5) °C。將初孵化仔魚轉(zhuǎn)至水泥池中培育,水泥池面積 25m2培養(yǎng)密度 125尾每升。培育條件:水溫調(diào)整為18—19 °C,溶氧7.0—8.5 mg/L,鹽度30—32,pH 7.7—8.0。4至19日齡,仔魚投喂輪蟲(Brachionus plicatilis)13至 35日齡,投喂鹵蟲(Artemianauplii)。從27日齡起開始投喂配合餌料。

分別取個(gè)時(shí)期胚胎(2細(xì)胞期,8細(xì)胞期,囊胚期,原腸期,心跳期)及仔稚幼魚(初孵為仔魚,鱗片出現(xiàn)為稚魚,鱗片鋪滿全身為幼魚),孵化后在每天投喂前取樣,分兩批分別投入液氮及 Bouin’s液中固定保存,分別用于RNA提取和組織切片研究。另外,取1齡成魚的腮、心臟、食管、胃、腸、肝臟、脾、腎、肌肉、卵巢等組織保存于液氮中,用于提取RNA。用于原位雜交實(shí)驗(yàn)的仔稚魚每天投喂前取樣,4%多聚甲醛固定 24h,梯度甲醇脫水,置于 100%甲醇中–20°C 長期保存。

1.2 RNA的提取和cNDA第一鏈的合成

胚胎、仔稚幼魚及不同組織的樣品約100 mg,使用購于 BioFlux 公司的 Simply P Total RNA Extration Kit試劑盒提取總RNA。提取的總RNA經(jīng)分光光度計(jì)檢測及甲醛變性電泳檢測后,使用北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的 Transcript Fist-Strand Cdna Synthesis Supermix試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.3 大菱鲆H+/K+ ATPase α亞基cDNA全長的克隆

根據(jù)GenBank中已公布的H+/K+ATPase α亞基的基因序列,通過比對在保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物HK1F和HK1R(表1),使用TransTaq HiFi DNA聚合酶(全式金北京)擴(kuò)增大菱鲆H+/K+ATPase α亞基的保守片段。反應(yīng)體系:0.25 μL TransTaq HiFi DNA Polymerase,5 mM dNTPs,上下游引物分別為 0.2μL,2.5 μL 10 ×TransTaqHiFi Buffer,2μL cDNA 模版 和 17.25 μL ddH2O補(bǔ)至25μL。PCR反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性5min;94°C 30s,54 30s,72°C 90s,30 個(gè)循環(huán),最后 72°C 延伸8 min。對擴(kuò)增產(chǎn)物使用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收,將回收的PCR產(chǎn)物與pMT-18T連接后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α中,然后送至北京華大基因公司進(jìn)行測序。根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計(jì)大菱鲆H+/K+ATPase α亞基RACE 引物 GSP1(3’RACE)和 GSP2(5’RACE)。

表1 試驗(yàn)中所需的引物序列Tab.1 Primers used for gene amplification by PCR

RACE反應(yīng)過程使用 SMARTTMRACE cDNA Amplication Kit(Clontech)進(jìn)行,根據(jù)說明書要求進(jìn)操作。RACE PCR 反應(yīng)體系:5 mM dNTPs,2.5 μL 10×Universal Primer A Mix(UPM),5μM Gene Specific Primer,1.25 μL RACE-ready cDNA,0.5 μL HiFi TransTaq,2.5 μL 10 ×TransTaqHiFi Buffer,加水至25 μL。RACE 反應(yīng)條件:94°C 預(yù)變性 5min,94°C 30s,68°C 45s,72°C 90s,最后 72°C 延伸 5min,36 個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖檢測后,使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收,連接至pMT-18T載體后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α中,LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后,挑選陽性克隆送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

