養(yǎng)殖鱘魚出血癥病原魯氏耶爾森菌的分離鑒定和致病性研究*

李紹戊 王 荻 馮 娟 盧彤巖①

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所 哈爾濱 150070;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 廣州 510300;3.農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510300)

鱘魚(Acipenseriformes)屬世界性保護(hù)物種(謝忠明等,2002)。隨著鱘魚養(yǎng)殖關(guān)鍵技術(shù)的完善,鱘魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)得到快速發(fā)展。我國(guó)試養(yǎng)的鱘多達(dá)十幾種,目前形成規(guī)模養(yǎng)殖的種類主要有施氏鱘(Acipenser schrenckii)、西伯利亞鱘(Acipenser baerii)、鱘鰉雜交(Huso dauricus♀×Acipenser schrenckii♂)和 匙 吻 鱘(Polyodon spathula),約占鱘養(yǎng)殖總產(chǎn)量的 90%以上(孫大江等,2011)。但受到集約化程度快速提高、養(yǎng)殖水體污染嚴(yán)重、病害防治技術(shù)落后等諸多因素影響,養(yǎng)殖鱘魚爆發(fā)性疾病日趨嚴(yán)重,給生產(chǎn)及科研工作造成巨大損失和困擾(田甜等,2012)。

水產(chǎn)動(dòng)物耶爾森菌病(yersiniosis)是由腸桿菌科耶爾森菌屬的魯氏耶爾森菌(Yersinia ruckeri)引起的,該菌可導(dǎo)致鮭鱒魚類發(fā)生腸炎紅嘴病(enteric redmouth,ERM),其主要癥狀為體表(尤其是頭、嘴、鰓蓋等部位)充血、腸道腫脹發(fā)炎等(Furoneset al,1993;Tobbacket al,2007)。研究表明,魯氏耶爾森菌主要為冷水性鮭鱒魚類的病原菌,但同樣感染其他魚類如鰱、鳙、鰻、金魚、鯉魚、鱘魚和羅非魚等,并導(dǎo)致魚類細(xì)菌性敗血癥,可同其他革蘭氏陰性菌如嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌等混合感染(Bercet al,1999;Danleyet al,1999;Eissaet al,2008)。在國(guó)內(nèi),徐伯亥等(1991)、范芳玲等(2010)先后報(bào)道了由魯氏耶爾森菌引起的魚類細(xì)菌性敗血癥,病魚體表多處出血,內(nèi)臟伴有不同程度的發(fā)炎、充血。Vuillaume等(1987)首次從西伯利亞鱘中分離到魯氏耶爾森菌,病魚表現(xiàn)為嘴部、下頜、胸鰭及泄殖孔附近出血,并伴有腹水。2010年作者在河北某鱘魚養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)一例施氏鱘出血癥,癥狀與已報(bào)道的耶爾森菌病相近,對(duì)發(fā)病鱘魚進(jìn)行了病原分離鑒定,并進(jìn)一步確定了病原菌的致病性。為了明確病原菌的分類學(xué)地位,本文采用生理生化方法和16S rRNA基因序列分析方法鑒定致病菌,并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。另外,通過(guò)感染魯氏菌后鱘魚病理組織切片觀察,來(lái)了解魯氏耶爾森菌對(duì)鱘魚的致病機(jī)理和感染途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

魚源魯氏耶爾森菌分離株(YR-H01)于2010年分離自河北某鱘魚養(yǎng)殖場(chǎng)患病鱘魚體內(nèi);實(shí)驗(yàn)用施氏鱘購(gòu)自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院北京房山鱘魚繁殖中心,為非免疫狀態(tài)下(60±2)g實(shí)驗(yàn)魚;實(shí)驗(yàn)用TSA/TSB培養(yǎng)基、PCR所用試劑及特異性引物均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司;細(xì)菌生化微量鑒定管購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌形態(tài)觀察及理化特征鑒定 室溫下解凍低溫冷凍保存的菌種,在無(wú)菌條件下,將細(xì)菌接種于TSA平板上,25°C恒溫培養(yǎng)24h。肉眼觀察菌落形態(tài)、大小、隆起度、顏色等,并利用透射電鏡(Hitachi-7650)觀察細(xì)胞的形態(tài)及鞭毛數(shù)量等;菌株各項(xiàng)生化指標(biāo)的測(cè)定參照相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行(東秀珠等,2001)。

