基于海洋細(xì)菌為受試生物的海洋防污劑快速篩選方法*

沈 明 徐煥志① 孫保庫(kù) 陸阿定 劉雪珠

(1.浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 國(guó)家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 舟山 316004;2.浙江省海洋開(kāi)發(fā)研究院舟山 316100;3.浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 海洋生物資源與分子工程實(shí)驗(yàn)室 舟山 316004)

海洋污損問(wèn)題制約著人類(lèi)對(duì)海洋資源的開(kāi)發(fā)利用,并帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失(黃宗國(guó)等,1984;倪春花等,2009)。關(guān)于海洋污損,最早的文字記錄可以追溯到公元前5世紀(jì)(WHOI,1952)。通常認(rèn)為,微生物群落首先附著在相應(yīng)基體上,形成生物膜(Chamberset al,2006;段東霞,2011),為后來(lái)附著生物提供營(yíng)養(yǎng)和附著基,從而有利于其他大型污損生物的附著(ASTM,1993;Swainet al,1996;Charnley,2011)。因此,阻止微生物的附著是防治海洋污損重要的環(huán)節(jié)。目前,涂裝防污涂料是最常用的防污方法(胥震,2012),在防污涂料中加入殺菌劑類(lèi)防污劑是常用的手段,但是其中添加的有毒防污劑(多為殺菌、滅藻劑)對(duì)海洋環(huán)境造成很大的危害(Yebra,2004;Antizar-Ladislao,2008),開(kāi)發(fā)環(huán)境友好型防污涂料是目前的發(fā)展方向。目前防污材料(防污劑、防污涂料、防污樹(shù)脂,等等)的防污性能評(píng)價(jià)多采用淺海掛板實(shí)驗(yàn)方法,致使防污涂料研發(fā)周期過(guò)長(zhǎng),因而在前人研究的基礎(chǔ)上,探究簡(jiǎn)單快速的評(píng)價(jià)方法對(duì)防污劑和防污涂料的開(kāi)發(fā)具有重要意義。研究者在這方面已經(jīng)取得了一些成果,例如,利用室內(nèi)掛板分光光度法和抑菌圈法(田斌,2005)快速評(píng)價(jià)防污劑的殺菌性,但研究者采用金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、酵母菌等非海洋細(xì)菌和真菌作為受試生物,明顯不具有代表性。也有研究者以海洋細(xì)菌為受試物(Hellioet al,2001;Philippeet al,2004)對(duì)防污材料進(jìn)行室內(nèi)評(píng)價(jià),但僅限于對(duì)溶劑可溶型防污材料的評(píng)價(jià),且其評(píng)價(jià)方法多用抑菌圈法等定性或半定量方法。室內(nèi)摸擬淺海掛板方法,以紫貽貝為受試生物、以丙烯酸樹(shù)脂為成膜物質(zhì)室內(nèi)掛板(徐煥志,2006),可根據(jù)紫貽貝的足絲量來(lái)評(píng)價(jià)材料防污性能,此法對(duì)于防污材料的室內(nèi)評(píng)價(jià)取得一定進(jìn)展。本文旨在以海區(qū)具有代表性的優(yōu)勢(shì)海洋細(xì)菌濃度加富的方法,選用防污涂料中廣泛使用的防污劑和實(shí)驗(yàn)室自制防污劑為受試化合物,以凝膠板模擬涂層進(jìn)行室內(nèi)模擬淺海掛板,以探索基于海洋細(xì)菌的室內(nèi)短期掛板方法在防污劑快速評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所需主要設(shè)備和器材有,酶標(biāo)儀(使用96孔板,高通量檢測(cè),MultiskanFC,賽默飛世爾(上海)儀器有限公司),可見(jiàn)分光光度計(jì)(WFJ-2000型,尤尼柯(上海)儀器有限公司),生化培養(yǎng)箱(SPX-250BS-Ⅱ,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司),水族缸,玻璃板等。

