鰻弧菌對(duì)魁蚶血細(xì)胞形態(tài)及免疫功能的影響*

周麗青 楊愛國① 王清印 呂振明 劉志鴻 田吉騰 吳 彪

(1．中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071;2． 浙江海洋學(xué)院 舟山 316000)

商品規(guī)格魁蚶(Scapharca broughtonii)或鮮食,或加工為干制品,肉質(zhì)鮮美,營(yíng)養(yǎng)豐富。20世紀(jì)以前,我國魁蚶野生資源豐富,但常年的濫采亂捕和環(huán)境污染,導(dǎo)致該貝野生資源驟減,雖然它的人工育苗及養(yǎng)成研究早有成功范例,但一直都不屬于主流養(yǎng)殖物種。近年來,因適應(yīng)性強(qiáng)、生態(tài)修復(fù)效果顯著的特點(diǎn),魁蚶人工養(yǎng)殖發(fā)展迅猛,為防止發(fā)生類似于扇貝、鮑魚和牡蠣等長(zhǎng)期單一品種高密度養(yǎng)殖模式下,水質(zhì)惡化、養(yǎng)殖品種生長(zhǎng)緩慢和病害暴發(fā),我們開展了魁蚶種質(zhì)資源和遺傳多樣性(吳彪等,2012;梁超等,2010,2011;周麗青等,2012;Tianet al,2012)、生長(zhǎng)(吳彪等,2012)、血細(xì)胞類型(周麗青等,2013)及形態(tài)選育指標(biāo)(吳彪等,2010)等良種培育的研究,發(fā)現(xiàn)魁蚶對(duì)致病弧菌的抵抗能力強(qiáng),具有很高的抗逆性能,為培育魁蚶抗病抗逆新品系,作者觀察鰻弧菌(Vibrio anguillarum)免疫刺激前后血細(xì)胞形態(tài)變化及相應(yīng)的免疫功能,以期為魁蚶種質(zhì)改良積累免疫參數(shù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

18只3齡健康魁蚶購自山東青島南山水產(chǎn)品市場(chǎng),殼長(zhǎng) 70—80mm,體重 110—150g。水溫 18—22°C 暫養(yǎng)1周左右,投喂硅藻、扁藻和金藻,每天換水1次。

1.2 鰻弧菌免疫刺激魁蚶血細(xì)胞

鰻弧菌菌種由中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院提供,2611E海水培養(yǎng)基培養(yǎng)?？?只一組,采用一次性1ml注射器斧足注射 1×109個(gè)/ml鰻弧菌生理鹽水溶液0.1ml,3只不注射的作為健康對(duì)照組,分別于注射3—4h,6—10h,12—16h,24—30h和48h后取血淋巴液。

1.3 血細(xì)胞分類和形態(tài)觀察

血淋巴液制片方法參照劉志鴻等(2003)。前閉殼肌血竇中抽取血淋巴液,選Alserver液(18.7g/L葡萄糖,8g/L檸檬酸三鈉,0.5g/L檸檬酸,4.2g/L NaCl)和MAS液(20.8g/L葡萄糖,8g/L檸檬酸三鈉,3.36g/L 乙二胺四乙酸二鈉;22.5g/L NaCl)為抗凝劑。制備的血涂片用南京建成科技有限公司快速瑞氏-吉姆薩染液染色,LeicaDM4000B光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 紅細(xì)胞形態(tài)變化及其免疫功能

魁蚶紅細(xì)胞在顯微鏡下呈中間厚邊緣薄圓形或橢圓形餅狀,胞質(zhì)中黑色顆粒推測(cè)為血紅蛋白顆粒;經(jīng)鰻弧菌免疫刺激后,紅細(xì)胞?，F(xiàn)無絲分裂和不等縊裂(見圖1),注射12h后更多見,圖1a為紅細(xì)胞吞噬或胞吐血紅蛋白顆粒;圖1b為剛完成分裂的紅細(xì)胞,血紅蛋白近乎平分;有時(shí)細(xì)胞核不等縊裂(圖1c),有時(shí)細(xì)胞分裂為大小不等2個(gè)(圖1d);有的細(xì)胞核不分裂,胞質(zhì)縊裂球中無細(xì)胞核,血紅蛋白顆粒不等分配(圖1e,圖1f),具細(xì)胞核的小分裂球有時(shí)小至5μm左右(圖1g),有些小分裂球中不含血紅蛋白顆粒(圖1h)。紅細(xì)胞在 2種抗凝劑及無抗凝劑的血淋巴液中的形態(tài)無明顯差異。

圖1 魁蚶紅細(xì)胞的無絲分裂和縊裂Fig.1 The amitosis and strangling division of red cells in hemolymph of Scapharca broughtonii

