• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    PCV2滅活疫苗對小鼠的免疫效果研究

    2014-03-09 06:10:21朱國坡李少麗邵攀峰王斌卿李新華
    現(xiàn)代畜牧獸醫(yī) 2014年10期
    關(guān)鍵詞:圓環(huán)活疫苗熒光

    朱國坡,李少麗,邵攀峰,王斌卿,李新華,2?

    (1.杭州薦量獸用生物制品有限公司,浙江 杭州 310018;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所,浙江 揚(yáng)州 225125)

    PCV2滅活疫苗對小鼠的免疫效果研究

    朱國坡1,李少麗1,邵攀峰1,王斌卿1,李新華1,2?

    (1.杭州薦量獸用生物制品有限公司,浙江 杭州 310018;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所,浙江 揚(yáng)州 225125)

    本研究首先用豬圓環(huán)病毒2型種毒攻擊Balb/c小鼠,通過病毒分離,找出可使全部小鼠感染的最低病毒含量,然后用該種毒攻擊免疫后的Balb/c小鼠,評價(jià)免疫保護(hù)情況。結(jié)果顯示,可使小鼠全部感染的種毒最低病毒含量為106.5TCID50/0.1 m L,當(dāng)疫苗病毒含量為105.5TCID50/0.1 m L時(shí)即可使7/10免疫小鼠得到保護(hù),達(dá)到了疫苗的免疫效果。該研究為現(xiàn)有疫苗的生產(chǎn)工藝改進(jìn)提供了重要的參考數(shù)據(jù)。

    豬圓環(huán)病毒2型;病毒分離;疫苗

    近年來,以豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)為主要病原引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(PDNS)、豬呼吸系統(tǒng)混合疾?。≒RDC)、豬繁殖障礙癥等綜合征候群給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,據(jù)報(bào)道,在歐洲該類病每年就可造成約6億歐元的損失[1-3]。目前,預(yù)防該類疾病的首選是應(yīng)用疫苗免疫接種。在我國,已有上市的商品化疫苗6種,其中勃林格殷格翰動(dòng)物保?。绹┯邢薰镜腜CV2亞單位疫苗的安全性及有效性都得到了試驗(yàn)肯定,然而該疫苗價(jià)格昂貴[4]。我國自主品牌疫苗均為全病毒滅活苗,由于病毒體外增殖能力差,抗原含量普遍不高,生產(chǎn)中批間質(zhì)量較難統(tǒng)一,免疫效果評價(jià)困難,生產(chǎn)工藝需要進(jìn)一步改進(jìn),疫苗質(zhì)量有很大的提升空間[5-6]。本研究依據(jù)現(xiàn)有疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),首先用自制的PCV2滅活疫苗免疫小鼠,然后攻毒并進(jìn)行病毒分離,探索合格疫苗的最低抗原含量,為疫苗生產(chǎn)工藝改進(jìn)提供數(shù)據(jù)參考。

    1 材料和方法

    1.1 主要材料和試劑PCV2滅活疫苗(O/W)、PCV2種毒(ZJ/C株)、PK15細(xì)胞均由杭州薦量獸用生物制品有限公司制備和保存;MEM營養(yǎng)液、胎牛血清購自Gibco公司;Balb/c雌性小鼠,SPF級,購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司;PCV2單克隆抗體購自浙江同點(diǎn)生物科技有限公司;FITC-羊抗鼠抗體購自美國KPL公司。

    1.2 PCV 22對小鼠的致病性取6~8周齡Balb/c小鼠40只隨即分成A、B、C、D共4組,每組10只。各組小鼠分別用病毒含量為105.5、106.0、106.5、107.0TCID50/0.1 mL的PCV2種毒攻擊,腹腔注射0.45 mL/只,另設(shè)10只小鼠作為不注射空白對照組。接種后21 d,撲殺所有小鼠,無菌采集所有小鼠脾臟進(jìn)行病毒分離,分離到病毒即判為病毒分離陽性。

    1.3 豬圓環(huán)病毒22型滅活疫苗最小免疫劑量試驗(yàn)該方法參照“豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗(ZJ/C株)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中“小鼠免疫攻毒法”進(jìn)行[7]。取抗原 病 毒 含 量 分 別 為 105.0、 105.5、 106.15、 106.5TCID50/0.1 mL的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗分別腹腔注射免疫6~8周齡Balb/c小鼠各10只,每只0.2 mL,同時(shí)設(shè)10只不免疫小鼠作為對照。免疫后21 d,連同對照小鼠,用100%使小鼠致病的PCV2種毒攻擊,每只小鼠腹腔注射0.45 mL。攻毒后21 d,撲殺,取脾臟進(jìn)行病毒分離,分離到病毒即判為病毒分離陽性,分離不到病毒即為保護(hù)。

