脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)vasa基因cDNA克隆及其在卵巢發(fā)育中的表達分析*

徐文斐 劉 萍 李吉濤 李 健 陳 萍

(1.大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院 大連 116000;2.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071)

脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)又名白蝦、小白蝦等,隸屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、游泳亞目(Natantia)、長臂蝦科(Palaemonidae)、白蝦屬(Exopalaemon)。脊尾白蝦肉質(zhì)細嫩、繁殖能力強、生長速度快、環(huán)境適應性廣,分布于我國沿海及大河口的咸淡水處,尤以黃海和渤海產(chǎn)量較多,是我國特有的一種重要經(jīng)濟蝦類。

DEAD-box家族蛋白是一類三磷酸腺苷(ATP)依賴的 RNA解旋酶,廣泛存在于從細菌到哺乳動物的許多物種中,因其具有高度保守的 DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)序列而得名(Linderet al,1989)。該蛋白在細胞RNA代謝中意義重大,參與RNA幾乎所有的代謝過程,如:翻譯起始、核糖體形成、前mRNA拼接、mRNA降解和細胞器的基因表達等(Rocaket al,2004)。

vasa作為DEAD-box基因家族的重要成員之一,最早在果蠅(Drosophila melanogaster)中被發(fā)現(xiàn),它作為一種母源效應基因在腹節(jié)形成和生殖細胞分化中發(fā)揮著重要作用(Schüpbachet al,1986)?；趘asa基因在動物中的高度保守性,后來在脊椎動物:斑馬魚(Danio rerio)(Yoonet al,1997;Krvelet al,2004),金魚(Carassius auratus)(陳云貴等,2005;Otaniet al,2002),羅非魚(Oreochromis niloticus)(Kobayashiet al,2000),草魚(grass carp)(Liet al,2010),南方鲇(Silurus meridionalis)(胡重江等,2008),革胡子鲇(Clarias gariepinus)(Raghuveeret al,2012),銀鯽(Carassius auratus gibelio)(Xuet al,2005),黃鱔(Monopterus albus)(呂道遠等,2005),半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis Günther)(張遠青等,2012),黑脊倒刺鲃(Spinibarbus caldwelli)(唐良華等,2012)等,以及無脊椎節(jié)肢動物擬穴青蟹(Scylla paramamosain)(張鳳英等,2012),中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)(Wanget al,2013),羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)(Nakkrasaeet al,2007),凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)(Aflaloet al,2007),日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicas)(Sellarset al,2007),日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)(朱小玲,2010;Qiuet al,2013),中國明對蝦(Fenneropenaeus chinesis)(Zhouet al,2010)等物種中均陸續(xù)克隆了vasa的同源基因。在絕大多數(shù)物種當中,vasa基因僅限在生殖細胞系中特異性表達,因此被作為一種分子標記物廣泛用于研究配子發(fā)生和原生殖細胞(Primordial Germ Cells,PGCs)起源、遷移、分化等方面。進一步研究發(fā)現(xiàn):VASA蛋白對于生殖細胞的形成和卵子極性的建立以及某些發(fā)育基因的mRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控都具有重要作用(Laskoet al,1988;Styhleret al,1998)。

本文以人工養(yǎng)殖的脊尾白蝦為對象,應用分子生物學方法,克隆得到vasa基因全長cDNA序列,并對vasa基因在不同組織和卵巢發(fā)育不同時期的表達模式進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用脊尾白蝦購自濰坊昌邑海豐水產(chǎn)養(yǎng)殖責任公司,成蝦200尾。采集血細胞、鰓、肝胰腺、肌肉、腸、胃、眼柄組織立即放入液氮保存。性成熟不同階段的雌性脊尾白蝦,暫養(yǎng)于水生實驗室,水溫(18±1°C),海水鹽度 31,每天換水 2次,投喂配合飼料2次。根據(jù)王緒峨(1989)對脊尾白蝦卵巢發(fā)育外形特征的描述,取卵巢發(fā)育不同階段的脊尾白蝦卵巢組織:一部分卵巢固定用于組織學觀察,一部分用于vasa基因表達分析。

