慢性氨氮脅迫對鯔魚(Mugil cephalus)幼魚組織細胞免疫指標的影響研究*

蔣 玫,李 磊,沈新強,吳慶元,牛俊翔

(1.農(nóng)業(yè)部海洋與河口漁業(yè)重點開放實驗室 中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所 上海 200090;2.上海海洋大學 上海 200336)

水中氨氮包括離子氨和非離子氨,總氨氮即是這兩種形態(tài)氨的總和。在總氨氮中,離子氨對魚類毒性較小,而低濃度的非離子態(tài)氨則會對魚類造成較強的毒性作用(郝小鳳等,2012)。非離子氨能降低魚類等水生生物的能量代謝活動,損害其鰓、肝、腎、脾和甲狀腺組織,使其出現(xiàn)呼吸困難,分泌物增多,甚至衰竭死亡等一系列生理毒性反應(譚樹華等,2005;Benliet al,2008;尹飛等,2011a)。

丙二醛(MDA)是脂質過氧化作用的最終分解產(chǎn)物,其含量可間接反映機體的活性氧自由基和脂質的過氧化水平,從而間接反映出細胞受損傷的程度,近年來已開始應用于水生態(tài)毒理學的研究(譚樹華等,2005;廖靜等,2011)。Na+-K+-ATP酶普遍存在于水生動物體內(nèi),參與能量代謝、物質運送、氧化磷酸化的重要生化過程,同時它與膜上磷脂的結合狀態(tài),將影響膜的流動性,從而還會影響膜的其它功能,為多種毒物攻擊的靶器官(趙小晶等,2011)。魚體肌肉核酸水平作為衡量水環(huán)境的指標,能在一定條件下預測污染與否及水環(huán)境是否有利于魚類的生長,因此 RNA/DNA比值在水產(chǎn)動物的生產(chǎn)和研究中是一種非常重要的研究指標(Bulow,1970;劉存歧等,2010)。

鯔魚(Mugil cephalus)廣泛分布于我國沿海,具有生長快、病害少、食性廣、廣鹽性、肉味鮮美等特點,是我國咸淡水養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟魚類之一。國內(nèi)有關鯔魚的研究目前主要集中于繁殖生物學、生理、及養(yǎng)殖技術方面(方永強等,2002;殷帥文等,2007;于娜,2011;于娜等,2012)。許多學者就氨氮對魚類的影響進行了大量報道,但大多都集中于急性毒性的效應研究(韓力強等,2005;杜浩等,2007;曲克明等,2007;王甜等,2010),而對于慢性影響實驗則開展的較少。本文通過開展氨氮對鯔魚幼魚的慢性脅迫實驗,分析氨氮脅迫下鯔魚幼魚肌肉組織中(RNA/DNA)遺傳代謝的變化情況,了解肝臟組織和鰓絲組織中 MDA含量和Na+-K+-ATP酶活性及Na+-K+-ATP酶基因表達水平的響應關系,探索魚類生物在長時間低濃度的氨氮脅迫下致毒機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗生物選自江蘇啟東黃海灘涂養(yǎng)殖育苗場外海域的天然鯔魚幼魚。挑選其中健康活潑、規(guī)格一致的個體作為試驗魚,質量為(0.3693±0.1070)mg,體長為(3.35±0.27)cm。

實驗用水來源于育苗場附近的近岸天然海水,經(jīng)過沉淀沙濾后備用,鹽度為 20±2,溫度為 20—23°C,pH 為 7—8。經(jīng)過消毒后,氨氮質量濃度在0.35mg/L。