    1.4 病毒分離

    1.4.1 組織處理 取小鼠脾臟,按每0.05 g組織加入1 mL無菌的MEM無血清培養(yǎng)液后,研磨制備勻漿,反復(fù)凍融3次。組織勻漿以12 000 r/min離心10 min,收集上清,用0.22μm的一次性針頭濾器過濾除菌,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4.2 分離培養(yǎng) PK15細(xì)胞單層用0.02%EDTA-0.05%胰酶在37℃條件下消化6~10 min,用含8%胎牛血清的MEM細(xì)胞生長液制成濃度為2×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液,按照1.5 mL/孔將細(xì)胞懸液加入到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取小鼠脾臟組織懸液各0.15 mL,分別接種到以上細(xì)胞板中,輕輕震蕩混勻,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收獲細(xì)胞板,反復(fù)凍融3次,12 000 r/min離心10 min,取上清液作為第1代接種物。取第1代接種物按上述方法再盲傳1代,作為第2代接種物。

    1.4.3 檢測 將用含8%胎牛血清MEM營養(yǎng)液制備的2×105個(gè)/mL的PK15細(xì)胞懸液加入到96孔細(xì)胞板中,每孔100μL,然后取上述第2代接種物10μL同步接種于96孔板中,每個(gè)樣品2孔,同時(shí)設(shè)PCV2陽性對照和細(xì)胞空白對照各2孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h,棄細(xì)胞培養(yǎng)液,每孔加入100μL冷丙酮固定液,-20℃固定30 min,棄固定液,自然晾干備用。

    1.4.4 結(jié)果判定 參照Tischer等[8]、崔尚金等[9]方法進(jìn)行間接免疫熒光IFA鑒定,一抗為PCV2單克隆抗體,二抗為FITC-羊抗鼠熒光抗體。在倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。陽性對照孔應(yīng)出現(xiàn)綠色熒光,陰性對照孔應(yīng)無綠色熒光,樣品孔有綠色熒光細(xì)胞的判為陽性,無綠色熒光細(xì)胞的判為陰性。

    2 結(jié)果和分析

    2.1 PCV 22對小鼠的致病性通過病毒分離可以看到,小鼠樣品病毒分離陽性的在熒光顯微鏡下可見到翠綠色熒光,并且無干擾背景,而空白對照組未見熒光(見圖1)。其中,種毒病毒含量為105.5TCID50/0.1 mL時(shí)病毒分離陽性數(shù)為6/10,種毒病毒含量為106.0TCID50/0.1 mL時(shí)病毒分離陽性數(shù)為9/10,種毒病毒含量為106.5和107.0TCID50/ 0.1 mL時(shí)病毒分離陽性數(shù)均為10/10,空白對照組病毒分離陽性數(shù)為0/10(見圖2)。據(jù)此結(jié)果選擇10/10使小鼠致病最低病毒含量種毒的C組作為小鼠免疫攻毒用種毒,即106.5TCID50/0.1 mL。

    圖1 攻毒小鼠病毒分離間接免疫熒光檢測(×200)Fig.1 The viral isolation result of injected m ice by IFA(× 200)

    圖2 PCV2對Ba lb/c小鼠的致病性Fig.2 The pathogenicity of PCV2 on Balb/c m ice

    2

    2.2 豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗最小免疫劑量試驗(yàn)當(dāng)疫苗中抗原病毒含量為105.0TCID50/0.1 mL時(shí)可使小鼠5/10保護(hù),當(dāng)疫苗中抗原病毒含量為105.5TCID50/0.1 mL時(shí)可使小鼠7/10保護(hù),當(dāng)疫苗中抗原病毒含量為106.15TCID50/0.1 mL以上時(shí)可使小鼠10/ 10保護(hù),見表1。

    表1 豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗對小鼠的最小免疫劑量試驗(yàn)Table1 The m inimum immune dose of PCV2 inactivated vaccine on m ice

