10株雞源奇異變形桿菌的質(zhì)粒消除及耐藥性研究

蘇葳藝，李欣南，韓鐫竹

（遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，遼寧 沈陽 110016）

10株雞源奇異變形桿菌的質(zhì)粒消除及耐藥性研究

蘇葳藝，李欣南，韓鐫竹

（遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，遼寧 沈陽 110016）

為建立SDS消除奇異變形桿菌質(zhì)粒的方法，了解奇異變形桿菌的質(zhì)粒與奇異變形桿菌耐藥性表型之間的關(guān)系，采用正交設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方法研究奇異變形桿菌的消除條件，并采用瓊脂糖凝膠電泳的方法進(jìn)行驗(yàn)證，篩選出質(zhì)粒消除效果最佳的試驗(yàn)條件。采用微量稀釋法進(jìn)行質(zhì)粒消除前后奇異變形桿菌對13種抗生素的藥敏性測定。結(jié)果顯示，消除效果最好的條件為消除劑SDS濃度0.2%，溫度42℃，消除72 h。將該組消除后不含質(zhì)粒的奇異變形桿菌與原含質(zhì)粒奇異變形桿進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)，結(jié)果表明，10株雞源奇異變形桿菌消除質(zhì)粒后，其中9株對頭孢噻呋的藥物敏感性由耐藥變?yōu)槊舾小?/p>

奇異變形桿菌；質(zhì)粒消除；耐藥性

奇異變形桿菌（Proteus mirabi l is）屬于變形桿菌屬（proteus），廣泛存在于泥土、水和糞便污染的物質(zhì)中，可引起食物中毒、泌尿系感染等，近年來由奇異變形桿菌引起的食物中毒事件較多[1-6]。雞奇異變形桿菌?。≒roteus mirabi l is disease）是近年來國內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的一種急性熱性細(xì)菌性傳染病[7-8]。該病的特征是食欲下降、翅膀下垂、咳嗽、體溫升高、腹瀉。病雞主要表現(xiàn)為菌血癥、敗血癥，各代，從而造成雛雞的大批死亡。臨床數(shù)據(jù)表明該病的發(fā)病率和死亡率均較高[9]。隨著廣譜抗生素特別是頭孢菌素的大量應(yīng)用，臨床耐藥菌株的產(chǎn)生日益嚴(yán)重，其耐藥性也在不斷增加，給臨床抗感染治療帶來極大的困難[10]。

種日齡的雞群都可感染本病，但以7周齡以下的雛雞最易感，種雞感染本病后可通過種蛋傳給后

細(xì)菌的耐藥性可由染色體遺傳基因介導(dǎo)或質(zhì)粒攜帶的基因介導(dǎo)產(chǎn)生。隨著細(xì)菌耐藥性形成機(jī)制研究的深入，獨(dú)立于細(xì)菌染色體以外的遺傳物質(zhì)——質(zhì)粒所編碼的耐藥性越來越受到重視[11]。本試驗(yàn)通過正交試驗(yàn)的方法來研究奇異變形桿菌的質(zhì)粒消除條件，篩選出質(zhì)粒消除的最佳試驗(yàn)條件，并考察質(zhì)粒消除對試驗(yàn)奇異變形桿菌耐藥表型的影響。

本試驗(yàn)通過正交設(shè)計(jì)的方法來研究奇異變形桿菌的質(zhì)粒消除條件，篩選出質(zhì)粒消除的最佳試驗(yàn)條件，將質(zhì)粒消除前后的菌株進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)，通過比較兩組耐藥性結(jié)果來證明質(zhì)粒對奇異變形桿菌耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器生物安全柜（美國NUAIRE）；全自動高壓滅菌器（日本三洋）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（MEMMERT）；DENSIMAT麥?zhǔn)媳葷醿x（梅里埃）；ABT Expression鑒定儀（梅里埃）；HITACHI CF16RX離心機(jī)（日立）；BIO-RAD紫外凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂）；DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.2 試劑與材料TIAN GEN快速質(zhì)粒小提試劑盒（天根生化科技有限公司）；ID32E鑒定條（梅里埃）；凍干型動物源細(xì)菌藥敏檢測板（天津金章）；甘油（國藥）；SDS（國藥）；TBE Buf fer.（北京普利來技術(shù)有限公司）；Loading Buf fer（大連寶生物）；Marker DL1000、Marker DL2000（大連寶生物）；Agarose Regular瓊脂糖（大連寶生物）；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限公司）；LB肉湯培養(yǎng)基（杭州微生物試劑有限公司）；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（青島高科園海博生物有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的活化 取菌種保藏管中的試驗(yàn)菌株100μL于10 mL營養(yǎng)肉湯中37℃培養(yǎng)24 h，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板，37℃倒置培養(yǎng)24 h，備用。