試驗容器為容量20L的塑料整理箱,在水箱中充氧保證飽和溶解氧在60%以上。

1.2 實驗設計

采用室內(nèi)半靜水方法進行慢性染毒實驗。將NH4Cl試劑(優(yōu)級純)配制成母液,將實驗濃度按NH4Cl母液等對數(shù)間距設計設定4個對應氨氮濃度梯度組(0.75、1.5、3.0mg/L)和1個對照組(0.35mg/L)過濾消毒海水),每組 3個平行,每組各放鯔魚幼魚 70尾。為保證實驗濃度的穩(wěn)定,減少鯔魚幼體自身氨排泄影響,每天換水一次,測定氨氮質量濃度。實驗時間持續(xù) 20d。試驗開始后每天觀察,并記錄生理活動反應情況。分別于實驗開始的 0、5、10、15和 20d隨機抽取鯔魚幼魚,分別采集腮絲、肝臟和肌肉組織,進行相關數(shù)據(jù)的測定分析。

RNA/DNA比值測定:取部分肌肉組織,加入酒精制成石蠟切片,進行切片再脫蠟,吖啶橙工作液染色15min,磷酸緩沖液(PBS)漂洗,水溶性封片劑封片,倒置于共聚焦顯微鏡(LSM 5 EXCITER,德國)觀察細胞層面,選擇波長為 488nm的氬原子作為激發(fā)光進行光束掃描,細胞核或DNA病毒包涵體呈綠色熒光。而核仁和細胞質內(nèi)RNA或RNA病毒包涵體呈橘紅色熒光。經(jīng)激光共聚焦掃描系統(tǒng)進行測定分析 RNA/DNA的熒光像素積分值的比值。

MDA和Na+-K+-ATP的測定:將肝臟和腮絲組織取出,在經(jīng)-20°C預冷的研缽中加入少許石英砂和3.0mL的Tris-蔗糖緩沖液,研碎后轉入離心管,10000r/min離心15min,上清液即為粗酶液,采用南京建成生物工程研究所的專用試劑盒進行測定分析。

Na+-K+-ATP酶的 mRNA表達分析:采用 qRTPCR法提取鯔魚苗肝臟和鰓絲組織的Total RNA。RNA質量和含量檢測用分光光度計分析。取5μgTotal RNA用Dnase I消化純化基因組DNA,電泳檢測消化純化基因組DNA前后的RNA的質量。1μg消化純化后的RNA采用RNA PCR kit(AMV) Ver.3.0(TaKaRa)進行第一鏈cDNA合成。引物采用Primer 5.0軟件,按照Real-time PCR要求設計3個內(nèi)參照基因和BmGSTd1基因的引物對。采用SYBR Prime Script TM RT-PCR試劑盒進行測定,具體實驗步驟按照說明書進行,反應體系為20μL。反應程序為:95°C變性1min;隨后的 40 個循環(huán)包括 95°C 5s、55°C 10s、72°C 10s。反應過程由測定儀軟件自動設定,每個樣品重復3次。RT-PCR的結果數(shù)據(jù)用儀器自帶的Sequence detection software version 1.3.1軟件處理,圖表采用SPSS16.0軟件制作。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗結果使用 EXCEL 2007數(shù)據(jù)處理,用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析,P＜0.05表明差異顯著。

2 結果分析

2.1 氨氮對肌肉組織細胞RNA/DNA的影響

圖1 氨氮對鯔魚肌肉組織細胞RNA/DNA的影響Fig.1 Effect of muscle RNA/DNA ratio of juvenile Mugil cephalus exposed to ammonia

氨氮脅迫下,除最高濃度組外,其他各處理組鯔魚幼魚肌肉組織的 RNA/DNA比值隨著實驗時間的持續(xù)均呈現(xiàn)一定的變化(圖1)。對照組 RNA/DNA的比值隨時間持續(xù),表現(xiàn)出緩慢增加的趨勢,但各實驗時間段差異不顯著(P＞0.05)。最高處理組(3.0mg/L)RNA/DNA的比值基本無變化,始終維持在實驗最初0d水平。其他2個處理組的RNA/DNA比值較實驗0d緩慢增加,但時間效應不明顯,5d至20d數(shù)值基本維持在一個水平(P＞0.05)。各處理組的RNA/DNA比值與對照組之間無顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 氨氮對肝臟和鰓絲組織的 Na+-K+-ATP活性和MDA含量影響