    3 討論

    評價(jià)動(dòng)物疫苗免疫效果的最直接方法是對試驗(yàn)動(dòng)物的免疫攻毒。由于豬圓環(huán)病毒病的發(fā)病率高達(dá)50%,陰性豬難以篩選[1],再者豬體試驗(yàn)費(fèi)用高,因此選用替代動(dòng)物來評價(jià)免疫效果是十分必要的。由于小鼠和豬的親緣關(guān)系較近,遺傳學(xué)背景清楚,具有價(jià)廉、試驗(yàn)周期短、易于飼養(yǎng)和操作等優(yōu)點(diǎn),許多疾病可以此為動(dòng)物模型進(jìn)行相關(guān)研究。國外,Kiupel等[10]、Quintana等[11]證實(shí)PCV2可以感染Balb/c小鼠,為后續(xù)研究提供了重要依據(jù)。我國現(xiàn)有PCV2疫苗的ZJ/C株和SH株的效果評價(jià)也已選用Balb/c小鼠作為替代動(dòng)物,其中SH株采用ELISA測抗體法,ZJ/C株采用分離病毒的方法。

    ELISA抗體檢測法由于方便、快捷省時(shí)、成本低廉被許多學(xué)者所采用。董信田等[12]通過ELISA方法檢測小鼠抗體,證實(shí)PCV2油佐劑和鋁膠佐劑滅活疫苗免疫小鼠后均能產(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答,并且油佐劑滅活疫苗免疫效果好于鋁膠佐劑滅活疫苗。王建龍等[13]用制備的PCV2 DNA疫苗免疫小鼠,發(fā)現(xiàn)免疫后第14天小鼠血清ELISA抗體水平達(dá)到峰值,加強(qiáng)免疫后抗體水平無顯著變化。而病毒分離方法結(jié)果判定更為直接,并且也最為準(zhǔn)確可靠。因此,本研究中也采用免疫攻毒后分離病毒的方法,通過間接免疫熒光法(IFA)檢測,熒光顯微鏡判定結(jié)果,不僅特異而且易于判定。通過致病性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可使小鼠10/10感染的最低病毒含量為106.5TCID50/0.1 mL。用該種毒攻擊PCV2滅活疫苗免疫后的小鼠,通過病毒分離發(fā)現(xiàn),當(dāng)疫苗抗原病毒含量為105.0TCID50/0.1 mL時(shí),可使小鼠5/10保護(hù),而當(dāng)疫苗抗原病毒含量為105.5TCID50/0.1 mL時(shí),即可使小鼠7/10保護(hù),達(dá)到疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求,說明所制備的疫苗具有較好的免疫效果,為疫苗生產(chǎn)工藝的改進(jìn)提供了重要的數(shù)據(jù)參考。

    [1]郎洪武,陳曉春,吳華偉,等.豬圓環(huán)病毒病及其生物制品學(xué)的研究進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2012,42(5):545-550.

    [2]SEGALES J.Update on post weaning mul ti-systemic wasting syndrome and porcine dermatitis and nephropathy syndrome diagnostics[J]. J Swine Heal th Prod,2002,10(6)∶277-281.

    [3]GRAU-ROMA L,CRISCI E,SIBILA M,et al.A proposal on porcine circovirus type 2(PCV2)genotype def inition and their relation with postweaning mul tisystemic wasting syndrome occurrence[J].Vet Microbiol, 2008, 128(1/2)∶23-35.

    [4]郎洪武.豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的家蠶表達(dá)及亞單位疫苗在小鼠和仔豬的免疫效力試驗(yàn)[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,2013.

    [5] 李郁,魏建忠,蘇金存,等[P].中國專利:201010138882.X,2010-04-02.

    [6]鄧秋紅,鄭潔,劉延亭,等.國內(nèi)商品化豬圓環(huán)病毒疫苗的現(xiàn)狀及展望[J].中國獸藥雜志,2014,48(2):67-69.

    [7]農(nóng)業(yè)部公告第1893號.

    [8]Tischer I,Peters D,Rasch R,et al.Repl ication of porcine circovirus∶induction by glucosa mine and cel l dependence[J].Arch Virol, 1987,96∶39-57

    [9]崔尚金,金滟平,李曦,等.豬圓環(huán)病毒間接免疫熒光方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,29(1):63-66.

    [10]KIUPEL M,STEVENSON G W,CHOI J,et al.Viral repl ication and lesions in BALB/c mice experimental ly inoculated with porcine circovirus isolated f rom a pig with postweaning mul tisystemic wasting disease[J].Vet Pathol, 2001,38(1)∶74-82.

    [11]QUINTANA J,BALASCH M,SEGALES J M,et al. Experimental inoculation of porcine circoviruses type 1(PCV1)and type2(PCV2)in rabbits and mice[J].Vet Res,2002,33(3)∶229-237.