1.2.2 人工感染實(shí)驗(yàn)及 LD50測(cè)定 將分離菌株YR-H01接種TSA于25°C恒溫培養(yǎng)24h后,用10mL pH 7.2的滅菌生理鹽水洗板,振動(dòng)搖勻,稀釋至合適濃度備用。選取適當(dāng)?shù)南♂屜禂?shù),按照攻菌濃度從高到低依次設(shè)立A—H共8個(gè)實(shí)驗(yàn)組,同時(shí)設(shè)立注射等比例生理鹽水的對(duì)照組Z進(jìn)行摸索LD50實(shí)驗(yàn)。每組隨機(jī)選取施氏鱘6尾,按照0.2mL/50g體重腹腔注射不同濃度菌液,分別于24h、48h及 72h后觀察記錄死亡情況及病理癥狀,同時(shí)按Reed-Muench法計(jì)算菌株半致死量(LD50)(Reedet al,1938)。

將魯氏菌稀釋至 LD50濃度并進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn),每組10尾,設(shè)空白對(duì)照組。剖檢實(shí)驗(yàn)組死亡施氏鱘,觀察魚體內(nèi)主要臟器的病理變化,并對(duì)72h仍存活的鱘魚取血及實(shí)質(zhì)器官肝、腎進(jìn)行細(xì)菌分離計(jì)數(shù),同時(shí)對(duì)其肝、腎組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢驗(yàn)。

1.2.3 16S rRNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析 將細(xì)菌接種于TSB中,25°C 220r/min震搖18h后離心收集菌體,按照細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)菌總DNA,作為PCR模板DNA。參考文獻(xiàn),利用特 異性 引 物 Yer-F:5’-CGAGGAGGAAGGGTT AAGT-3’和 Yer-R:5’-AAGGCACCAAGGCATCTCT-3’對(duì)魯氏菌 16S rRNA 基因片段進(jìn)行擴(kuò)增(Cunninghamet al,2010)。PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min;94°C 變性 30s,55°C 退火 30s,72°C 延伸 1min,共 30個(gè)循環(huán);最后 72°C延伸 10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

利用 BLAST 在線同源性查詢軟件查詢所測(cè)菌株 YR-H01的 16S rRNA序列的屬性,將其與從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的耶爾森菌屬細(xì)菌及其他親緣關(guān)系相近的屬種的16S rRNA,采用Clustal W軟件進(jìn)行多序列匹配排列(Multiple Alignments),用系統(tǒng)發(fā)生推斷軟件包 MEGA 4.0 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。在Kimura-2-parameter模型的基礎(chǔ)上,用 Neighborjoining法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹,自舉分析(Bootstrap)1000次重復(fù)檢測(cè)分子系統(tǒng)樹的置信度,缺失和不確定的位點(diǎn)在計(jì)算中被省略。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病病例的流行情況及臨床特征

2010年 3月作者在河北省某鱘魚養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)一例鱘魚出血癥,死亡率達(dá)到30%。養(yǎng)殖模式為水泥池流水養(yǎng)殖,發(fā)病水溫約 12—16°C,發(fā)病個(gè)體大小約300—500g。同時(shí)間在河南、北京周邊地區(qū)主要鱘魚養(yǎng)殖場(chǎng)也發(fā)現(xiàn)類似病癥,死亡率從10%至50%不等;結(jié)合近幾年的鱘魚主要病害流行病學(xué)調(diào)查工作,初步判斷為細(xì)菌性出血癥。病魚臨床癥狀表現(xiàn)為下頜、胸鰭、腹部及泄殖孔附近出血,并伴有腹水。解剖觀察發(fā)現(xiàn)病魚內(nèi)臟器官有不同程度的出血,肝臟腫大、發(fā)暗,有出血點(diǎn)或出血斑,心臟呈花斑狀,脾臟紫黑色,腸道不同程度出血。

