氟苯尼考在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)疾病模型內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)*

趙青松 金 珊 陳寅兒 秦方錦 王錫波 王國(guó)良

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波 315211)

氟苯尼考(florfenicol)屬于酰胺醇類(lèi)抗生素,為廣譜抑菌劑,對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌及支原體等有抑制作用,是我國(guó)當(dāng)前畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用較為廣泛的抗菌藥物之一(Samuelsenet al,1998;Stefanet al, 2004;徐力文等,2005;楊倩等,2010;黃緒玲等,2011;楊紅初等,2012)。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外已有氟苯尼考在虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、大黃魚(yú)(Pseudosciaena crocea)、鱈魚(yú)(Gadus morhua)、大西洋鮭(Salmo salar)、西伯利亞鱘(Acipenser baeri)、歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla)、鲇魚(yú)(Silurus asotus)、異育銀鯽(Crucian carp)、中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)、克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)、南美白對(duì)蝦(Penaeus vannamei Boone)、中華鱉(Pelodiscus sinensis)等多種水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)及組織分布的報(bào)道(李靜云等,2004;Parket al,2006;楊倩等,2010;黃緒玲等,2011;王瑞雪等,2012) ,但至今未見(jiàn)其在蟹類(lèi)體內(nèi)代謝過(guò)程的有關(guān)資料。

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是中國(guó)海水養(yǎng)殖的主導(dǎo)品種之一,也是浙江省水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要品種。但由于高密度養(yǎng)殖,使得疾病頻發(fā),特別是由弧菌屬細(xì)菌引起的疾病,發(fā)病率一直居高不下(林克文,2002;王國(guó)良等,2006)。目前水產(chǎn)弧菌性疾病的防治仍是以藥物為主,而漁業(yè)用藥大都參考畜禽或健康水產(chǎn)動(dòng)物的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù),這與生產(chǎn)實(shí)際情況存在較大差異。因此,為探明疾病對(duì)氟苯尼考在三疣梭子蟹體內(nèi)代謝規(guī)律的影響,本研究在構(gòu)建三疣梭子蟹溶藻弧菌疾病模型的基礎(chǔ)上(張櫻等,2010),比較研究了健康和疾病條件下氟苯尼考在三疣梭子蟹體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)及組織分布,以期為三疣梭子蟹合理用藥和休藥期的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

三疣梭子蟹(P.trituberculatus)購(gòu)于寧波莊市梭子蟹暫養(yǎng)場(chǎng),體質(zhì)量(90±25)g,共 220只,購(gòu)回后于實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng),養(yǎng)殖用水采用海水晶配置,鹽度25±1,水溫(21±2)°C,pH 8.0±0.5。確定待檢測(cè)蟹各組織沒(méi)有藥物殘留后,挑選活潑健康個(gè)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為15d,實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)充氣,每日換水50%,不投餌。

1.2 藥品及試劑

抗凝劑(檸檬酸鈉 8g/L,葡萄糖 20g/L,EDTA 3.36g/L,吐溫 80 100μL/L);氟苯尼考原料藥(含量10%,河南大明實(shí)業(yè)有限公司);氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品(含量99.2%,中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)。

1.3 主要儀器

Agilent Technologies1200型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司),包括G1311A四元泵、G1314B紫外檢測(cè)器、G1311A柱溫箱、Chemstation色譜工作站、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣裝置等;R206D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.4 溶藻弧菌疾病模型的構(gòu)建

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)由寧波大學(xué)海洋學(xué)院水產(chǎn)病害研究室提供。三疣梭子蟹溶藻弧菌疾病模型采用張櫻等(2010)方法構(gòu)建。

1.5 給藥及采樣(余開(kāi)等,2011)