    [12]董信田,李玉峰,姜平,等.豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的制備與免疫效力研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,39(5):639-644.

    [13]王建龍,趙路易,張洪利,等.豬圓環(huán)病毒2型DNA疫苗對小鼠的買內(nèi)衣效果[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008,36(4):53-57.

    (編輯:張婷婷)

    Immuno-efficacy of inactivated PCV2 vaccine inm ice

    Zhu Guopo1,Li Shaol i1,Shao Panfeng1,Wang Binqing1,Li Xinhua1,2*
    (1.Hangzhou Jianl iang Veterinary Biological Preparations Co.Ltd.,Zhej iang Hangzhou 310018; 2.Poult ry Institute,Chinese Academy of Agricul tural Sciences,Zhejiang Yangzhou 225125)

    To evaluate the immune ef f icacy of porcine cirovirus type 2 vaccine,the viral isolation method was used to get the minimum content of PCV2 which can infect al l the Balb/c mice. Then,mice which had been immunized by inactivated vaccine were injected with this virus,and analyzed the protective ef fect.Resul ts showed that the minimum content of porcine circovirus type 2 can infect al l the Balb/c mice is 106.5TCID50/0.1 mL.The vaccine can protect the seven tenths of the mice with a viral content of 105.5TCID50/0.1 mL,and reach to the immune ef fect.The research could provide an impor tant reference data for improving the production process of existing vaccine.