2.2 細(xì)菌形態(tài)特征

魯氏耶爾森菌YR-H01株在25°C培養(yǎng)24h后于TSA平板上形成表面光滑、邊緣整齊、微粘、淡黃色,直徑約1—2mm的圓形隆起的菌落。革蘭染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)該菌株為革蘭氏陰性短桿菌(圖1a)。透射電鏡結(jié)果顯示,YR-H01株胞外有一層明顯的細(xì)胞膜,伴有褶皺。細(xì)胞直徑約 0.64μm,長(zhǎng)度在1.7—2.5μm,細(xì)胞膜的厚度為0.12μm。每個(gè)細(xì)胞有5—8條周生鞭毛并錨定在細(xì)胞上(見圖1b)。

圖1 魯氏耶爾森菌YR-H01株形態(tài)觀察Fig.1 Morphological images of Y.ruckeri YR-H01

2.3 理化特征

常規(guī)理化分析表明,YR-H01株革蘭染色陰性,氧化酶反應(yīng)陰性,氧化發(fā)酵陽(yáng)性,具有運(yùn)動(dòng)性;其他理化特征見表1。生長(zhǎng)條件測(cè)定結(jié)果顯示,YR-H01株生長(zhǎng)溫度范圍為 20—37°C,最適生長(zhǎng)溫度為25—30°C,在含鹽量 1%—3%的 TSA 培養(yǎng)基上能生長(zhǎng),生長(zhǎng)的pH值范圍為5.0—9.0,最適pH值為7.0,且在28°C培養(yǎng)18h后細(xì)菌數(shù)目達(dá)到穩(wěn)定期(圖2)。

表1 YR-H01菌株的生理生化特征分析Tab.1 Characteristics and biochemical reactions of the YR-H01 isolate

圖2 魯氏菌YR-H01株最適生長(zhǎng)條件研究Fig.2 The optimum growth condition of Y.ruckeri YR-H01 strain

2.4 16S rRNA基因序列和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

PCR擴(kuò)增YR-H01菌株的16S rRNA基因片段約500bp,測(cè)序結(jié)果表明該片段有 563bp,在 GenBank中的登陸序列號(hào)為 JQ657818。同源性檢索結(jié)果表明YR-H01菌株與耶爾森菌屬的魯氏耶爾森菌、克里斯坦森耶爾森菌以及小腸結(jié)腸炎耶爾森菌核苷酸同源性達(dá)到96.5%以上。

從NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中選取16個(gè)水產(chǎn)動(dòng)物致病菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析,結(jié)果如圖3所示,YR-H01與Y.ruckeri(HQ222844)、Y.kristensenii(NR025159)、Y.enterocolitica(NR041832)和Y.intermedia(NR027545)聚成一群,與它們的相似性分別達(dá)到98.5%、97.5%、96.4%和96.8%;另外,與愛德華菌屬的遲緩愛德華菌、斑點(diǎn)叉尾愛德華菌遺傳距離較近,而與黃桿菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。綜合常規(guī)生理生化和16S rRNA基因序列分析結(jié)果表明,YR-H01株鑒定為魯氏耶爾森菌。

2.5 LD50的測(cè)定及臨床觀察結(jié)果

當(dāng)注射 0.2mL濃度為 1.5×108CFU/mL的菌液后,試驗(yàn)魚的累積死亡率達(dá)到 100%;因此,確定分組區(qū)間為(0—3)×107CFU,所用稀釋倍數(shù)為 1.5。根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算 YR-H01菌株半致死量(LD50)為7.2×106CFU(表2)。