兩個高濃度氨氮處理組對肝臟組織的 Na+-K+-ATP的活力影響較為顯著(P＜0.05),而低濃度處理組(0.70mg/L)和對照組無明顯變化(圖2)。兩個高濃度處理組活力受到不同程度抑制,5d后呈較明顯地下降趨勢,5d后活力變化趨緩,下降幅度明顯減少,尤其是低濃度處理組(0.70mg/L)和次高濃度組(1.50mg/L)基本降至同一水平。高濃度處理組(3.0mg/L)的Na+-K+-ATP的活力與對照組呈顯著性差異(P＜0.05),而兩個低濃度處理組與對照組相比基本無顯著性差異。各處理組Na+-K+-ATP的活性變化基本與氨氮濃度呈顯著負相關(R=-0.65)。

氨氮脅迫對鰓絲組織的Na+-K+-ATP的活力影響,各處理組均小于對照組。除最高濃度處理組(3.0mg/L)與對照組差異性較為顯著外(P＜0.05),其他各處理組和對照組無顯著性差異(圖3)。實驗開始第 5d,兩個低濃度組處理組Na+-K+-ATP的活力均出現(xiàn)小幅下降,活性受到輕度抑制。高濃度處理組Na+-K+-ATP的活力則受到顯著抑制,下降幅度十分明顯,但10d后活力下降幅度逐步縮小,基本趨于穩(wěn)定。5d至15d活力與對照組差異性顯著(P＜0.05)。各處理組間 Na+-K+-ATP的活力與氨氮濃度呈較低的負相關性(R=-0.39)。

2.3 氨氮對肝臟和鰓絲組織的MDA含量影響

肝臟組織 MDA含量變化如圖4所示。對照組(0.35mg/L)MDA含量變化相對平穩(wěn),實驗前后無顯著性差別(P＞0.05)。各濃度處理組 MDA含量整體上呈現(xiàn)先逐漸上升而后小幅下降的趨勢,實驗 15d時,各處理組的MDA含量達到峰值,其中1.5mg/L的處理組MDA含量與對照組在實驗進行第10d后呈顯著性差異(P＜0.05)。最高濃度處理組(3mg/L)MDA含量在整個實驗第 5d快速增加,各時間段與對照組均表現(xiàn)出顯著差異性(P＜0.01)。而最低濃度(0.7mg/L)MDA含量則與對照組無顯著性差異。各處理組MDA含量與氨氮濃度呈現(xiàn)較低的正相關性(R=0.33)。

圖2 氨氮對肝臟組織Na+-K+-ATP酶的活力影響Fig.2 Effect of the Na+-K+-ATPase activity of juvenile Mugil cephalus liver exposed to ammonia

圖3 氨氮對鰓組織Na+-K+-ATP酶的活力影響Fig.3 Effect of the Na+-K+-ATPase activity of juvenile Mugil cephalus gill exposed to ammonia

圖4 氨氮對肝臟組織MDA的含量影響Fig.4 Effect of ammonia on content of MDA in juvenile Mugil cephalus liver

圖5 氨氮對鰓組織MDA的含量影響Fig.5 Effect of ammonia on content of MDA in juvenile Mugil cephalus gill

鰓組織 MDA含量變化如圖5所示。對照組(0.35mg/L)MDA含量基本無太大波動變化,實驗前后無顯著性差異(P＞0.05)。三個處理組 MDA含量整體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,第 5d達到峰值后逐步下降趨穩(wěn),20d后各處理組的MDA含量基本恢復到對照組水平。各處理組的MDA含量在5d時顯著受到激活,上升趨勢明顯,與對照組呈顯著性差異(P＞0.05)。5d至 20d后MDA活力逐步降低,與對照組均無顯著性差異。5d前各處理組的MDA含量與氨氮濃度呈現(xiàn)較低的正相關(R=0.42),5d至20d的MDA含量則與氨氮濃度呈較低的負相關(R=-0.33)。