    Porcine circovirus type 2;Viral isolation;Vaccine

    S858.28

    :B

    :1672-9692(2014)10-0033-04

    2014-08-05

    朱國坡(1980-),男,碩士,獸醫(yī)師,主要從事動(dòng)物疫苗研發(fā)方面工作。

    猜你喜歡
    圓環(huán)活疫苗熒光
    新冠病毒滅活疫苗誕生記
    加權(quán)全能量最小的圓環(huán)形變
    干式熒光發(fā)光法在HBV感染診療中應(yīng)用價(jià)值
    豬圓環(huán)病毒病的發(fā)生、診斷和防治
    一例鴨圓環(huán)病毒病的診斷
    圓環(huán)上的覆蓋曲面不等式及其應(yīng)用
    高熒光量子產(chǎn)率BODIPY衍生物的熒光性能研究
    鴨黃病毒滅活疫苗的制備與免疫效力研究
    滴鼻免疫布氏菌活疫苗保護(hù)效果的研究
    番鴨呼腸孤病毒活疫苗的推廣應(yīng)用
    色网站视频免费| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 国国产精品蜜臀av免费| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 夜夜爽夜夜爽视频| 99热这里只有精品一区| 观看av在线不卡| 色5月婷婷丁香| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲自偷自拍三级| 日韩强制内射视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲欧美精品专区久久| 免费观看av网站的网址| 两个人的视频大全免费| 十八禁网站网址无遮挡 | 尾随美女入室| 晚上一个人看的免费电影| 大片免费播放器 马上看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久久久久久久大av| 在线观看国产h片| 九色成人免费人妻av| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 三级国产精品片| 亚洲图色成人| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久人人爽人人爽人人片va| 午夜av观看不卡| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久人人爽人人片av| 久久久久久人妻| 久久久a久久爽久久v久久| 51国产日韩欧美| 一本大道久久a久久精品| 日韩大片免费观看网站| 国产精品无大码| 国产伦精品一区二区三区视频9| 91久久精品国产一区二区三区| 在线观看国产h片| 亚洲真实伦在线观看| 最近中文字幕2019免费版| 九草在线视频观看| 涩涩av久久男人的天堂| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 黑人高潮一二区| 国产真实伦视频高清在线观看| 久久人妻熟女aⅴ| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 日韩成人伦理影院| 国产精品久久久久久久电影| 女人精品久久久久毛片| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 看十八女毛片水多多多| 国产在线男女| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 成年av动漫网址| 国产毛片在线视频| 色94色欧美一区二区| 99久久精品一区二区三区| 97在线人人人人妻| 久久久久网色| 美女cb高潮喷水在线观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 美女视频免费永久观看网站| 欧美97在线视频| 少妇精品久久久久久久| a级毛色黄片| 人妻系列 视频| 婷婷色av中文字幕| 久久人人爽人人片av| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产av国产精品国产| 少妇 在线观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 免费人妻精品一区二区三区视频| 岛国毛片在线播放| 97超碰精品成人国产| 亚洲丝袜综合中文字幕| av黄色大香蕉| 一级爰片在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 能在线免费看毛片的网站| 日日爽夜夜爽网站| 大片电影免费在线观看免费| 日本wwww免费看| 最黄视频免费看| av在线观看视频网站免费| av免费观看日本| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 波野结衣二区三区在线| 日韩成人伦理影院| 在线播放无遮挡| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 久久久亚洲精品成人影院| 国产免费视频播放在线视频| 一级毛片久久久久久久久女| 欧美少妇被猛烈插入视频| 777米奇影视久久| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久久久久人妻| 中文字幕免费在线视频6| 国产日韩欧美视频二区| 午夜福利视频精品| 国产成人a∨麻豆精品| videossex国产| 国产精品一二三区在线看| av在线老鸭窝| 九九爱精品视频在线观看| 免费看av在线观看网站| 最近手机中文字幕大全| 亚洲va在线va天堂va国产| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 免费黄网站久久成人精品| 十八禁网站网址无遮挡 | 九九久久精品国产亚洲av麻豆| av免费观看日本| 插逼视频在线观看| 欧美区成人在线视频| 大话2 男鬼变身卡| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲精品第二区| 精品一区二区三卡| 尾随美女入室| 赤兔流量卡办理| tube8黄色片| 久久久a久久爽久久v久久| 乱人伦中国视频| 精品一区二区三卡| 国产永久视频网站| 成人国产av品久久久| 波野结衣二区三区在线| 国产精品国产三级专区第一集| 日韩av免费高清视频| av天堂久久9| 人人澡人人妻人| av国产久精品久网站免费入址| 午夜91福利影院| 亚洲四区av| 欧美丝袜亚洲另类| 成年女人在线观看亚洲视频| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲av.av天堂| av免费观看日本| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲精品自拍成人| 日日啪夜夜撸| 视频区图区小说| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产成人aa在线观看| 性色av一级| 老司机影院成人| 我要看黄色一级片免费的| 国产亚洲精品久久久com| 欧美日韩av久久| 久久久久久人妻| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 午夜久久久在线观看| 99热网站在线观看| 大码成人一级视频| 大码成人一级视频| 免费大片18禁| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产69精品久久久久777片| 国产日韩欧美视频二区| av免费在线看不卡| av一本久久久久| 最近手机中文字幕大全| 丰满少妇做爰视频| 日韩精品有码人妻一区| 久久久久久伊人网av| 一级a做视频免费观看| 国产精品女同一区二区软件| 91久久精品国产一区二区成人| 插阴视频在线观看视频| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 久久精品久久久久久久性| 成人特级av手机在线观看| 亚洲美女视频黄频| 少妇高潮的动态图| 岛国毛片在线播放| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 久久久久久久久久久久大奶| 午夜av观看不卡| 久久久精品94久久精品| 99久久综合免费| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 一级毛片aaaaaa免费看小| 91aial.com中文字幕在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 丰满人妻一区二区三区视频av| 久久久国产精品麻豆| 各种免费的搞黄视频| 老司机影院成人| 一个人免费看片子| 久久久久国产网址| 免费av不卡在线播放| 日本黄色日本黄色录像| 国产在线免费精品| 日韩在线高清观看一区二区三区| 伦理电影大哥的女人| 我的女老师完整版在线观看| 三上悠亚av全集在线观看 | 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 