經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn),鱘魚感染魯氏耶爾森菌后,肛門紅腫外突明顯,且部分魚鰭基部和下頜處有出血現(xiàn)象。隨著攻菌濃度的升高,出現(xiàn)臨床病理癥狀的時(shí)間逐漸縮短,實(shí)驗(yàn)A組6h開始有部分魚出現(xiàn)病理癥狀,8h癥狀普遍出現(xiàn),9h第一尾魚死亡,對(duì)照組無(wú)死亡記錄。

圖3 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic relationship among Yersinia species based on 16S rRNA gene sequences

表2 人工感染不同濃度YR-H01株后試驗(yàn)魚的死亡數(shù)量統(tǒng)計(jì)Tab.2 The cumulative mortality of fish injected with different concentrations of Y.ruckeri H01

對(duì)實(shí)驗(yàn)組感染后死亡鱘魚進(jìn)行剖檢可見,其腸道充血,腫脹,腸道內(nèi)充滿黃色液體,部分魚有粘性分泌物。取對(duì)照組及感染后存活鱘血及肝、腎涂板進(jìn)行細(xì)菌分離計(jì)數(shù),結(jié)果表明:對(duì)照組三種組織中均未分離到魯氏菌,而實(shí)驗(yàn)組肝、腎帶菌率為100%,且生化鑒定和分子鑒定結(jié)果表明重新分離到的菌株與感染的魯氏菌YR-H01株一致;血液未見細(xì)菌檢出。

2.6 病理組織觀察

由肝腎組織切片結(jié)果可見,感染后鱘魚腎臟無(wú)明顯病變(圖4a),腎細(xì)胞形狀及大小均正常,腎小管管腔形狀清晰可辨,無(wú)淋巴細(xì)胞及血細(xì)胞侵染,且管腔上皮細(xì)胞界線清晰,排列規(guī)則。對(duì)照組鱘魚肝臟組織切片(圖4b)觀察結(jié)果表明,對(duì)照組肝臟組織致密、結(jié)構(gòu)清晰,具有完整的肝索、肝血竇等結(jié)構(gòu),肝細(xì)胞排列緊密,核呈圓形,位于細(xì)胞中央,細(xì)胞質(zhì)飽滿,且細(xì)胞間竇狀隙明顯,其中充滿紅血球。而感染魯氏菌的魚肝組織出現(xiàn)明顯的淋巴細(xì)胞侵潤(rùn)(圖4c),肝細(xì)胞的索狀結(jié)構(gòu)消失,肝組織呈彌漫性壞死,肝細(xì)胞腫脹,肝細(xì)胞基本上失去了正常的多角形形狀,核空泡變性或核仁移向邊緣(圖4d)。有些肝細(xì)胞已經(jīng)溶解變性,竇狀隙腔已彌散不可見。

3 討論

魯氏耶爾森菌是冷水性鮭鱒魚類、溫水性鯉科魚類等的常見病原菌之一。自上世紀(jì)50年代首次在美國(guó)養(yǎng)殖虹鱒體內(nèi)分離到該菌以來(lái)(Rosset al,1966),其宿主范圍和地理分布均有明顯地?cái)U(kuò)大趨勢(shì),其感染魚類主要包括鮭鱒科魚類、金魚、鰻鱺、鰈魚、鱘魚、鰱魚、鳙魚、斑點(diǎn)叉尾等,且在德國(guó)、法國(guó)、英國(guó)等歐洲各國(guó)及澳大利亞、中國(guó)均有所發(fā)現(xiàn)(Austinet al,2007),已成為對(duì)養(yǎng)殖魚類具有廣泛致病性的重要病原菌之一。本實(shí)驗(yàn)首次從我國(guó)鱘魚主養(yǎng)區(qū)患出血癥的鱘魚體內(nèi)分離、保存了魯氏耶爾森菌一株,命名為 YR-H01株,結(jié)合目前對(duì)魚類病原菌的鑒定方法,從形態(tài)觀察、理化特征分析及基因序列比對(duì)分析等方面對(duì)其進(jìn)行研究(Nomotoet al,2004;孟彥等,2007;甘西等,2007),結(jié)果顯示YR-H01株的理化特征與已報(bào)道的斑點(diǎn)叉尾(Ictalunes punctatus)源菌株基本一致(范芳玲等,2010)。攻毒后,實(shí)驗(yàn)魚有明顯出血癥狀,且可從發(fā)病魚的內(nèi)臟組織再次分離到與原感染菌特性相同的致病菌株,確定該菌對(duì)施氏鱘具有致病性。而電鏡觀察菌株形態(tài)與Austin等(1999)報(bào)道的魯氏耶爾森菌基本一致。