以 25mg/kg劑量的氟苯尼考水溶劑分別對(duì)健康和患病三疣梭子蟹口灌給藥,無(wú)回吐個(gè)體用于實(shí)驗(yàn)。在給藥后 0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120、168、240h采集血淋巴、肝胰腺和肌肉樣品。血淋巴與抗凝劑 1︰1混均后,4°C離心10min(3000r/min),收集上層血漿;肝胰腺和肌肉分裝于樣品袋中,所有樣品保存在–20°C冰箱。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取5只蟹,實(shí)驗(yàn)前取健康蟹組織做對(duì)照。

1.6 樣品前處理

自然解凍樣品后,準(zhǔn)確取0.5mL血漿、0.5g經(jīng)高速均質(zhì)的肌肉和肝胰腺組織勻漿,加入 4mL的乙酸乙脂,在漩渦振蕩器上旋渦混勻 5min,4°C離心10min(6000r/min),取上層提取液至20mL離心管中。同法重復(fù)提取一次,合并兩次提取液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中45°C水浴蒸干后,加入1mL流動(dòng)相,渦旋振蕩2min溶解殘存物,用0.45μm有機(jī)針頭濾器過(guò)濾,–20°C保存于樣品瓶中,高效液相色譜儀(HPLC)待測(cè)。其中,組織樣品提取液中加入適量正己烷用于溶解脂肪。

1.7 色譜條件

色譜柱:Diaimonsil TM–C18柱(150mm×16mm i.d.,填料粒度5μm);流動(dòng)相:乙腈︰蒸餾水= 27:73(v/v),使用前用0.45μm微孔濾膜真空抽濾并超聲脫氣;流速:1.0mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):223nm;柱溫:30°C;pH 7.0;進(jìn)樣量:20μL。

1.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)限

采用外標(biāo)法測(cè)定。用流動(dòng)相把氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品配制成 100μg/mL儲(chǔ)備液,于–20°C避光保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)將儲(chǔ)備液稀釋成10、5、2、1、0.5、0.05μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行HPLC測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo),藥物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)后,按信噪比 S/N=2計(jì)算最低檢測(cè)限(LOD)。

1.9 回收率和精密度

采用加樣回收法。在適量的空白肌肉、血漿和肝胰腺中分別加入氟苯尼考儲(chǔ)備液并稀釋成0.5、1、5μg/mL(μg/g)系列理論濃度,按1.6方法進(jìn)行提取和測(cè)定,每個(gè)濃度重復(fù)3次。相對(duì)回收率(%)=樣品實(shí)測(cè)濃度/樣品理論濃度×100%。將以上3個(gè)組織空白樣品的3個(gè)濃度于1d內(nèi)的3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)重復(fù)進(jìn)行測(cè)試,并連續(xù)測(cè)定3d,計(jì)算各組織中氟苯尼考的日內(nèi)平均變異系數(shù)和日間平均變異系數(shù)。

1.10 數(shù)據(jù)處理

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程采用Microsoft Excel 2003軟件分析;藥時(shí)數(shù)據(jù)用3P97藥動(dòng)學(xué)軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)限

氟苯尼考的標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.05—10μg/mL質(zhì)量濃度(X)之間與平均峰面積(Y)具有良好的相關(guān)性,線性回歸方程為Y＝32.51X+0.79,相關(guān)系數(shù)R2＝1。按信噪比S/N=2計(jì)算,本方法最低的檢測(cè)限是0.025μg/mL。

2.2 回收率與變異系數(shù)

氟苯尼考在三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉、血漿三種組織中的回收率分別為(84.8±1.6)%、(88.0±8.9)%、(94.2±2.0)%,均大于80%;而在肝胰腺、肌肉、血漿三種組織中的日內(nèi)變異系數(shù)分別為2.63、2.18、2.54,日間變異系數(shù)分別為3.67、3.23、4.61,均小于5%,說(shuō)明用本實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)氟苯尼考,回收率高而穩(wěn)定。