防污劑為防污涂料中廣泛使用的防污劑種類(lèi),分別是濱海明鴻精細(xì)化工有限公司提供的吡啶硫酮銅(CPT,97%)固體橄欖綠色粉末) 和吡啶硫酮鋅(ZPT,96%固體白色粉末),敵草隆(Diuron,99%固體白色粉末,上海思域化工科技有限公司)。三甲基氧化錫(TBTO)(曾是最有效的防污劑,由于嚴(yán)重的生態(tài)毒性問(wèn)題目前已禁用,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),N,N-二甲基-3,4-二氯芐胺((3,4-dichlorophenyl)-N,N-dimethylmethanamine,簡(jiǎn)稱(chēng)DCDMA,濃度約為85%,實(shí)驗(yàn)室自制防污劑)。溶劑為二甲亞砜(DMSO,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

不同粒徑微/納米Cu2O,粒徑分別為 ?5.986μm,?5.679μm(江蘇泰禾金屬工業(yè)有限公司提供),?0.987μm,?0.612μm(實(shí)驗(yàn)室自制)。

菌種是采用海水選擇性培養(yǎng)基2216E(Maoet al,2007;鄭兆祥等,2011)分離自東海海區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌種,分別為 W-1(來(lái)源于東極海水水樣,革蘭氏陰性菌,舟山)、F-6(來(lái)源于東極深水養(yǎng)殖網(wǎng)箱附著物,革蘭氏陰性菌,舟山)、Y-16(一種海洋芽孢桿菌Bacillus subtilis,革蘭氏陽(yáng)性菌,由浙江海洋學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室采自舟山海域并提供)。

1.2 菌懸液的制備

配制2216E液體培養(yǎng)基備用。取斜面保存的菌種各1環(huán),接種于50mL 的Zobell 2216 E 液體培養(yǎng)基中,25°C,180 r/min條件下,連續(xù)培養(yǎng)6h,選取吸光度在0.1—0.6之間(陳默等,2009)的懸液,備用。

以純DMSO為溶劑(Maraldo,2002;Okamuraet al,2004),配制 CPT、ZPT和 TBTO三種防污劑的濃度為 0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL的溶液。配制 Diuron溶液的濃度為10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、100mg/mL。DCDMA溶液濃度為 2.0mg/mL、4.0mg/mL、6.0mg/mL、8.0mg/mL、10.0mg/mL,備用。

1.3 室內(nèi)短期掛板實(shí)驗(yàn)方法建立

淺海掛板實(shí)驗(yàn)方法、實(shí)船涂布(部分)實(shí)驗(yàn)方法是目前最有效的防污性能測(cè)試方法(Trentinet al,2001),但是實(shí)驗(yàn)周期過(guò)長(zhǎng),不適合用于防污材料的初、中期篩選。本文旨在研發(fā)一種適用于防污材料的初、中期篩選的室內(nèi)短期掛板實(shí)驗(yàn)方法,以縮短防污材料的研發(fā)周期。該方法用凝膠模擬涂層評(píng)價(jià)防污劑的防污性能,具體方法如下:向Zobell 2216 E液體培養(yǎng)基中,分別加入瓊脂粉,加熱溶解配制瓊脂濃度為 1%的瓊脂凝膠溶液。冷卻至 50—60°C,向其中分別加入 5種防污劑,振蕩搖勻,制成防污劑濃度為1 mg/mL的5種瓊脂凝膠溶液后,平滑均勻的涂覆于玻璃板(規(guī)格:100×100mm)上,如圖1所示,晾干,制成凝膠測(cè)試板。以不加防污劑的瓊脂凝膠測(cè)試板作為空白對(duì)照。

圖1 防污劑——瓊脂凝膠測(cè)試板示意圖Fig.1 Diagram of the test antifoulant,the agar gel panel

分別于 6個(gè)玻璃缸(規(guī)格:630×370×500mm)中,加入10L無(wú)菌海水,以及培養(yǎng)6h后的三種受試菌懸液各1mL,保持溫度25°C,培養(yǎng)6h(根據(jù)菌種種類(lèi)不同,培養(yǎng)時(shí)間有所差別)后,將涂有瓊脂凝膠的玻璃板放到玻璃缸中,置于自制支架上,連續(xù)培養(yǎng) 24h,將玻璃板取出,用液體培養(yǎng)基反復(fù)淋洗,淋洗液于50 mL容量瓶中定容,測(cè)其OD值。