1.4 大菱鲆H+/K+ ATPase α亞基的表達(dá)模式分析

根據(jù)已獲得的大菱鲆 H+/K+ATPase α亞基的cDNA全長序列設(shè)計(jì)引物HK2F和HK2R和一對特異的內(nèi)參引物β-actinF和β-actinR進(jìn)行RT-PCR檢測大菱鲆H+/K+ATPase的時(shí)空表達(dá)情況。分別提取大菱鲆胚胎、仔稚幼魚及成魚鰓、食管、心臟、肝、脾、胃、腸、腎、肌肉和卵巢10個(gè)組織的總RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后用于 RT-PCR檢測和熒光定量 PCR檢測,定量檢測引物為HK3F和HK3R。 RT-PCR的總反應(yīng)體系為 25 μL,其中 ddH2O 15.25 μL,10×PCR buffer 2.5 μL,dNTPs 4 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各 1 μL,Taq 酶 0.25 μL,cDNA 模板 1 μL。反應(yīng)條件為 4°C 預(yù)變性 5 min;94°C 變性 40 s、60°C 退火 30 s、72°C延伸2 min,26個(gè)循環(huán)。熒光定量反應(yīng)體系為25 μL,SYBR Primix Ex TaqTMII(2×),12.5 μL,上下游引物(10 μmol/L)分別為 1 μL,cDNA 模版 2 μL,ddH2O,8.5 μL。反應(yīng)條件為:95°C 30 s;95°C 5 s;60°C 30 s,40 個(gè)循環(huán)。

1.5 整體原位雜交

根據(jù)已獲得的大菱鲆 H+/K+ATPase α亞基的序列設(shè)計(jì)特異性地高辛標(biāo)記的反義探針(上游:5’AGTGATGAGTTGGATGACGCAC 3’;下游:5’ ATA AGCCAGAGAAACAGAGGGG 3)進(jìn)行整體原位雜交。探針的制備使用Roche探針標(biāo)記試劑盒完成。按照其說明書操作。取4%多聚甲醛固定的22日齡的大菱鲆幼魚,經(jīng)梯度甲醇脫水。將幼魚的內(nèi)臟團(tuán)剝離,梯度甲醇復(fù)水。10 μg/ml蛋白酶K進(jìn)行消化2h,4%多聚甲醛在固定20 min。移去固定液,1×PBST清洗6次,每次10 min。然后預(yù)雜交液中60°C預(yù)雜交2h,在含有10ng/μL探針的雜交液中60°C雜交過夜。多余的探針經(jīng) 50% SSCT/50%甲酰胺、2×SSCT、0.2×SSCT洗滌后,使用2%的脫脂奶粉封閉2h。經(jīng)染色緩沖液平衡后,與抗體雜交4°C過夜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Nikon YS-100顯微鏡觀察拍片記錄。

1.6 組織學(xué)觀察

大菱鲆幼魚Bouin’s液固定24h,70%乙醇保存。切片時(shí)使用乙醇梯度脫水,二甲苯透明,石蠟包埋進(jìn)行連續(xù)切片,切片厚度 8μm,HE染色,在 Nikon YS-100顯微鏡下觀察拍片記錄。

1.7 序列分析和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

測序結(jié)果使用DNASTAR Lasergene v7和MEGA 4.0進(jìn)行結(jié)構(gòu)和進(jìn)化樹分析。利用SPSS13.0軟件對熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),P＜ 0.05表示具有顯著性差異,描述性統(tǒng)計(jì)量用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 大菱鲆H+/K+ ATPase α亞基cDNA全長序列分析

大菱鲆H+/K+ATPase α亞基cDNA 全長3467bp ,包含 5’UTR 175 bp,3’UTR 329 bp 和 ORF 2964 bp,編碼988個(gè)氨基酸,前30個(gè)氨基酸為信號(hào)肽(圖1)。通過與GenBank 上已公布的H+/K+ATPase α亞基比對發(fā)現(xiàn)大菱鲆 H+/K+ATPase 亞基與斑鱖(Siniperca chautsi) H+/K+ATPase α亞基序列同源性最高,達(dá)89%。

大菱鲆H+/K+ATPase α亞基蛋白序列具有10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,蛋白磷酸化位點(diǎn)DKTGTLT(圖1)