1.2 組織學實驗方法

卵巢用 Bouin’s氏液固定 24h后,常規(guī)梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟(熔點 54—56°C)包埋,LEICARM2145切片機連續(xù)切片,厚度為6μm。采用蘇木精-曙紅(H.E)染色,中性樹膠封片,Nikon E200型光學顯微鏡觀察及顯微攝影(圖1)。根據(jù)卵巢發(fā)育形態(tài)特征及其卵細胞類型,將脊尾白蝦卵巢發(fā)育分為5期,分別為Ⅰ期(形成期)、Ⅱ期(小生長期)、Ⅲ期(大生長期)、Ⅳ期(成熟期)、Ⅴ期(恢復期)(王緒峨,1989;楊筱珍等,2009)。

1.3 總RNA提取

采集發(fā)育期卵巢,在研缽中加液氮研磨成粉末狀,迅速轉(zhuǎn)移至Trizol試劑中,按照說明書步驟提取總RNA。紫外檢測 RNA濃度和純度,用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA完整性。DNaseⅠ(TaKaRa)去除基因組DNA,利用SMART?RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)合成 cDNA 第一鏈,用做全長cDNA 3′和5′端序列快速擴增的模板。

1.4 Ec-vasa基因片段cDNA克隆

根據(jù) GenBank公布的羅氏沼蝦(DQ339110),日本沼蝦(HQ385220),擬穴青蟹(GU187045),凡納濱對蝦(DQ095772)vasa基因 cDNA 序列,使用DNAMAN在其保守區(qū)設(shè)計簡并引物V-F、V-R(表1)。以脊尾白蝦卵巢cDNA為模板,采用25μl PCR反應體系:TaKaRa Taq(5U/μl),0.25μl;10×PCR Buffer,2.5μl;MgCl2(25mmol/L), 1.5μl;dNTP Mixture(10mmol/ L)(TaKaRa),0.5μl;模板 cDNA,1μl;引物,各2.5μl;ddH2O補足25μl,置于PCR儀中進行擴增。擴增條件:94°C 5min;94°C 30s,58°C 45s,72°C 1min,30個循環(huán);72°C 10min;4°C保溫。2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,膠回收目的片段,連接pMD18-T(TaKaRa)載體,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 Top10,藍白斑篩選陽性克隆經(jīng)菌落 PCR初步鑒定后由上海生工測序。

1.5 5′ RACE 和 3′ RACE

以獲得的Ec-vasa基因片段為模板,使用Primer 5.0軟件設(shè)計用于3′和5′端RACE所需的引物(表1)。使用上述合成的 cDNA第一鏈為模板,分別用引物Ec-vasa3′和Ec-vasa5′與試劑盒所帶通用引物Universal Primer(UPM)配對,并按照 SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit推薦的反應體系和反應條件進行Ec-vasa基因3′和5′端基因序列的擴增。PCR擴增產(chǎn)物的純化、克隆、測序與Ec-vasa基因片段的克隆方法相同。

1.6 序列拼接與生物信息學分析

利用DNAStar軟件SeqMan程序?qū)y序結(jié)果進行載體序列的去除和拼接。將所得序列提交至 NCBI BLAST程序進行序列比對(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/),利用 DNAStar軟件 EditSeq程序進行開放閱讀框(ORF)的預測。使用DNAMAN軟件進行氨基酸翻譯以及脊尾白蝦和它物種的 VASA氨基酸序列的多重比對。蛋白質(zhì)分子質(zhì)量和等電點(PI)分析使用 PI/Mw(http://us.expasy.org/ tools/pi_tool.html)。利用MEGA 5.0軟件(Saitouet al,1987;Tamuraet al,2011)構(gòu)建Neighbor-Joining(NJ)系統(tǒng)樹。

圖1 脊尾白蝦卵巢發(fā)育周期組織切片F(xiàn)ig.1 Histological photomicrographs of the ovary in Exopalaemon carinicauda