圖4 魯氏耶爾森菌感染施氏鱘肝腎病理變化Fig.4 Pathological changes of livers and kidneys in Amur sturgeon after infection by YR-H01 strain

不同環(huán)境條件對(duì)細(xì)菌感染力有一定影響,而魯氏菌感染受溫度影響較大。15—18°C水溫對(duì)細(xì)菌感染有明顯影響(Roberts,1983);斑點(diǎn)叉尾鮰腹腔注射魯氏菌時(shí),18°C感染及發(fā)病率遠(yuǎn)高于22°C(Danleyet al,1999),表明較低水溫可增加魯氏菌致病性,加重感染程度(Fernandezet al,2007)。華北、東北地區(qū)是我國(guó)鱘魚人工繁育、苗種孵化的主要場(chǎng)所,這些地區(qū)多為溫冷水性養(yǎng)殖區(qū),水溫 18—24°C 期間較長(zhǎng),需加強(qiáng)魯氏菌低溫易感菌的監(jiān)控和監(jiān)測(cè)工作。

隨著鱘魚養(yǎng)殖的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展,因管理手段、養(yǎng)殖環(huán)境及水產(chǎn)品貿(mào)易等,導(dǎo)致病原傳播幾率大大增加,為魯氏耶爾森菌在鱘魚養(yǎng)殖地區(qū)的迅速傳播創(chuàng)造了條件,使該菌對(duì)鱘魚的潛在危害性增大。上世紀(jì)九十年代我國(guó)黑龍江、山東、北京等鱘魚主養(yǎng)區(qū)多次暴發(fā)發(fā)病急、發(fā)病率和死亡率高的不明疾病。1997至2000年間累計(jì)死亡魚苗約 30萬(wàn)尾,死亡率高達(dá) 80%。病魚體側(cè)、腹部、鰓等部位出血,個(gè)別嚴(yán)重者可見吻部及口腔周圍出血;剖檢可見,肝、脾、腸道等有出血現(xiàn)象。組織病理研究表明患病魚肝組織病變嚴(yán)重,局部肝細(xì)胞壞死(曾朝輝,2003)。患病魚體表及內(nèi)臟組織大面積出血、肝損傷及神經(jīng)癥狀與魯氏菌病癥有許多相似之處。目前,鱘魚感染魯氏菌的報(bào)道較少,但危害極大,可導(dǎo)致60%以上的死亡率(Vuillaume et al,1987)。

近幾年,我國(guó)養(yǎng)殖鱘魚流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),每年 4—8月是耶爾森菌病的發(fā)病高峰期,其發(fā)病頻率及程度受溫度、水質(zhì)等環(huán)境因子及魚體自身免疫力等因素的影響。因此,在鱘魚養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該細(xì)菌病的監(jiān)控工作,從水質(zhì)控制、養(yǎng)殖密度等方面預(yù)防疾病,以便及時(shí)采取有效的防治措施,避免該菌成為養(yǎng)殖鱘魚未來(lái)重要新病原的可能,并可適當(dāng)選用喹諾酮類藥物進(jìn)行早期防治,建立控制鱘魚耶爾森菌病的有效方法。

謝忠明,孫大江,王京樹等,2002.鱘魚養(yǎng)殖技術(shù).北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,252

孫大江,曲秋芝,張 穎等,2011.中國(guó)的鱘魚養(yǎng)殖.水產(chǎn)學(xué)雜志,24(4):67—70

田 甜,楊元金,王京樹等.2012.鱘魚病害研究進(jìn)展.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),51(3):559—563