2.2 大菱鲆H+/K+ ATPase α亞基的序列比對及進(jìn)化樹構(gòu)建

根據(jù)大菱鲆H+/K+ATPase α亞基的氨基酸序列,與GenBank公布的H+/K+ATPase α亞基氨基酸序列,使用MEGA4.0構(gòu)建了大菱鲆H+/K+ATPase與其它物種的 Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2),結(jié)果表明:H+/K+ATPase 的進(jìn)化關(guān)系具有物種特異性,哺乳動(dòng)物、禽類、兩棲類及魚類分別聚為一類。

2.3 大菱鲆H+/K+ ATPase在大菱鲆發(fā)育不同時(shí)期表達(dá)分析

以大菱鲆β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因,檢測了大菱鲆 H+/K+ATPase基因在仔稚幼魚不同發(fā)育時(shí)期及各組織的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,大菱鲆H+/K+ATPase直至孵化后22d 才開始表達(dá)(圖3a)。熒光定量結(jié)果顯示,大菱鲆H+/K+ATPase基因的表達(dá)在呈現(xiàn)指數(shù)性的增長(圖3b )。另外,通過整體原位雜交技術(shù)顯示大菱鲆的H+/K+ATPase首先在消化道的食道和胃的賁門區(qū)開始表達(dá),然后再逐漸擴(kuò)散到整個(gè)胃區(qū)(圖3c)。

圖1 大菱鲆H+/K+ ATPase α亞基cDNA 及其氨基酸序列Fig.1 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of H+/K+ ATPase α subunit gene from turbot(Scophthalmus maximus)

圖2 利用MEGA 4.0 構(gòu)建的H+/K+ ATPase的NJ進(jìn)化樹Fig.2 The Neighbor-joining tree of H+/K+ ATPase using MEGA 4.0

同時(shí)通過檢測RT-PCR及熒光定量PCR檢測大菱鲆成魚各組織 H+/K+ATPase的表達(dá)情況,結(jié)果顯示:大菱鲆 H+/K+ATPase主要在食道和胃中表達(dá),在卵巢中也檢測到了H+/K+ATPase的微量表達(dá)(圖4a,圖4b)。

2.4 大菱鲆消化道的發(fā)育過程

為了能夠更好地了解大菱鲆的消化機(jī)理,作者對大菱鲆仔魚消化道進(jìn)行了組織切片觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)胚胎孵化后第一天(1 day post hatching,1 dph)大菱鲆的食管為一條細(xì)長的管狀。2 dph時(shí),食道粘膜上皮由單層立方上皮細(xì)胞組成,3dph由單層立方上皮細(xì)胞變?yōu)閺?fù)層扁平上皮,8 dph 出現(xiàn)杯狀細(xì)胞(圖5a—c)。

圖3 a 大菱鲆H+/K+ ATPase在發(fā)育不同時(shí)期的mRNA表達(dá)Fig.3a Expression of H+/K+ ATPase of development stages by RT-PCR

圖3 b 大菱鲆H+/K+ ATPase在發(fā)育不同時(shí)期的mRNA的定量分析Fig.3b Expression of H+/K+ ATPase of development stages by quantitative real-time PCR

圖3 c H+/K+ ATPase mRNA在大菱鲆消化道中的分布Fig.3c Development and distribution of H+/K+ ATPase mRNA in turbot digestive tract by whole in situ hybridization of antisense probe

圖4 a H+/K+ ATPase在大菱鲆不同組織的表達(dá)情況Fig.4a Expression of H+/K+ ATPase mRNA in tissues of adult turbot.M:Maker

圖4 b H+/K+ ATPase 在大菱鲆不同組織的相對表達(dá)量Fig.4b The relative expression in different tissues of H+/K+ATPase from turbot

大菱鲆胃的發(fā)育較食管的分化稍晚,初孵仔魚的胃沒有分化。2 dph,胃原基開始膨大,食管在接近胃體處的復(fù)層扁平上皮逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閱螌又鶢钌掀ぁ? dph,胃粘膜逐漸出現(xiàn)褶皺,胃與食管的分化明顯。8 dph可分化為賁門區(qū)、基底區(qū)和幽門區(qū)(圖5d—f )。16 dph 胃腺出現(xiàn)。通過組織切片觀察證明,大菱鲆的胃是由食道的末端膨大分化而來的。