1.7 半定量RT-PCR

采集雌性性腺發(fā)育脊尾白蝦卵巢、血細胞、腮、肝胰腺、肌肉、腸、胃和心臟8種組織,提取各組織中的總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以18sRNA基因作為內(nèi)參,來檢測vasa基因在脊尾白蝦不同組織中的表達(引物Ec-vasa-F、Ec-vasa-R、18S-F、18S-R 序列如表1所示)。擴增條件為 94°C 2min;94°C 30s,55°C 45s,72°C 30s,23個循環(huán);72°C 延伸 10min。PCR 擴增產(chǎn)物用 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外凝膠分析。用ImageJ軟件計算條帶亮度以檢測相對表達量。

1.8 實時熒光定量RT-PCR

按照上述1.4部分的方法分別提取脊尾白蝦每一階段(I～V)卵巢的總 RNA,反轉(zhuǎn)錄為 cDNA,使用Ec-vasa基因特異引物Ec-vasa-F、Ec-vasa-R和內(nèi)參基因18sRNA特異引物18S-F、18S-R(表1),采用7500 Sequence Detection System進行實時熒光定量 PCR,擴增體系為 20μl,包括:SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×)(TaKaRa),10μl;Ec-vasa-F(10μmol/L),0.8μl;Ec-vasa-R(10μmol/L),0.8μl;ROX Reference Dye(50×),0.4μl;cDNA 模板,2.0μl;焦碳酸二乙酯(DEPC)水(Solarbio),6.0μl。反應條件:95°C 30s;95°C 5s,60°C 34s,40 個循環(huán);95°C 15s,60°C 1min,95°C 15s。實驗中每6只的同一階段卵巢組織混合作為一個樣品,數(shù)據(jù)為3個重復的平均值±標準差,采用 2-ΔΔCT法計算數(shù)據(jù),用 SPSS17.0軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 Ec-vasa cDNA全長序列

克隆得到Ec-vasa(GenBank登錄號:JX122493) cDNA序列全長2516bp,其中5′非編碼區(qū) 77bp,3′非編碼區(qū) 636bp,開放閱讀框1800bp,編碼600個氨基酸,預測其分子量為 65.6kDa,等電點為 5.17。推導的氨基酸序列中包含DEAD-box家族特有的10個保守序列中的8個:AQTGSGKT(MotifⅠ),PTRELA(motif Ia),TIGR(motif Ib),DEAD(motifⅡ),SAT(motif Ⅲ),LVFVE(motif Ⅳ),TAVAARGLD(motifⅤ),HRIGRTGR(motif Ⅵ),此外還有動物VASA蛋白保守序列 GG重復序列,在 N′端具有 7個RG重復序列和1個RGG重復序列,并且發(fā)現(xiàn)了一個鋅指結(jié)構(gòu)(CCHC)(圖2)。

2.2 序列分析和系統(tǒng)進化分析

Blast分析氨基酸序列結(jié)果顯示Ec-vasa與日本沼蝦的同源性最高,為80%,與凡納濱對蝦和中國明對蝦同源性同為58%,與斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)同源性57%。利用DNAMAN將脊尾白蝦 VASA與其他物種VASA氨基酸序列多重對比。結(jié)果顯示,脊尾白蝦 VASA蛋白與其它甲殼類同源蛋白具有多個高度保守區(qū)域(圖3)。

利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建的基于VASA氨基酸序列的 NJ系統(tǒng)樹顯示,脊尾白蝦首先與日本沼蝦聚為一支,然后依次為日本囊對蝦、凡納濱對蝦、中國明對蝦和斑節(jié)對蝦。位于下方的PL10和P68分支表明本實驗克隆獲得的基因確為vasa基因(圖4)。

2.3 Ec-vasa的組織表達模式

利用半定量 RT-PCR方法研究了Ec-vasamRNA在性成熟脊尾白蝦各組織中的表達模式,結(jié)果顯示:Ec-vasamRNA在脊尾白蝦卵巢中特異表達,且表達量豐富,在肌肉、肝胰腺、心臟和鰓等組織中均沒有表達,18sRNA作為陽性對照,在所有組織中均有表達(圖5)。