2.4 氨氮對肝臟組織和鰓絲組織的 Na+-K+-ATP酶基因表達量的影響

氨氮脅迫對肝臟組織Na+-K+-ATP酶的mRNA表達影響見圖6所示。各處理組Na+-K+-ATP酶的mRNA表達量在實驗開始至 5d前呈明顯上升趨勢,尤其是3mg/L處理組與對照組差異顯著(P＜0.05)。5d后各處理組mRNA表達量均呈逐步下降趨勢,其中1.5mg/L和 0.7mg/L處理組到 15d逐步穩(wěn)定至對照組水平,3mg/L處理組的mRNA表達水平仍處于高位,明顯高于對照組(P＜0.05)。而對照組mRNA表達水平在實驗期間始終保持穩(wěn)定,無明顯變化(P＞0.05)。實驗時間從第5d開始至第15d,Na+-K+-ATP酶的mRNA表達量隨著氨氮脅迫濃度的增加而升高。實驗時間持續(xù)到第20d,除最高濃度組外(3mg/L),各濃度組的表達量基本維持同一水平,其差異不顯著。

圖6 氨氮對鯔魚肝臟組織中Na+-K+-ATP酶的mRNA表達量的影響Fig.6 Effect of the Na+-K+-ATPase relative expression level of juvenile Mugil cephalus liver exposed to ammonia

氨氮脅迫下,各處理組鰓絲組織 Na+-K+-ATP酶的 mRNA表達量呈現(xiàn)先升高,后下降并逐步趨穩(wěn)的變化趨勢(圖7)。高濃度處理組 Na+-K+-ATP酶的mRNA表達量,在實驗第5d,呈明顯升高趨勢,而后至 20d后逐步下降,與對照組相比,差異性顯著(P＜0.05)。而0.7mg/L和1.5mg/L處理組Na+-K+-ATPase的mRNA表達量與對照組差異均不顯著(P＞0.05)。實驗時間持續(xù)第 5d開始至第 15d,各處理組 Na+-K+-ATPase的mRNA表達水平與氨氮濃度吳相關性(R=0.27)。實驗持續(xù)到第 20d,除 3.0mg/L濃度組外,其余各濃度組表達量均處于同一水平。

圖7 氨氮對鯔魚鰓絲組織中Na+-K+-ATP酶的mRNA表達量的影響Fig.7 Effect of ammonia on the Na+-K+-ATPase relative expression level of juvenile Mugil cephalus gill

3 討論

3.1 氨氮對鯔魚幼魚肌肉組織RNA/DNA的影響

魚體肌肉中核糖核酸(RNA)與脫氧核糖核酸(DNA)的比值(RNA/DNA)在一定程度上反映了魚類生長發(fā)育的優(yōu)劣,RNA/DNA值通常作為魚類種群長期生長狀況的評價指標(Steinhartet al,1992;Weberet al,2003)。本實驗結果表明,隨著氨氮脅迫時間的延續(xù),對照組和兩個較低濃度組(0.75mg/L和 1.5mg/L)肌肉的RNA/DNA比值呈較明顯地上升趨勢,且對照組的比值上升幅度較大,而兩個低濃度組 RNA/DNA比值與對照組相比無顯著性變化(P＞0.05)。與蔣玫等(2011)報道的低濃度氨氮(0.99mg/L)作用下對脊尾白蝦肌肉組織中RNA/DNA比值增長影響較小,結果相一致。表明受試生物在一定濃度氨氮脅迫下,其肌肉組織對外界環(huán)境的耐受性較強。而氨氮長期脅迫則會降低魚類生長率和攝食率(Singhet al,2002;Lemarieet al,2004),進而導致生長發(fā)育緩慢。本研究發(fā)現(xiàn)高濃度組(3.0mg/L)RNA/DNA比值幾乎沒有增長變化,說明在一定濃度的氨氮長時間脅迫作用下,鯔魚肌肉中的核酸代謝受到了一定的影響,蛋白質合成和修補更新組織的能力進一步下降。