魁蚶紅細(xì)胞對(duì)侵入血淋巴液的病原菌有吞噬作用,病原菌首先黏附在近旁的紅細(xì)胞膜上(圖2a),紅細(xì)胞吞噬病菌并形成包囊(圖2b),吞噬病原菌的部位常以縊裂方式從細(xì)胞母體中分離出來(圖2c,圖2d,圖2e);注射24h后,被吞噬的鰻弧菌以吞噬泡的形式懸掛于細(xì)胞膜表面(圖2f);注射12h之前,紅細(xì)胞表面對(duì)病原菌有明顯的免疫吸附功能,注射3—4h后即可見個(gè)別紅細(xì)胞表面吸附大量病原菌(圖2g),隨著血淋巴液中病原菌被吞噬減少,很少見紅細(xì)胞表面吸附病原菌,制片過程可能會(huì)使細(xì)胞表面免疫吸附的病原菌脫落,細(xì)胞表面呈現(xiàn)白色空洞(圖2h)。

2.2 白細(xì)胞形態(tài)變化及其免疫功能

白細(xì)胞在抗菌免疫中起著極其重要的作用,注射病原菌12h后白細(xì)胞數(shù)目明顯增多。嗜堿性細(xì)胞吞噬大顆粒異物(圖3a);嗜酸性和嗜中性細(xì)胞則是吞噬病原菌的主力,白細(xì)胞之間易粘連,尤其 MAS液中,發(fā)生吞噬作用的白細(xì)胞易相互粘連甚至融合(圖3b),白細(xì)胞間的粘連常參與血栓的形成;被白細(xì)胞吞噬的病原菌不能立即被消化分解,它們?cè)诎准?xì)胞內(nèi)仍能存活一段時(shí)間,并企圖從白細(xì)胞中掙脫出來,致使細(xì)胞表面形成各種不規(guī)則突起(圖3c);白細(xì)胞具有變形運(yùn)動(dòng)能力(圖3d),可移動(dòng)到病原菌附近實(shí)施吞噬;注射24h后,病原菌被白細(xì)胞消化分解后呈細(xì)絲狀或液化,消化泡從白細(xì)胞中縊裂出來,游離于血淋巴液中(圖3e);白細(xì)胞也有免疫吸附作用,可吸附并快速吞噬大量病原菌(圖3f,圖3g);白細(xì)胞中的淋巴細(xì)胞一般不具備吞噬病原菌的作用,可能會(huì)向血液中分泌抗體,淋巴細(xì)胞核常見有缺刻(圖3h)。

圖2 魁蚶紅細(xì)胞對(duì)病原菌的免疫作用Fig.2 The immune function for pathogen of red cells in hemolymph of Scapharca broughtonii

圖3 白細(xì)胞形態(tài)變化及其吞噬作用Fig.3 The morphological change of white cells and their phagocytic function

2.3 血栓細(xì)胞形態(tài)變化及其功能

正常情況下血栓細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,細(xì)胞核呈圓梭形(圖4a),未抗凝或注射病原菌后,血栓細(xì)胞之間容易相互粘連(圖4b),注射病原菌3—4h后,血淋巴液中游離的血栓細(xì)胞數(shù)量急劇減少,且形態(tài)變得極不規(guī)則,多已參與凝血。血栓細(xì)胞啟動(dòng)凝血機(jī)制時(shí)細(xì)胞膜邊緣不清晰,細(xì)胞核周圍出現(xiàn)大量細(xì)絲狀物質(zhì)類似不溶性纖維蛋白(圖4c),逐漸彌散開來;血栓細(xì)胞間相互交織粘連(圖4d),纖維蛋白彌散交織后,有些細(xì)胞核會(huì)略有變形,逐漸增多的纖維蛋白交織成網(wǎng)后網(wǎng)住周圍的血細(xì)胞形成血栓塊(圖4e);血栓細(xì)胞偶爾黏附或吞噬病菌(圖4b,圖4f)。注射病原菌后,MAS液中,血栓細(xì)胞形態(tài)相對(duì)正常(圖4a,圖4b),Alserver液中血栓細(xì)胞的形態(tài)常發(fā)生改變,細(xì)胞核形態(tài)膨脹彌散開來(圖4c,圖4d,圖4e)。