1.4 測(cè)定OD值并繪制OD-t生長(zhǎng)曲線

取200μL各受試菌懸液于96孔板中,分別向各孔板中加入1μL不同濃度的防污劑,以加入1μL純?nèi)軇?DMSO的孔板作為對(duì)照,以添加對(duì)應(yīng)濃度防污劑的液體培養(yǎng)基作為空白,用酶標(biāo)儀在 600nm波長(zhǎng)下測(cè)定其OD值(楊浩等,1996;喬軍等,2002;馬勇等,2011)。將 96 孔板置于25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,期間每隔1—2 h測(cè)定并記錄菌懸液的OD值,繪制3種受試菌在不同條件板孔中的生長(zhǎng)曲線,得到各種防污劑的最小抑制濃度MIC。

1.5 在溶劑難溶型防污劑評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

制備濃度為2.0mg/mL的不同粒徑微/納米Cu2O-瓊脂凝膠測(cè)試板,根據(jù) 1.3.1所述方法進(jìn)行室內(nèi) 24h掛板實(shí)驗(yàn)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

1.6.1 24h抑菌率的計(jì)算(陳默,2009)

各種物質(zhì)的抑菌性與TBTO相比較,得相對(duì)抑菌率R′/%=待測(cè)物平均抑菌率/TBTO平均抑菌率。

1.6.2 最小抑制濃度換算公式:

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)短期掛板實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將涂有瓊脂凝膠的玻璃板在含有三種受試菌的玻璃缸中,培養(yǎng)24h后取出,對(duì)掛板前后細(xì)菌的生長(zhǎng)情況進(jìn)行對(duì)比,如圖2所示。

圖2 不同凝膠測(cè)試板室內(nèi)掛板前后對(duì)比Fig.2 Contrast between test gar gel panels before and after indoor hanging

掛板前,空白對(duì)照板、含有 TBTO和含有DCDMA的玻璃板為無(wú)色透明的,其中含有CPT的玻璃板為橄欖綠色,其余為乳白色,所有的玻璃凝膠板均平整光滑。24h后取出,瓊脂凝膠層變得松軟,取無(wú)色透明的防污劑——凝膠測(cè)試板在顯微鏡下觀察,可發(fā)現(xiàn)表面上的細(xì)菌菌落。其中含有TBTO的玻璃凝膠板上幾乎沒(méi)有菌落附著,空白對(duì)照板和含有Diuron的板有大量菌落,含有ZPT、CPT和DCDMA的玻璃凝膠板上則無(wú)較大差別。

24h掛板后的凝膠測(cè)試板板,經(jīng)淋洗定容后,其抑菌效果如圖3所示。

由圖3可以看出,24h室內(nèi)短期掛板后,防污劑TBTO、CPT、ZPT、DCDMA對(duì)應(yīng)的平均抑菌率分別為65.19%,41.24%,38.87%和30.88%。其中,TBTO抑菌效果最為顯著;其凝膠測(cè)試板淋洗液的平均抑菌率達(dá)到了65.19%。CPT、ZPT的抑菌性較接近,但CPT效果稍強(qiáng)于ZPT,這可能是由于CPT比ZPT更加穩(wěn)定的原因。DCDMA的抑菌性也比較顯著;而Diuron對(duì)三種海洋細(xì)菌的抑制效果最差,這主要是因?yàn)樽鳛榉牢蹌┑腄iuron是一種除藻劑而非殺菌劑。綜合圖3a和圖3b可以得到,5種化合物的抑菌性大小為 TBTO＞CPT＞ZPT＞DCDMA＞Diuron。與TBTO的抑菌性相比較,其余幾種防污劑的相對(duì)抑菌率如圖3b所示。

圖3 不同凝膠測(cè)試板24h室內(nèi)掛板結(jié)果Fig.3 Results of different test gar gel panels after 24h indoor hanging

2.2 受試菌的生長(zhǎng)曲線及 MIC

3種受試菌在幾種不同濃度防污劑溶液影響下的生長(zhǎng)曲線,可以很直觀地反應(yīng)出 5種試驗(yàn)防污劑的抑菌效果(Marionet al,2008),見(jiàn)圖4、圖5、圖6、圖7、圖8。

由圖4 —圖6可以看出,隨著防污劑CPT、TBTO和ZPT濃度的升高,3種受試菌的生長(zhǎng)逐漸受到抑制,當(dāng)溶液濃度達(dá)分別到 0.97×10–3mg/mL、1.99×10–3mg/mL和1.91×10–3mg/mL時(shí),三種防污劑對(duì)受試菌均表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

圖4 CPT對(duì)三種受試菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.4 The influence of CPT on the growth curve of three test bacteria