圖2 Ec-vasa cDNA全長的核苷酸序列和推導的氨基酸序列Fig.2 Nucleic acid sequence and deduced amino acid sequence of Ec-vasa

圖3 脊尾白蝦VASA蛋白氨基酸序列的多重比對Fig.3 Multiple alignment of the deduced amino acid sequences among the VASA proteins from Exopalaemon carinicauda

表1 脊尾白蝦vasa克隆和mRNA表達研究所用引物Tab.1 Primers used for E.carinicauda vasa cloning and mRNA expression analysis

圖4 脊尾白蝦VASA蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic analysis of the VASA proteins from Exopalaemon carinicauda

圖6中的數(shù)據(jù)為3個重復的平均值±標準差，從中可以看出卵巢發(fā)育Ⅰ期Ec-vasa基因的表達量最高,相對表達量(vasa/18S)的平均值為 3.9014,到了Ⅱ期表達量下降顯著(P＜0.01),相對表達量平均值為1.6518。隨著卵巢的發(fā)育,表達量呈逐漸降低趨勢,在Ⅳ期達到最低水平,相對表達量平均值為0.5841。Ⅴ期表達量略回升,與Ⅳ期相比較差異不顯著。

圖5 RT-PCR分析Ec-vasa在性成熟雌性脊尾白蝦各組織的分布Fig.5 Tissue distribution of vasa detected in adult female E.carinicauda by RT-PCR

圖6 Ec-vasa在卵巢發(fā)育周期中的表達水平Fig.6 Expression of Ec-vasa detected by real-time RT-PCR in the ovary during the development cycle

3 討論

本實驗通過 cDNA克隆成功獲得脊尾白蝦Ec-vasa全長 cDNA序列,開放閱讀框 1800bp;推導出的氨基酸序列與日本沼蝦的同源性最高(80%),含有 DEAD蛋白家族 10個保守序列中的 8個:AQTGSGKT序列位于VASA蛋白質(zhì)N端第198-205位對應ATP-A結(jié)構(gòu)域,是與ATP酶和解旋酶活性密切相關(guān)的ATP結(jié)合位點;DEAD序列位于312-315位,對應的ATP-B結(jié)構(gòu)域是ATP水解位點,在VASA、PL10和 P68三大亞蛋白家族中均保守存在(Pauseet al,1992);SAT保守區(qū)被認為與ATP水解有關(guān);RGLD和HRIGRTGR保守區(qū)是具有RNA結(jié)合和解旋活性的部位;PTRELA保守區(qū)雖然不直接參與ATP結(jié)合和水解作用,但卻在RNA與RGLD、HRIGRTGR兩個結(jié)構(gòu)域的結(jié)合中發(fā)揮關(guān)鍵性作用(周倩如等,2007);此外 GG重復序列參與 elF4A因子的蛋白間相互作用(Cordinet al,2006;Benzet al,1999)。VASA蛋白特有的鋅指結(jié)構(gòu)(CCHC框)可能參與核酸的結(jié)合,該結(jié)構(gòu)重復的次數(shù)和結(jié)構(gòu)與靶 RNA分子的特異性有關(guān)(Sagawaet al,2005)。N末端具有7個RG重復序列和一個RGG序列。上述含有的多個重復序列的甘氨酸富集區(qū)(G-rich region)與單鏈核酸的結(jié)合有關(guān),而這正是RNA解旋酶的重要特征(唐良華等,2012)。這些保守序列在脊尾白蝦VASA蛋白中均被發(fā)現(xiàn),充分證明此基因為vasa同源基因。vasa在進化上非常保守,這些保守的序列和結(jié)構(gòu)可能對于維持 VASA蛋白的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。