圖4 血栓細(xì)胞形態(tài)變化Fig.4 The morphological change of thrombocytes

3 討論

3.1 血細(xì)胞的無絲分裂和縊裂

無絲分裂(amitosis)又稱直接分裂,動(dòng)物血細(xì)胞的無絲分裂存在以下4種情形:(1)細(xì)胞物質(zhì)代謝旺盛,通過無絲分裂增大細(xì)胞核的表面積;(2)已分化細(xì)胞中無絲分裂多見;(3)不良環(huán)境與老化導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生無絲分裂;(4)組織再生時(shí),細(xì)胞的無絲分裂會(huì)增多(張警愚,1989)。在本研究中,注射病原菌 12h以后,紅細(xì)胞無絲分裂和縊裂現(xiàn)象增多;注射24h之后,白細(xì)胞縊裂增多,說明不同血細(xì)胞分裂功能不同,紅細(xì)胞的無絲分裂是為了增加運(yùn)輸氧氣,增強(qiáng)機(jī)體抵抗病菌入侵的能力,同時(shí)補(bǔ)充因?yàn)橥淌刹≡劳龅募t細(xì)胞數(shù)目;白細(xì)胞的縊裂可能是為了減少負(fù)擔(dān),以便繼續(xù)吞噬病菌。鄒拓謎等(2011)認(rèn)為多倍體的野生鯽(Carassius auratus)通過血細(xì)胞的無絲分裂來增加細(xì)胞數(shù)量,保證其總血紅蛋白含量相對(duì)穩(wěn)定,從而確保它們運(yùn)輸氧氣的能力。胡知淵等(2005)推測(cè)較多的紅細(xì)胞數(shù)量會(huì)刺激棘胸蛙(Pana spinosa)紅細(xì)胞的無絲分裂。羅芬等(2010)認(rèn)為疫苗能夠誘導(dǎo)中華倒刺鲃(Spinibarbus sinensisBleeker)外周血紅細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等具有吞噬功能的細(xì)胞數(shù)量增加,來增強(qiáng)其吞噬功能。注射12h后,魁蚶白細(xì)胞數(shù)目明顯增多,但未觀察到白細(xì)胞分裂增生的過程,這是因?yàn)檠?xì)胞起源于造血干細(xì)胞,而單純的形態(tài)學(xué)方法難以辨認(rèn)造血干細(xì)胞(李長(zhǎng)玲等,2009)。

3.2 魁蚶血細(xì)胞對(duì)病原菌的免疫功能

魁蚶血淋巴液中 3大類細(xì)胞在受到鰻弧菌免疫刺激后都發(fā)生形態(tài)改變,筆者認(rèn)為屬于免疫防御的應(yīng)激反應(yīng)。多數(shù)研究人員認(rèn)為吞噬作用主要由粒細(xì)胞完成(Carballalet al,1997;Moore,1972;李太武等,2007),魁蚶的紅細(xì)胞、各種白細(xì)胞和血栓細(xì)胞都具有吞噬病原菌的功能,紅細(xì)胞先表現(xiàn)出免疫黏附功能,與魏靜等(2010)和張振冬等(2006)對(duì)魚類紅細(xì)胞免疫黏附功能的研究結(jié)果一致;注射鰻弧菌一段時(shí)間后,魁蚶紅細(xì)胞又表現(xiàn)一定的病原菌吞噬功能;白細(xì)胞是吞噬病原菌的主力軍,血栓細(xì)胞偶有吞噬病原菌作用,且注射病原菌后,二者共同參與血液的凝固過程。Burrows等(2001)觀察發(fā)現(xiàn)大菱鲆(Psetta maxima)血栓細(xì)胞除具有凝血功能外,還具有吞噬功能;路衛(wèi)星等(2008)觀察的幾種變溫脊椎動(dòng)物血栓細(xì)胞形態(tài)及功能與魁蚶的較為一致;綠海龜(Chelonia mydas)的血栓細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)邊界模糊的特性也與魁蚶的較為相似;貝類中除朱澤聞等(2011)和張維翥等(2005)推測(cè)存在特化的血栓細(xì)胞起凝集作用外,尚未見有血栓細(xì)胞的報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn),魁蚶血細(xì)胞分工明確,能共同防御病原菌的入侵,細(xì)胞免疫對(duì)病原菌免疫防御起極其重要的作用,是否存在體液免疫或體液和細(xì)胞共同免疫有待進(jìn)一步研究。今后可借鑒王日昕等(2009)構(gòu)建的高質(zhì)量血細(xì)胞 cDNA文庫進(jìn)行 Expressed sequence tag(EST)序列分析,深入研究魁蚶免疫相關(guān)因子和免疫機(jī)制。

3.3 2種抗凝劑對(duì)魁蚶血細(xì)胞形態(tài)的影響

Hindriks等(1992)認(rèn)為血栓細(xì)胞形態(tài)變化受外界無機(jī)離子濃度影響較大,本研究發(fā)現(xiàn) Alserver液和MAS液對(duì)阻止血液凝固都有一定的作用,Alserver液中血栓細(xì)胞易變形,細(xì)胞邊緣不清晰,MAS液中,血栓細(xì)胞形態(tài)輪廓光滑可辨;相反,Alserver液中白細(xì)胞之間不粘連,細(xì)胞外形圓滑;MAS液中,白細(xì)胞之間易粘連,甚至融合,且細(xì)胞外形不圓潤(rùn),常有各種形狀突起。估計(jì)這2種抗凝劑改變了參與凝血的血細(xì)胞表面粘連特性,使血液無法凝固,因而起到抗凝作用。蔣瓊等(2001)篩選中國對(duì)蝦(Penaeus chinesis)血淋巴抗凝劑時(shí),以能夠良好保持細(xì)胞的整體形態(tài)以及細(xì)胞器、細(xì)胞核形態(tài)為標(biāo)尺。因此,研究魁蚶血細(xì)胞形態(tài)及免疫功能需選擇合適的抗凝劑。

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