3 討論

α亞基含有ATP結(jié)合位點(diǎn)、?；稽c(diǎn)和離子識(shí)別位點(diǎn)等,在穩(wěn)定H+/K+ATPase酶的結(jié)構(gòu),行使功能等方面起到重要的作用(Besanconet al,1997;Asanoet al,1998)。因此本研究使用RACE技術(shù)克隆了大菱鲆的H+/K+ATPase α亞基,全長3467 bp,與GenBank已公布的H+/K+ATPase α亞基序列比對發(fā)現(xiàn),與斑鱖的同源性最高達(dá)89%,其次與牙鯛(Diplodus sargus)、美洲鰈(Pleuronectes americanus)分別為88%和87%。通過進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)H+/K+ATPase 在進(jìn)化上具有物種特異性,哺乳類、鳥類、兩棲類和魚類分別聚為一類,作者認(rèn)為這可能與物種的食物來源相關(guān)。

胃腺的出現(xiàn)通常是認(rèn)為胃的功能完善的標(biāo)志(Infanteet al,2001;Wuet al,2009)。H+/K+ATPase 動(dòng)物體內(nèi)主要起到提供酸性環(huán)境激活胃蛋白酶的作用,因此總是與胃的消化功能聯(lián)系在一起(Kageyama,2002)。作者通過 RT-PCR技術(shù)檢測到大菱鲆 H+/K+ATPase在胚胎孵化后 22d開始表達(dá),結(jié)合作者關(guān)于大菱鲆胃蛋白酶原的實(shí)驗(yàn),作者認(rèn)為大菱鲆的胃行使酸性消化功能至少要在 22d胃蛋白酶原與 H+/K+ATPase基因開始表達(dá)之后,因此胃的消化功能的完善未必與胃的組織結(jié)構(gòu)完善一致。

圖5 大菱鲆食道和胃的組織發(fā)育Fig.5 Development of esophagus and stomach in turbot

H+/K+ATPase 主要在生物體胃中起到提供酸性環(huán)境輔助消化的作用(Scarffet al,1999;Spiceret al,2000)。但在其它的組織中H+/K+ATPase也具有其它的輔助功能。Altman等報(bào)道了H+/K+ATPase在有胃病的病人的喉部和下頜腺中會(huì)起到保護(hù)粘膜的作用(Altmanet al,2011)。Kraut 等研究發(fā)現(xiàn)在大鼠的腎臟也有 H+/K+ATPase的 mRNA表達(dá),他們認(rèn)為 H+/K+ATPase 在腎臟中能夠起到平衡體液中的離子和酸堿平衡的作用(Krautet al,1994,1997,2001)。Choe 等在黃貂魚(Dasyatis sabina)的鰓中檢測到了 H+/K+ATPase的表達(dá),他們認(rèn)為鰓中的H+/K+ATPase能夠讓黃貂魚更加適應(yīng)海水的環(huán)境(Choeet al,2004)。在本研究中,通過RT-PCR和熒光定量PCR檢測,大菱鲆的 H+/K+ATPase不僅在胃中表達(dá),在食道中的表達(dá)量也很高,另外在卵巢中也檢測到 H+/K+ATPase的微量表達(dá)。為了研究食道中有H+/K+ATPase的表達(dá)的原因,作者使用組織學(xué)技術(shù),對大菱鲆的消化道的發(fā)育過程進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),大菱鲆的食道是胃的前體,胃的發(fā)育是在食道的末端由食道復(fù)扁平上皮轉(zhuǎn)化為柱狀上皮發(fā)育而來。因此作者認(rèn)為,H+/K+ATPase在大菱鲆的食道中的高度表達(dá)可能是因?yàn)槭车朗俏傅那绑w因此保留了分泌H+/K+ATPase的能力。另外,通過整體原位雜交實(shí)驗(yàn)也證明大菱鲆的 H+/K+ATPase首先在胃的賁門部和食管的末端開始表達(dá)。這也從另一個(gè)方面證明了作者的觀點(diǎn)。

Altman K W,Kinoshita Y,Tan Met al,2011.Western blot confirmation of the H+/K+-ATPase proton pump in the human larynx and submandibular gland.Otolaryngology- head and neck surgery:official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,145(5):783—788