3.2 氨氮對鯔魚幼魚鰓絲組織和肝臟組織 Na+-K+-ATP酶活性的影響

水環(huán)境中非離子氨增加時,會抑制生物自身氨的排泄量,使血液和組織中氨的濃度升高,降低血液載氧能力,此外因非離子氨(NH3)不帶電荷,具有較高脂溶性,很容易透過細胞膜,直接導致生物中毒(胡毅等,2012)。Na+-K+-ATP酶是細胞膜的主要成分,以膜上其他蛋白、磷脂等成分為作用靶點的毒物也會間接地影響Na+-K+-ATP酶的活性(李文英等,2007)。大多數(shù)硬骨魚類對氨氮毒性非常敏感,由于受到脅迫強度、脅迫時間等各種因素的作用,魚類在氨氮脅迫過程中,其自身抗氧化免疫系統(tǒng)必將受到不同程度的影響。

從實驗結果可知,氨氮長時間脅迫下肝臟組織中的Na+-K+-ATP活性均出現(xiàn)下降趨勢,尤其是3mg/L處理組降幅最為明顯,與對照組差異性顯著(P＜0.05),這一結果與以往的研究基本一致(Agrahariet al,2008)。各處理組Na+-K+-ATP的活性基本隨著實驗時間的增加,呈現(xiàn)先下降后逐漸趨緩穩(wěn)定的變化趨勢。這主要是因為當環(huán)境中高濃度氨氮滲透入肝臟后,肝臟氨氮排泄受阻,肝臟內(nèi) Na+-K+-ATP酶蛋白結構受到影響而導致酶活力降低,隨著時間延續(xù),肝臟滲透機制又被有效激活進行主動滲透調節(jié)。本實驗同時顯示出 Na+-K+-ATP酶活力與氨氮濃度呈負相關,表明氨氮對肝臟Na+-K+-ATP酶活性的抑制作用具有時間和濃度依賴性(趙小晶等,2011)。

鰓是魚類呼吸、氨氮排泄及滲透調節(jié)的主要部位,Na+-K+-ATP酶是鰓組織泌氯細胞及細胞器的膜上存在的一種蛋白酶,在魚體滲透調節(jié)過程中起著非常重要的作用(潘魯青等,2006;徐力文等,2007)。本實驗中,氨氮脅迫第5d后各處理組的Na+-K+-ATP酶活力均出現(xiàn)下降,尤其是高濃度(3mg/L)處理組與對照組相比下降十分明顯。隨著實驗時間的增加,各處理組 Na+-K+-ATP酶活力下降幅度趨緩,接近穩(wěn)定。而兩個高濃度處理組的酶活力變化趨緩情況出現(xiàn)的時間(10d)均早于低濃度處理組出現(xiàn)的時間(15d)。筆者認為,在較高濃度氨氮脅迫下,對鰓絲細胞的傷害加重,特別是對膜磷脂產(chǎn)生過氧化,不僅改變了生物膜功能和結構的完整性,而且抑制了膜上的 Na+-K+-ATP酶的活性。由于環(huán)境毒物對Na+-K+-ATP酶活性的抑制作用具有時序性(尹飛等,2011b),長時間氨氮脅迫作用下,可能導致鰓主動滲透調節(jié)機制被有效激活,且脅迫濃度越高,滲透調節(jié)機制啟動越快。