圖5 TBTO對(duì)三種受試菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.5 The influence of TBTO on the growth curve of three test bacteria

圖6 ZPT對(duì)三種受試菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.6 The influence of ZPT on the growth curve of three test bacteria

圖7 DCDMA對(duì)三種受試菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.7 The influence DCDMA on the growth curve of three test bacteria

圖8 Diuron對(duì)三種受試菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.8 The influence of Diuron on the growth curve of three test bacteria

對(duì)于 CPT,整體來(lái)看,其抑菌性隨濃度增加而增加。但是,當(dāng)濃度達(dá)到 0.97×10–3mg/mL后,繼續(xù)增大濃度,抑菌效果僅有輕微增加;并且隨時(shí)間延長(zhǎng),受試菌呈平穩(wěn)生長(zhǎng)狀態(tài);對(duì)于 TBTO,在各個(gè)試驗(yàn)濃度下,均表現(xiàn)出了很好的抑菌效果,且濃度變化對(duì)抑菌效果影響不大。但隨時(shí)間的延長(zhǎng),在 17.5h時(shí),受試菌生長(zhǎng)速率明顯加快,這或許和細(xì)菌的生長(zhǎng)周期有關(guān);對(duì)于 ZPT,在濃度低于 1.91×10–3mg/mL 時(shí),抑菌效果不是太明顯,當(dāng)濃度達(dá)到1.91×10–3mg/mL時(shí),才表現(xiàn)出明顯的抑菌性,繼續(xù)增大濃度對(duì)其影響不大。

由圖6可以看出,當(dāng)溶液濃度達(dá)到8.46×10–3mg/mL時(shí),DCDMA才對(duì)三種受試菌表現(xiàn)出輕微的抑制作用,但當(dāng)濃度繼續(xù)增加時(shí),抑菌效果并沒(méi)有增加,這可能是因?yàn)槿芤褐械腄CDMA已達(dá)到飽和狀態(tài)。相較于前三種防污劑,DCDMA的防污效果并不十分顯著。

由圖8中 3種受試菌的生長(zhǎng)曲線可以看出,Diuron對(duì)海洋細(xì)菌的正常生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有影響,當(dāng)濃度高達(dá) 0.493mg/mL時(shí),依然沒(méi)有明顯抑制作用。印證了前面室內(nèi)掛板的結(jié)果。

幾種防污劑的抑菌機(jī)理可作如下解釋:對(duì)于金屬鹽類(lèi)配合物,配合物中心的金屬離子帶有正電荷,當(dāng)微量金屬離子接觸到微生物的細(xì)胞膜時(shí)與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜發(fā)生庫(kù)侖吸引,金屬離子穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)上的巰基氨基等發(fā)生反應(yīng),使蛋白質(zhì)被破壞造成微生物死亡或喪失分裂增殖能力(安燕等,2012)。如,ZPT可與釋放出的銅離子結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚愿鼜?qiáng)的銅配合物。DCDMA主要為破壞微生物間的信息傳遞,使其無(wú)法聚集成膜,而破壞其繁衍,從而達(dá)到抑菌的目的。

幾種防污劑針對(duì)三種海洋細(xì)菌的最小有效濃度如下表1所示。通常情況下,對(duì)于MIC法,OD值與空白對(duì)照的差距約在0.3以上(Evaet al,2008),即可作為最低有效濃度。

從表1可以看出,TBTO對(duì)三種受試菌的MIC非常小,且均為0.5×10–3mg/mL;CPT對(duì)W-1和F-6的MIC為 0.97×10–3mg/mL,對(duì) Y-16 的 MIC 為 1.93;ZPT 對(duì)W-1和Y-16的MIC為1.91×10-3mg/mL,對(duì)F-6的MIC為 0.96×10–3mg/mL;DCDMA 對(duì) W-1 和 F-6 的 MIC為 8.46×10–3mg/mL,對(duì) Y-16 的 MIC 為 42.29mg/mL。其中CPT和ZPT具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu),所以抑菌效果也更為接近且較為顯著;DCDMA具有一定的抑菌效果,但效果低于三丁基氧化錫和吡啶硫酮金屬鹽類(lèi)防污劑;Diuron是一種除藻劑而非殺菌,對(duì)此三種海洋細(xì)菌基本沒(méi)有抑制作用。幾種防污劑的防污效果如下:TBTO＞ CPT＞ZPT＞DCDMA＞Diuron。同時(shí),已知菌種W-1和F-6為兩種革蘭氏陰性菌,Y-16為革蘭氏陽(yáng)性菌,整體(除防污劑ZPT對(duì)W-1的MIC較大外)看以得出,幾種防污劑對(duì)兩種革蘭氏陰性菌的MIC 值更小,對(duì)其抑制作用更為敏感。這可能是因?yàn)楦锾m氏陽(yáng)性菌要比陰性菌壁厚,防污劑不易破壞其生物結(jié)構(gòu)。