Asano S,Hoshina S,Nakaie Yet al,1998.Functional expression of putative H+-K+-ATPase from guinea pig distal colon.American Journal of Physiology-Cell Physiology,275(3):C669—C674

Asano S,Matsuda S,Tega Yet al,1997.Mutational analysis of putative SCH 28080 binding sites of the gastric H+,K+-ATPase.Journal of Biological Chemistry,272(28):17668—17674

Besancon M,Simon A,Sachs Get al,1997.Sites of reaction of the gastric H,K-ATPase with extracytoplasmic thiol reagents.Journal of Biological Chemistry,272(36):22438—22446

Choe K P,Verlander J W,Wingo C Set al,2004.A putative H+-K+-ATPase in the Atlantic stingray,Dasyatis sabina:primary sequence and expression in gills.American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology,287(4):R981—R991

Chow D C,Forte J G,1995.Functional-significance of the beta-subunit for heterodimeric P-type ATPases.Journal of Experimental Biology,198(1):1—17

CourtoisCoutry N,Roush D,Rajendran Vet al,1997.A tyrosine-based signal targets H/K-ATPase to a regulated compartment and is required for the cessation of gastric acid secretion.Cell,90(3):501—510

Forte J G,Yao X B,1996.The membrane-recruitmentand-recycling hypothesis of gastric HCl secretion.Trends in Cell Biol,6(2):45—48

Horisberger J D,Jaunin P,Reuben M Aet al,1991.The H,K-ATPase beta-subunit of NA,K-pumps.Journal of Biological Chemistry,266(29):19131—19134

Infante J L Z,Cahu C L,2001.Ontogeny of the gastrointestinal tract of marine fish larvae.Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology &Pharmacology,130(4):477—487

Kageyama T,2002.Pepsinogens,progastricsins,and prochymosins:structure,function,evolution,and development.Cellular and Molecular Life Sciences,59(2):288—306

Kakei N,Ichinose M,Tatematsu Met al,1995.Effects of long-termomeprazole treatment on adult-rat gastric-mucosaenancement of the epithelial-cell proliferation and suppression of its differentiation.Biochemical and Biophysical Research Communications,214(3):861—868

Kraut J A,Helander K G,Helander H Fet al,2001.Detection and localization of H+-K+-ATPase isoforms in human kidney.American Journal of Physiology-Renal Physiology,281(4):F763—F768

Kraut J A,Hiura J,Besancon Met al,1997.Effect of hypokalemia on the abundance of HK alpha(1) and HK alpha(2) protein in the rat kidney.American Journal of Physiology-Renal Physiology,272(6):F744—F750

Kraut J A,Hiura J,Scott Det al,1994.Isolation of an H+/K+-ATPase from the rat kidney.Journal of the American Society of Nephrology,5(3):290—290

Prinz C,Kajimura M,Scott Det al,1992.Acid-secretion and the H,K-ATPase of stomach.Yale Journal of Biology and Medicine,65(6):577—596

Scarff K L,Judd L M,Toh Bet al,1999.Gastric H+,K+-adenosine triphosphatase beta subunit is required for normal function,development,and membrane structure of mouse parietal cells.Gastroenterology,117(3):605—618

Spicer Z,Miller M L,Andringa Aet al,2000.Stomachs of mice lacking the gastric H,K-ATPase alpha-subunit have achlorhydria,abnormal parietal cells,and ciliated metaplasia.Journal of Biological Chemistry,275(28):21555—21565

Tyagarajan K,Townsend R R,Forte J G,1996.The beta-subunit of the rabbit H,K-ATPase:A glycoprotein with all terminal lactosamine units capped with alpha-linked galactose residues.Biochemistry,35(10):3238—3246

vanDriel I R,Callaghan J M,1995.Proton and potassium transport by H+/K+-ATPases.Clinical Experimental Pharmacology and Physiology,22(12):952—960

Wu T,Sun L-C,Du C-Het al,2009.Identification of pepsinogens and pepsins from the stomach of European eel(Anguilla anguilla).Food Chemistry,115(1):137—142