Ec-vasa基因在卵巢組織中特異表達,在肌肉、肝胰腺、心臟和鰓等組織中均沒有表達。這一結(jié)果與vasamRNA僅在兩性生殖細胞中存在較高水平表達,但在其他組織中幾乎檢測不到其表達信號的情況相符(張遠青等,2012;Zhouet al,2010;Wanget al,2013;胡重江等,2008)。上述結(jié)果暗示Ec-vasa基因是一種有效的分子標記物,可用于研究脊尾白蝦卵巢發(fā)育過程。熒光定量 PCR分析顯示,隨著卵巢的發(fā)育,Ec-vasa表達量呈逐漸降低趨勢,這與它在中華卵索線蟲,中國對蝦,中華絨螯蟹等多個物種的性腺成熟過程中的表達量逐漸減弱的變化規(guī)律相同(任爽等,2011;Zhouet al,2010;Wanget al,2013)。

結(jié)合卵巢組織學分析(圖1),在Ec-vasa基因表達量最高的發(fā)育Ⅰ期,卵巢主要由卵原細胞組成,細胞處于增殖狀態(tài)。隨著卵巢的發(fā)育表達量逐漸降低,Ⅱ期(小生長期)和Ⅲ期(大生長期)的卵巢分別主要由初級卵母細胞、卵黃合成前期卵母細胞和卵黃合成中期卵母細胞組成。在卵巢發(fā)育Ⅳ期(成熟期)表達量達到最低水平,此時的卵巢主要由成熟的卵母細胞組成。有研究表明在黑脊倒刺鲃卵子發(fā)生過程中,vasamRNA在卵原細胞中陽性信號最強,而在隨后各時相的卵母細胞中,vasamRNA的雜交信號明顯減弱(唐良華等,2012)。此外,日本沼蝦Mn-vasa基因在卵黃發(fā)生前期、卵黃發(fā)生早期和中期的卵母細胞細胞質(zhì)中被檢測到,而在卵黃積累末期卵母細胞中沒有信號(朱小玲,2010)。即在早期的卵母細胞中表達,隨著卵母細胞的成熟,表達越來越弱,直至檢測不到信號,這些都與本研究實驗結(jié)果呈現(xiàn)的規(guī)律相近似。在海膽(Strongylocentrotus intermedius)(楊曉飛等,2010),銀鯽(Xuet al,2005),金魚(陳云貴等,2005),南方鲇(胡重江等,2008),半滑舌鰨(張遠青等,2012)等物種中也均證明了這一規(guī)律。造成這一現(xiàn)象的原因可能是卵細胞中大量卵黃的出現(xiàn),以至vasamRNA的濃度下降(朱小玲,2010);與此同時,vasamRNA的轉(zhuǎn)錄速度也可能下降并逐漸中止(唐良華等,2012)。在本研究中,卵巢發(fā)育Ⅴ期(恢復期)成熟卵細胞排出,卵巢恢復初始狀態(tài),此時卵巢內(nèi)重新以卵原細胞為主,解釋了卵巢發(fā)育Ⅴ期表達量出現(xiàn)回升現(xiàn)象的原因。最終,存在于成熟卵子中的vasamRNA,作為母源性遺傳物質(zhì),通過受精卵被帶入新生的個體中。大量研究表明 VASA蛋白對于生殖細胞的形成和卵子極性的建立以及某些發(fā)育基因的 mRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控都具有重要作用(Laskoet al,1988;Styhleret al,1998)。

本研究獲得了脊尾白蝦的全長vasacDNA,為從分子水平研究脊尾白蝦 PGC的起源、遷移和分化提供可靠的分子標記。結(jié)果表明,vasa基因可能在脊尾白蝦卵巢發(fā)育的調(diào)控過程中起著關(guān)鍵作用;作為一種母源性基因,vasa基因還可能與子代原始生殖細胞的形成、遷移、分化等發(fā)育過程密切相關(guān),其中相關(guān)的調(diào)控機制還有待于進一步的研究。