1.3.2 奇異變形桿菌的鑒定 采用棉簽取1.3.1新鮮培養(yǎng)的單菌落于生理鹽水中，濁度調(diào)至0.5麥?zhǔn)?，然后吸取菌液到ID32E鑒定條按照鑒定條說明進(jìn)行操作，37℃培養(yǎng)24 h，然后放入ABT Expression鑒定儀（梅里埃）中做生化鑒定。

1.3.3 藥物敏感性測定（微量稀釋法） 采用含有13種抗生素的腸道桿菌96孔凍干藥敏板進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。用棉簽取培養(yǎng)好的單菌落于3 mL生理鹽水培養(yǎng)瓶中，放到麥?zhǔn)媳葷醿x中調(diào)菌濃至0.5麥?zhǔn)希?00μL菌液于10 mL MH肉湯培養(yǎng)液的平皿中，搖勻，反復(fù)吸打幾次，然后吸取100μL菌液依次加入到96孔耐藥板中，右下角一個空加入100μL肉湯培養(yǎng)液作為空白對照，最后蓋好蓋子放入培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h。24 h后取出藥敏板，打開蓋子，放在鏡子上觀察，透明的為陰性反應(yīng)（-）即菌體未生長，有渾濁菌液的為陽性反應(yīng)（+）。

1.3.4 奇異變形桿菌的質(zhì)粒提取 用TIAN GEN快速質(zhì)粒小提試劑盒提取10株奇異變形桿菌的質(zhì)粒，按照試劑盒說明書進(jìn)行提取，然后將提取的質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.5 奇異變形桿菌SDS質(zhì)粒的消除的正交試驗(yàn)以消除時間、消除溫度和消除劑濃度作為考察因素，設(shè)計(jì)出9種不同的條件進(jìn)行考察。通過文獻(xiàn)查閱和預(yù)試驗(yàn)確定SDS濃度分別為0.05%、0.1%、0.2%，因素水平表見表1～2。

表1 奇異變形桿菌質(zhì)粒消除影響因素水平表Table1 For singular proteus plasm id elim inate the factors affecting the inspection tab le

表2 奇異變形桿菌消除正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table2 singular proteus elim inates orthogonal experimental design

將含質(zhì)粒奇異變形桿菌的新鮮培養(yǎng)物接種于10 mL LB肉湯的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)24 h。依表1配置不同濃度的SDS LB肉湯，分裝，120℃高壓滅菌15 min。依表2分別加入新鮮LB肉湯培養(yǎng)物10μL，在不同條件下進(jìn)行質(zhì)粒消除試驗(yàn)。消除后進(jìn)行平板培養(yǎng)獲得質(zhì)粒消除菌株。依照1.2.4進(jìn)行質(zhì)粒提取，并通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證。電泳條件為：濃度電泳1%、電泳電壓127 V、電泳時間37 min。

1.3.6 消除質(zhì)粒前后藥敏結(jié)果比較 采用微量稀釋法分別測定消除質(zhì)粒前后同一株奇異變形桿菌的藥敏敏感性，并將結(jié)果進(jìn)行比較和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定對1010株菌株進(jìn)行生化鑒定采用梅里埃半自動細(xì)菌鑒定儀對菌株進(jìn)行鑒定，以生化鑒定作為最終判定標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果10株菌的生化譜顯示均為奇異變形桿菌。表3為奇異變形桿菌生化鑒定譜。

2.2 奇異變形桿菌的質(zhì)粒提取用TIAN GEN快速質(zhì)粒小提試劑盒提取10株奇異變形桿菌的質(zhì)粒，并做瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)檢驗(yàn)質(zhì)粒是否提取到，結(jié)果10株奇異變形桿菌均含有質(zhì)粒，重復(fù)質(zhì)粒提取試驗(yàn)，結(jié)果一致，見圖1。

圖1 奇異桿菌質(zhì)粒消除前，提取質(zhì)粒的電泳圖譜Fig.1 Be fore singular coli plasm id elim ination,the extraction o f plasm id e lectrophoresis

2.3 含質(zhì)粒奇異變形桿菌質(zhì)粒的消除通過正交試驗(yàn)篩選奇異變形桿菌最佳質(zhì)粒消除條件為：消除劑SDS濃度為0.2%，消除溫度42℃，消除時間72 h，電泳圖見圖2。