2.3 氟苯尼考在健康和患病三疣梭子蟹三種組織中的濃度-時(shí)間變化

氟苯尼考在健康和患病蟹肝胰腺、肌肉和血漿三種組織中的藥時(shí)曲線見(jiàn)圖1—3。結(jié)果表明,氟苯尼考在健康和患病蟹相同組織中的代謝規(guī)律相似,給藥0.25h時(shí),兩組蟹三種組織中均可檢測(cè)到藥物的存在,且在肝胰腺中已達(dá)峰值,分別為6.85μg/g和3.32μg/g;隨后肝胰腺中的藥物濃度均顯著下降,實(shí)驗(yàn) 2h時(shí)分別已降至峰值的 15.16%和 33.21%;此后肝胰腺中的藥物濃度保持在一定水平,至實(shí)驗(yàn) 12h時(shí)分別出現(xiàn)第二個(gè)藥峰,健康組為 3.23μg/g,患病組為1.64μg/g。而肌肉和血漿中的藥物吸收和消除情況與肝胰腺明顯不同,實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后藥物濃度逐漸上升,健康組肌肉和血漿均于實(shí)驗(yàn) 2h時(shí)達(dá)峰,而患病組肌肉和血漿分別于實(shí)驗(yàn)2h和4h達(dá)峰,其后逐漸下降。實(shí)驗(yàn)24h后,各組織藥物消除速率均趨緩,健康組和患病組分別在實(shí)驗(yàn)168h和240h時(shí)藥物濃度基本維持在0.1μg/mL以下,98.6%以上的藥物被代謝、轉(zhuǎn)移或排泄出機(jī)體。

圖1 氟苯尼考在三疣梭子蟹肝胰腺中的藥時(shí)曲線Fig.1 Change of florfenicol concentration with time in hepatopancreas of P.trituberculatus

圖2 氟苯尼考在三疣梭子蟹肌肉中的藥時(shí)曲線Fig.2 Change of florfenicol concentration with time in muscle of P.trituberculatus

圖3 氟苯尼考在三疣梭子蟹血漿中的藥時(shí)曲線Fig.3 Change of florfenicol concentration with time in plasma of P.trituberculatus

2.4 氟苯尼考在健康和患病三疣梭子蟹三種組織中的藥動(dòng)學(xué)特征

健康和患病蟹三種組織中的藥時(shí)數(shù)據(jù)經(jīng)3P97藥動(dòng)學(xué)軟件分析后顯示,氟苯尼考在三種組織中的代謝規(guī)律均可用帶時(shí)滯的一級(jí)吸收二室開(kāi)放模型來(lái)描述。藥動(dòng)學(xué)方程和參數(shù)分別見(jiàn)表1和表2。與健康組相比,患病蟹肝胰腺藥物消除半衰期(T1/2β)、總體清除率(CLs)、表觀分布容積(Vd),肌肉藥物吸收半衰期(T1/2Ka)、達(dá)峰時(shí)間(Tpeak)、藥峰濃度(Cmax)、CLs、Vd,血漿藥物吸收速率常數(shù)Ka、T1/2Ka、T1/2β、Tpeak、Vd等藥動(dòng)學(xué)參數(shù)均發(fā)生了顯著的變化(P＜0.05);而肝胰腺 Ka、T1/2Ka、Tpeak、Cmax、藥時(shí)曲線下總面積 AUC,肌肉Ka、T1/2β、AUC,血漿AUC、CLs等藥動(dòng)學(xué)參數(shù)均發(fā)生了極顯著的變化(P＜0.01)。

表1 氟苯尼考在健康和患病三疣梭子蟹組織內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)方程Tab.1 Equations of florfenicol concentration with time in healthy and diseased P.trituberculatus

表2 氟苯尼考在健康和患病三疣梭子蟹體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab.2 Pharmacokinetic parameters of florfenicol in healthy and diseased P.trituberculatus