王緒峨,1989.脊尾白蝦早期胚胎發(fā)育以及溫、鹽度與其孵化的關(guān)系.水產(chǎn)學報,13(1):59—64

朱小玲,2010.日本沼蝦DEAD-box家族基因vasa和PL10的克隆及其在卵巢發(fā)育過程中的表達.海洋漁業(yè),32(2):132—140

任 爽,陳 沖,劉緒生等,2011.中華卵索線蟲vasa基因的克隆及其表達模式分析.植物保護學報,38(4):333—338

呂道遠,宋 平,陳云貴等,2005.黃鱔性腺自然逆轉(zhuǎn)過程中vasa基因的表達分析.動物學報,51(3):469—475

陳云貴,葉 鼎,宋 平等,2005.金魚配子發(fā)生中vasa基因的表達和分布特征.動物學研究,26(2):179—183

張鳳英,馬凌波,蔣科技等,2010.擬穴青蟹vasa基因 cDNA的特征分析與性腺特異表達.海洋漁業(yè),32(4):361—367

張遠青,溫海深,何峰等,2012.半滑舌鰨Vasa基因cDNA克隆及其在繁殖周期的表達.水產(chǎn)學報,36(1):1—8

楊曉飛,常亞青,姜玉聲等,2010.蝦夷馬糞海膽(Strongylocentrotus intermedius)Vasa基因的克隆與表達.生物技術(shù)通報,12:142—166

楊筱珍,王金峰,楊麗娜等,2009.日本新糠蝦(Neomysis japonica)巢發(fā)育與卵子發(fā)生.海洋與湖沼,40(3):338—346

周倩如,邵明瑜,張志峰,2007.vasa基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征和應用展望.海洋湖沼通報,04:129—134

胡重江,吳風瑞,劉智皓等,2008.南方鲇Vasa基因兩種亞型cDNA的克隆及其表達.動物學報,54(6):1051—1060

唐良華,蘇 敏,呂博彥等,2012.黑脊倒刺鲃vasa同源基因的克隆及表達分析.水產(chǎn)學報,36(6):869—878

顏素芬,姜永華,2009.中國龍蝦卵子發(fā)生及卵巢發(fā)育的組織學研究.海洋科學,33(6):12—17

Aflalo ED,Bakhrat A,Raviv Set al,2007.Characterization of avasa-like gene from the pacific white shrimpLitopenaeus vannameiand its expression during oogenesis.Mol Reprod Dev,74(2):172—177

Benz J,Trachsel H,Baumann U,1999.Crystal structure of ATPase domain of translation initiation factor eIF4A from Saccharomyces cerevisiae-the prototype of the DEAD box protein family Structure.Folding and Design,7:671—679

Cordin O,Banroques J,Tanner NKet al,2006.The DEAD-box protein family of RNA helicases.Gene,367:17—37

Feng Z F,Zhang Z F,Shao M Yet al,2011.Developmental expression pattern of theFc-vasa-likegene,gonadogenesis and development of germ cell in Chinese shrimp,Fenneropenaeus chinensis.Aquaculture,314:202—209

Krvel A V,Olsen L C,2004.Sexual dimorphic expression pattern of a splice variant of zebrafishvasaduring gonadal development.Developmental Biology,271(1):190—197

Kobayashi T,Kajiura-Kobayashi H,Nagahama Y,2000.Differential expression ofvasahomologue gene in the germ cells during oogenesis and spermatogenesis in a teleost fish,tilapia,Oreochromis niloticus.Mechanisms of Development,99(1—2):139—142

Linder P,Lasko P F,Ashburner Met al,1989.Birth of the D-E-A-D box.Nature,337:121—122

Li C J,Liu L,2010.Identification of avasahomologue gene in grass carp and its expression pattern in tissues and during embryogenesis.CBP Part B:Biochemistry＆Molecular Biology,157(2):159—166

Lasko PF,Ashburner M,1988.The product of the Drosophila gene vasa is very similar to eukaryotic initiation factor-4A.Nature,335:611—617