徐伯亥,殷 戰(zhàn),陳 燕等.1991.鰱、鳙魚一種新的傳染病——Yersinia ruckeri,一種新的鰱、鳙魚病原菌.科學(xué)通報(bào),82(8):620—622

范方玲,汪開毓,耿 毅等.2010.斑點(diǎn)叉尾(Ictalunes punctatus)源魯氏耶爾森氏菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析.海洋與湖沼,41(6):862—868

東秀珠,蔡妙英.2001.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè).北京:科學(xué)出版社,364—398

曾朝輝,2003.鱘魚苗早期暴發(fā)性疾病的病因分析.哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)碩士論文

孟 彥,肖漢兵,張 林等.2007.施氏鱘出血性敗血癥病原茵的分離和鑒定.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),26(6):822—826

甘 西,陳 明,余曉麗等.2007.羅非魚海豚鏈球菌 16S rRNA基因的序列測(cè)定和系統(tǒng)進(jìn)化分析.水產(chǎn)學(xué)報(bào),31(5):618—623

Austin B,Austin D A,1999.Bacterial Fish Pathogens:Disease in Farmed and Wild Fish.3rd edn.Springer-Praxis,London,England:24—25,89—91,136—137,232—233,269—270

Austin B,Austin D A,2007.Bacterial Fish Pathogens:Disease of Farmed and Wild Fish.4th edn.Springer-Praxis,London,England:32—33

Berc A,Petrinec Z,Matasin Zet al,1999.Yersinia ruckerisepticaemia in experimentally infected carp(Cyprinus carpioL.) fingerlings.Acta Vet Hung,47(2):161—172

Cunningham S A,Sloan L M,Nyre L Met al,2010.Three-hour molecular detection ofCampylobacter,Salmonella,Yersinia,andShigellaspecies in feces with accuracy as high as that of culture.J Clin Microbiol,48(8):2929—2933

Danley M L,Goodwin A E,Killian H S,1999.Epizootics in farm-raised channel catfish,Ictalurus punctatus(Rafinesque),caused by the enteric redmouth bacteriumYersinia ruckeri.J Fish Dis,22(6):451—456

Eissa A E,Moustafa M,Abdelaziz Met al,2008.Yersinia ruckeriinfection in culturedNile tilapia,Oreochromis niloticus,at a semi-intensive fish farm in lower Egypt.Afr J Aquat Sci,33(3):283—286

Fernandez L,Mendez J,Guijarro J A,2007.Molecular virulence mechanisms of the fish pathogenYersinia ruckeri.Vet Microbiol,125(1—2):1—10

Furones M D,Rodgers C J,Munn C B,1993.Yersinia ruckeri,the causal agent of enteric redmouth disease(ERM) in fish.Ann Rev Fish Dis,3:105—125

Nomoto R,Munasinghe L I,Jin D Het al,2004.Lancefield group CStreptococcus dysgalactiaeinfection responsible for fish mortalities in Japan.J Fish Dis,27(12):679—686

Reed L J,Muench H,1938.A simple method of estimating fifty percent end points.Amer J Hyg,27(3):493—497

Roberts M S,1983.A report of an epizootic in hatchery reared rainbow trout,Salmo gairdneriRichardson,at an English trout farm,caused byYersinia ruckeri.J Fish Dis,6(6):551—552

Ross A J,Rucker R R,Ewing W H,1966.Description of a bacterium associated with redmouth disease of rainbow trout(Salmo gairdneri).Can J Microbiol,12(4):763—770

Tobback E,Decostere A,Hermans Ket al,2007.Yersinia ruckeriinfections in salmonid fish.J Fish Dis,30(5):257—268

Vuillaume A,Brun R,Chene Pet al,1987.First isolation ofYersinia ruckerifrom sturgeon,Acipenser baeriBrandt,in south west of France.Bull Eur Assoc Fish Pathol,7(1):18—19