2.4 質(zhì)粒消除前后奇異變形桿菌的藥物結(jié)果比較質(zhì)粒消除前后藥敏結(jié)果比較如圖3所示，頭孢噻呋的耐藥性在質(zhì)粒消除前后變化較大，由消除前的100%耐藥變?yōu)橄髢H有10%耐藥。阿莫西林的耐藥性由50%增加到70%，而慶大霉素的耐藥性由70%增加到80%。

表3 奇異變形桿菌生化鑒定譜Table3 Proteus m irabilis biochem ical spectrum

圖2 消除時間72 h，消除溫度42℃，消除劑SDS濃度為0.2%的質(zhì)粒提取電泳圖譜Fig.2 To elim inate tim e 72 hours,e lim inate 42℃ tem perature,elim inate the SDS concentration of 0.2%of p lasm id extraction and electrophoresis

圖3 奇異變形桿菌質(zhì)粒消除前后對13種抗生素的耐藥率柱狀圖Fig.3 The singular proteus plasm id elim ination of 13 kinds of antibiotic resistant rate before and after the histogram

3 討論

通過控制變量的方法對質(zhì)粒消除的條件進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在消除劑SDS濃度為0.2%、消除溫度42℃、消除時間72 h時，消除效果最佳。龍海英等[12]報(bào)道大腸埃希菌的SDS消除濃度為0.05%，說明不同菌種的消除條件有著較大差異。

根據(jù)奇異變形桿菌質(zhì)粒消除前后藥敏結(jié)果的比較發(fā)現(xiàn)，頭孢噻呋的耐藥性在質(zhì)粒消除前后變化較大，由消除前的10株全部耐藥變?yōu)橄髢H有1株耐藥9株敏感，說明奇異變形桿菌所含頭孢噻呋耐藥基因部分由質(zhì)粒介導(dǎo)，這一結(jié)果與Yuj i Watanabe[13]報(bào)道變形桿菌所含頭孢呋新耐藥基因部分由質(zhì)粒介導(dǎo)的試驗(yàn)結(jié)果一致，說明奇異變形桿菌的二代、三代頭孢類耐藥基因可能均系質(zhì)粒介導(dǎo)。本試驗(yàn)結(jié)果未發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒消除前后氨芐西林和四環(huán)素耐藥性發(fā)生明顯變化，可以推斷氨芐西林和四環(huán)素的主要耐藥機(jī)制可能不在質(zhì)粒上。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒消除后阿莫西林的耐藥性和慶大霉素的耐藥性發(fā)生微量的變化，但整體耐藥性消除前后變化不大。說明奇異變形桿菌對試驗(yàn)的其他12種抗生素的主要耐藥機(jī)制比較復(fù)雜。

由于獸醫(yī)臨床用藥的不規(guī)范和飼養(yǎng)環(huán)節(jié)長期低劑量使用抗生素，造成細(xì)菌耐藥越來越嚴(yán)重，耐藥機(jī)制越來越復(fù)雜，嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。因此，臨床主要抗生素的耐藥機(jī)制研究，對于控制細(xì)菌耐藥性的蔓延具有重要意義。

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（編輯：張婷婷）

Drug-resistance research and elim ination of drug resistance p lasm ids of 10 strains of chicken source Proteusm irabilis

Su Weiyi,Li Xinnan,Han Juanzhu
(Liaoning province of veterinary feed quality and safety of animal products testing center,Liaoning Shenyang 110016)

To establ ish a SDS method for el iminating Proteus mirabi l is plasmid,understanding the relationship between plasmid and Proteus Baci l lus drug resistance phenotype.To study the el imination conditions of the Proteus mirabi lis using experimental orthogonal method,veri fied the methods with agarose gel elect rophoresis,screened the best experiment conditions to el iminated the plasmid.Proteus drug sensitivity to 13 antibiotics was determined by microdilution method, then plasmid were el iminated.The resul ts showed the best ef fective el iminate tconditions was agent concent ration of SDS 0.2%,temperature 42℃,lasted for 72 hours.Then drug-resistance tests were took place to detect the susceptibil ity of Proteus with and without plasma.The resul ts showed that,10 drug-resistance st rains of chicken source Proteus when el iminated plasmid,9 st rains were sensitive to cef tiofur.

Proteus mirabi l is;Plasmid el imination;Drug resistance

S852.61

：B

：1672-9692(2014)10-0005-05

2014-09-22

蘇葳藝（1987-）男，本科，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品質(zhì)量安全。