Linder P,Lasko P F,Ashburner Met al,1989.Birth of the D-E-A-D box.Nature,337(6203):121—122

Nakkrasae L I,Damrongphol P,2007.Avasa-like gene in the giant freshwater prawn,Macrobrachium rosenbergii.Mol Reprod Dev,74(7):835—842

Otani S,Maegawa S,Inoue Ket al,2002.The germ cell lineage identified byvasa-mRNA during the embryogenesis in goldfish.Zoological Science,19(5):519—526

Pause A,Sonenberg N,1992.Mutational analysis of a DEAD box RNA helicase:The mammalian translation initiation factor eIF-4A.EMBO Journal,11(7):2643—2654

Qiu G F,Chen Y,Cui Zet al,2013.Localization of germline marker vasa homolog RNA to a single blastomere at early cleavage stages in the oriental river prawnMacrobrachium nipponense:Evidence for germ cell specification by preformation.Gene,2013 513:53—62

Rocak S,Linder P,2004.DEAD-box proteins:the driving forces behind RNA metabolism.Nature Reviews Molecular Cell Biology,5(3):232—241

Raghuveer K,Senthilkumaran B,2012.Cloning and differential expression pattern ofvasain the developing and recrudescing gonads of catfish,Clarias gariepinus.CBP Part A:Molecular＆Integrative Physiology,157(1):79—85

Schüpbach T,Wieschaus E,1986.Germline autonomy of maternal-effect mutations altering the embryonic body pattern of Drosophila.Developmental Biology,113(2):443—448

Schüpbach T,Wieschaus E,1986.Maternal-effect mutations altering the anterior-posterior pattern of the Drosophila embryo.Development Genes and Evolution,195(5):302—317

Sellars M J,Lyons R E,Grewe Met al,2007.A PL10vasa-like gene in the kuruma shrimp,Marsupenaeus japonicus,expressed during development and in adult gonad.Marine Biotechnol ,2007,9(3):377—387

Styhler S,Nakamura A,Swan Aet al,1998.Vasais required for GURKEN accumulation in the oocyte,and is involved in oocyte differentiation and germline cyst development.Development,125:1569—1578

Saitou N,Nei M,1987.The neighbor-joining method:A new method for reconstructing phylogenetic trees.Mol Biol Evol,4:406—425

Sagawa K,Yamagata H,Shiga Y,2005.Exploring embryonic germ line development in the water flea,Daphnia magna,by zinc-finger-containingvasaas a marker.Gene Expression Patterns,5(5):669—678

Tamura K,Peterson D,Peterson Net al,2011.MEGA 5:Molecular evolutionary genetics analysis using mximum likelihood,evolutionary distance,and maximum parsimony methods.Mol Biol Evol,28(10):2731—2739

Tanner N K,Linder P,2001.DexD/H box RNA helicases:from generic motors to specific dissociation functions.Molecular Cell,8:251—262

Xu H,Gui J,Hong Y,2005.Differential expression of vasa RNA and protein during spermatogenesis and oogenesis in the gibel carp(Carassius auratus gibelio),a bisexually and gynogenetically reproducing vertebrate.Development Dynamics,233(3):872—882

Xu H Y,Peng J X,Gui J Fet al,2005.Gibel carp germ cell marker Vasa:cDNA cloning and its antibody preparation.Acta Zoologica Sinica,51(4):732—742

Wang Q,Fang D A,Sun J Let al,2013.Characterization of thevasagene in the Chinese mitten crabEriocheir sinensis:A germ line molecular marker.Journal of Insect Physiology,9(4):377—524

Yoon C,Kawakami K,Hopkins N,1997.Zebrafishvasahomologue RNA is localized to the cleavage planes of 2-and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells.Development,124(16):3157—3165

Zhou Q R,Zhang Z F,Shao M Yet al,2010.Cloning,characterization and expression analysis of the DEAD-box family genes,Fc-vasaandFc-PL10a,in Chinese shrimp(Fenneropenaeus chinensis).Chinese Journal of Oceanology and Limnology,28(1):37—45