表1 幾種防污劑的MICTab.1 The MIC of each antifoulant

幾種防污劑對(duì)三種海洋細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線的影響與室內(nèi)掛板的結(jié)果是一致的,因此,以海洋細(xì)菌為受試微生物在海水中人工加富濃度,以含防污劑凝膠測(cè)試板進(jìn)行室內(nèi)摸擬淺海掛板的防污劑評(píng)價(jià)方法具有可行性。對(duì)于海洋防污涂料的開(kāi)發(fā),尤其是防污劑的篩選評(píng)價(jià)以及縮短海洋防污劑開(kāi)發(fā)周期具有重要意義。

2.3 室內(nèi)短期掛板在非溶解性防污劑評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

四種不同粒徑的微/納米 Cu2O粉末制備的測(cè)試板24h掛板后的結(jié)果如圖9所示。

由圖9可見(jiàn),對(duì)于不同粒徑的氧化亞銅來(lái)說(shuō),粒徑越細(xì)其抑菌性越好,這與文獻(xiàn)所述一致(高紅秋等,2008)。因而采用以海洋細(xì)菌為受試微生物,在海水中人工加富濃度,并且制備凝膠測(cè)試板進(jìn)行室內(nèi)模擬淺海掛板的方法,對(duì)不同粒徑氧化亞銅等溶劑不溶性化合物的防污性評(píng)價(jià),同樣具有可行性。

3 結(jié)論

本課題對(duì)海洋防污劑的評(píng)價(jià)具有一定的創(chuàng)新性。研究中用海區(qū)優(yōu)勢(shì)海洋細(xì)菌作為受試生物,在室內(nèi)用天然海水人工加富的方法模擬海上掛板,從而對(duì)防污劑進(jìn)行快速有效評(píng)價(jià)。其中,研究采用凝膠層模擬防污涂層,此法更加方便快捷;室內(nèi)短期掛板采用海區(qū)優(yōu)勢(shì)代表性菌種在海水人工加富濃度,能更好的模擬復(fù)雜的海水環(huán)境,而且方法簡(jiǎn)便快速。評(píng)價(jià)試驗(yàn)相當(dāng)于在含高濃度優(yōu)勢(shì)菌種的實(shí)海中進(jìn)行,因而評(píng)價(jià)結(jié)果更加可靠。將測(cè)定OD-t生長(zhǎng)曲線的方法應(yīng)用到溶劑可溶性防污劑的評(píng)價(jià)中,操作快速且靈敏度極高,且與防污劑室內(nèi)短期掛板結(jié)果具有一致性,因而可作為輔助評(píng)價(jià)方法。

圖9 微/納米Cu2O –凝膠測(cè)試板室內(nèi)掛板結(jié)果Fig.9 Results of indoor testing on micro/nano-Cu2O–agar gel panels

測(cè)定 OD-t生長(zhǎng)曲線的方法,在殺菌劑的檢測(cè)中已經(jīng)得到應(yīng)用(孫世春等,1999;陳默等,2009)。此法在本研究中作為一種輔助方法,不但對(duì)防污劑的防污效果做出了定量的大小比較,而且對(duì)防污劑在實(shí)際防污涂料中的用量問(wèn)題,給予一定的參考值。室內(nèi)短期掛板實(shí)驗(yàn),采用幾種菌在海水中混合培養(yǎng)的人工加富濃度模式,與實(shí)海(淺海掛板)情況更接近,比測(cè)試單一某種菌種的抑菌性更具實(shí)際意義,且其 24h抑菌率與 OD-t生長(zhǎng)曲線法所得結(jié)果一致。因此,本研究方法對(duì)于海洋防污劑的評(píng)價(jià)具有可靠性。

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