3.3 氨氮對鯔魚幼魚鰓絲組織和肝臟組織 MDA含量的影響

MDA是自由基攻擊膜不飽和脂肪酸的產(chǎn)物,可與蛋白質的游離氨基作用,引起蛋白質分子內(nèi)和分子間交聯(lián),導致細胞損傷。正常生理狀態(tài)下,體內(nèi)的MDA含量極低,其含量高低可以反映機體細胞受到自由基攻擊的程度(Papadimitriouet al,2002)。本實驗研究發(fā)現(xiàn),各氨氮處理組肝臟組織的MDA含量均高于對照組,3.0mg/L和1.5mg/L處理組的MDA在實驗的第15d受到最大程度的誘導,MDA含量與對照組差異顯著(P＜0.05),尤其是3.0mg/L處理組MDA含量比對照組高出近5倍。鰓絲MDA在實驗第5d受到最大程度的誘導,且各濃度組均與對照組差異顯著(P＜0.05)。鰓絲和肝臟MDA含量在實驗第 20d均出現(xiàn)不同程度的下降。這主要是由于高濃度氨氮脅迫使抗氧化酶活力受到抑制,此時肝臟內(nèi)產(chǎn)生的大量氧自由基不能被有效清除,使得機體脂質過氧化加劇,從而導致脂質化產(chǎn)物丙二醛含量不斷增加。長時間脅迫下,一定范圍內(nèi)氨氮對鯔魚幼魚組織的氧化損傷是可逆的,肝臟和鰓絲可能對氨氮帶來的可逆性氧化損傷已經(jīng)適應(王奇等,2010),最終導致兩種組織的MDA含量隨時間延長而逐漸下降。本實驗結果顯示,實驗進行到第5d,各處理組中鰓絲MDA的增量幅度明顯高于肝臟;鰓絲MDA含量出現(xiàn)下降的時間段也明顯早于肝臟組織近 10d,表明氨氮對 MDA的影響具有組織器官的特異性和時序性。

3.4 氨氮對鯔魚幼魚鰓絲組織和肝臟組織 Na+-K+-ATP酶的基因表達水平影響

Na+-K+-ATP酶的主要功能是參與細胞內(nèi)外Na+、K+跨膜轉運,使細胞內(nèi)外的離子濃度處于相對穩(wěn)定的生理平衡狀態(tài)。Na+-K+-ATP酶是魚類滲透壓調節(jié)組織中離子交換的關鍵性酶(Hiroseet al,2003;林仕梅等,2007)。由于在許多基礎和特定細胞功能上的重要性,Na+-K+-ATP酶必須適應動物細胞改變和生理刺激(Therienet al,2000)。魚類在環(huán)境脅迫初期,某些器官組織的功能活動會隨著外界環(huán)境變化發(fā)生相應改變,使得機體在脅迫中能保持平衡狀態(tài)。實驗開始5d,鯔魚幼魚鰓絲和肝臟組織 Na+-K+-ATP的基因表達量快速升高,同時Na+-K+-ATP酶活力也有所增加,以此保證魚體內(nèi)氧的供應和基礎代謝正常,以維持鰓的正常呼吸、肝臟的正常解毒能力和機體滲透壓處于穩(wěn)定的生理水平。硬骨魚鰓內(nèi)Na+-K+-ATPase基因表達對滲透壓調節(jié)起關鍵性作用的Na+-K+-ATP酶活性密切相關(Deaneet al,2005)。實驗較好地顯示出鰓絲和肝臟Na+-K+-ATP的基因表達水平的變化趨勢與酶的活力變動趨勢基本一致。實驗進行到 5d后,鰓絲和肝臟 Na+-K+-ATP酶的基因表達水平有所降低,并逐漸趨于一個平緩穩(wěn)定期。實驗第20d除了3mg/L氨氮處理組Na+-K+-ATP酶的基因表達量仍顯著高于對照組外(P＜0.05),其他各濃度組表達量基本維持在與對照組表達量同一水平。有研究表明,隨著環(huán)境脅迫時間的延長,部分魚類能夠通過自身調節(jié)最終適應環(huán)境的變化,在變化后的環(huán)境中再次達到新陳代謝的平衡,保持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)(Ishioka,1982)。當水體中氨氮脅迫強度低于魚體耐受限度時,機體能自行調節(jié)從而適應外界環(huán)境變化(邱德全等,2008)。鯔魚幼魚或許正是通過采取自我調節(jié)組織細胞的滲透能力這一被動方式,來適應低濃度氨氮脅迫因子長時間的作用。

致謝本次實驗得到了江蘇啟東金海岸水產(chǎn)研究所朱善央老師的大力支持,特此表示感謝。

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