3 討論

氟苯尼考在健康和患病三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉、血漿三種組織中的藥時(shí)曲線和藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)顯示,健康和患病三疣梭子蟹三種組織對(duì)氟苯尼考的滲透性良好,吸收迅速;給藥后 0.25h三種組織中都已檢測(cè)到氟苯尼考,但以肝胰腺藥物濃度達(dá)峰最快并有二峰現(xiàn)象,肌肉次之,血漿最晚。這一現(xiàn)象與畜禽(蔣紅霞,2001;胡頂飛等,2002;劉帥帥等,2012)及魚(yú)類(lèi)(Parket al,2006;王偉利等,2010;林茂等,2011;王瑞雪等,2012;葛建,2012)等的藥物代謝特征不同,但與余開(kāi)等(2011)、唐俊等(2006)等研究的藥物在三疣梭子蟹和中華絨螯蟹體內(nèi)的代謝及鄭重鶯等(2007)研究氟苯尼考在南美白對(duì)蝦體內(nèi)的代謝特征類(lèi)同。由于蟹類(lèi)的消化系統(tǒng)構(gòu)造與魚(yú)類(lèi)等略有不同,其胃內(nèi)有肝孔與肝胰腺相通,肝胰腺可以很快對(duì)藥物進(jìn)行吸收、代謝轉(zhuǎn)化并向血淋巴、肌肉等組織轉(zhuǎn)移,而由于腸道也可吸收部分藥物,且蟹為開(kāi)管式循環(huán)系統(tǒng),因此造成了血淋巴藥物濃度達(dá)峰稍晚,肝胰腺藥物濃度出現(xiàn)二峰的現(xiàn)象(余開(kāi)等,2011;唐俊等,2006)。

據(jù)報(bào)道,疾病會(huì)造成動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞、組織、器官的形態(tài)改變和生理功能障礙,從而影響藥物在動(dòng)物體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄等過(guò)程(Baggot,1980)。Uno(1996)研究表明土霉素在患弧菌病香魚(yú)體內(nèi)的生物利用度會(huì)顯著下降;劉彥等(2006)和余開(kāi)等(2011)分別在牙鲆和梭子蟹對(duì)藥物的代謝研究中發(fā)現(xiàn),細(xì)菌感染會(huì)導(dǎo)致藥物在機(jī)體主要組織中的代謝規(guī)律明顯改變,藥物的吸收、分布和消除減慢;此外,其他學(xué)者在研究山羊(劉滌潔等,2003)、雞(張秀英,2001;黃顯會(huì)等,2003)、豬(曾振靈等,1996)等動(dòng)物對(duì)藥物的代謝時(shí)也證實(shí),患病情況下動(dòng)物對(duì)藥物的吸收速度明顯減慢,吸收量下降,消除延緩。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,氟苯尼考在健康蟹和患病蟹相同組織中的藥時(shí)曲線形態(tài)相似,代謝過(guò)程均可用帶時(shí)滯的一級(jí)吸收二室開(kāi)放模型來(lái)描述,這與劉彥等(2006)和黃顯會(huì)等(2003)的研究結(jié)論基本一致。與健康蟹相比,患病蟹三種組織對(duì)氟苯尼考的吸收速度和吸收率明顯下降,半衰期顯著延長(zhǎng),清除率顯著下降,藥時(shí)曲線下總面積和表觀分布容積變大,說(shuō)明弧菌感染已對(duì)三疣梭子蟹主要組織器官造成了損害,特別是肝胰腺發(fā)生了功能性障礙,肝代謝轉(zhuǎn)化酶活性下降,藥物不可逆消除減慢。此外,本實(shí)驗(yàn)中感染蟹Vd的增大,也說(shuō)明病理狀態(tài)能降低藥物與血漿蛋白的結(jié)合率,使其在組織中分布更加廣泛,有利于疾病的治療(蘇成業(yè),2003)。若以國(guó)家動(dòng)物性食品中氟苯尼考最高殘留限量 0.1mg/kg為標(biāo)準(zhǔn),從圖1—3可看出,健康蟹和感染蟹給藥后分別需168h和240h,三種組織中的氟苯尼考含量才會(huì)下降到0.1mg/kg以下,因此,建議三疣梭子蟹口服氟苯尼考的休藥期應(yīng)在10d以上。

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