日本av免费视频播放| 一区二区av电影网| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产亚洲精品久久久com| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 最后的刺客免费高清国语| 国产在线男女| 亚洲av中文av极速乱| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲精品乱久久久久久| 夫妻午夜视频| 国模一区二区三区四区视频| 国产成人一区二区在线| 日韩欧美精品免费久久| 两个人免费观看高清视频 | 日本av手机在线免费观看| 大片免费播放器 马上看| 最后的刺客免费高清国语| 91精品伊人久久大香线蕉| 久久午夜福利片| 水蜜桃什么品种好| 婷婷色av中文字幕| 波野结衣二区三区在线| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产日韩欧美亚洲二区| av福利片在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 国产成人91sexporn| av天堂久久9| 好男人视频免费观看在线| 麻豆乱淫一区二区| 2022亚洲国产成人精品| 大片电影免费在线观看免费| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲人成网站在线观看播放| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产成人91sexporn| 校园人妻丝袜中文字幕| 老司机影院成人| 97在线人人人人妻| 一个人看视频在线观看www免费| 日韩大片免费观看网站| 伊人久久国产一区二区| freevideosex欧美| 91在线精品国自产拍蜜月| 少妇 在线观看| 国产日韩欧美视频二区| 另类精品久久| 日本欧美视频一区| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久午夜综合久久蜜桃| 午夜免费观看性视频| 亚洲av男天堂| 国产乱人偷精品视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 最近中文字幕高清免费大全6| 丰满饥渴人妻一区二区三| 99热这里只有是精品50| 伦理电影大哥的女人| 久久99精品国语久久久| 天堂8中文在线网| 国产视频内射| 国产毛片在线视频| 亚洲精品国产成人久久av| 乱码一卡2卡4卡精品| 男女啪啪激烈高潮av片| 偷拍熟女少妇极品色| 最近的中文字幕免费完整| 高清在线视频一区二区三区| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产免费福利视频在线观看| 日日撸夜夜添| 一本久久精品| 日韩视频在线欧美| 熟女电影av网| 亚洲天堂av无毛| 精品午夜福利在线看| 乱系列少妇在线播放| 国产成人午夜福利电影在线观看| 久久热精品热| av在线播放精品| 在线播放无遮挡| 国国产精品蜜臀av免费| a级一级毛片免费在线观看| 视频区图区小说| 最后的刺客免费高清国语| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 99久久精品一区二区三区| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲怡红院男人天堂| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 观看免费一级毛片| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久6这里有精品| kizo精华| 日本wwww免费看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 在线观看www视频免费| 欧美老熟妇乱子伦牲交| av在线观看视频网站免费| 精品一区在线观看国产| 久久国内精品自在自线图片| 新久久久久国产一级毛片| 精品熟女少妇av免费看| 日韩三级伦理在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 十分钟在线观看高清视频www | 午夜视频国产福利| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久人人爽人人片av| 伦理电影大哥的女人| 草草在线视频免费看| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 日韩欧美 国产精品| 日韩av免费高清视频| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 精品国产一区二区久久| 精品一区二区三区视频在线| 美女中出高潮动态图| 午夜av观看不卡| 日韩亚洲欧美综合| 日韩欧美 国产精品| 老司机亚洲免费影院| 日本-黄色视频高清免费观看| 最近手机中文字幕大全| 寂寞人妻少妇视频99o| 日日摸夜夜添夜夜爱| 欧美一级a爱片免费观看看| 中文天堂在线官网| 亚洲国产欧美在线一区| 精品久久久精品久久久| 新久久久久国产一级毛片| 国产av精品麻豆| 亚州av有码| 亚洲精品第二区| av天堂中文字幕网| 91精品国产国语对白视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产精品成人在线| 欧美少妇被猛烈插入视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美精品高潮呻吟av久久| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 日韩电影二区| 久久99蜜桃精品久久| 人妻人人澡人人爽人人| 久久久久久久久久成人| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 久久99一区二区三区| 老司机亚洲免费影院| 插逼视频在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 在线观看一区二区三区激情| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲精品日韩av片在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 熟女电影av网| 人人澡人人妻人| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久久久国产精品人妻一区二区| 一区二区三区精品91| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产黄频视频在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 日韩精品有码人妻一区| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲精品自拍成人| 高清欧美精品videossex| 欧美+日韩+精品| 免费观看a级毛片全部| 久久午夜福利片| 国产又色又爽无遮挡免| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 久久午夜福利片| 国产色爽女视频免费观看| 街头女战士在线观看网站| 欧美精品亚洲一区二区| 国产精品偷伦视频观看了| 国产一级毛片在线| 日韩av在线免费看完整版不卡| 一级毛片我不卡| 两个人免费观看高清视频 | 黄色毛片三级朝国网站 | 国产精品福利在线免费观看| 一级毛片电影观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美日韩在线观看h| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久久久久久久大av| 国产一区有黄有色的免费视频| 大片电影免费在线观看免费| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产亚洲91精品色在线| 特大巨黑吊av在线直播| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 欧美另类一区| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲成色77777| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产精品久久久久久精品电影小说| 免费大片黄手机在线观看| 免费观看无遮挡的男女| 欧美日韩综合久久久久久| 一区二区三区乱码不卡18| 日本-黄色视频高清免费观看| 成人无遮挡网站| 亚洲国产精品999| 日韩三级伦理在线观看| 水蜜桃什么品种好| 中文资源天堂在线| 成人国产麻豆网| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久久久久人妻| 久久99一区二区三区| 一区二区三区乱码不卡18| 日本-黄色视频高清免费观看| 91久久精品国产一区二区成人| 熟女av电影| 一级片'在线观看视频| 国产爽快片一区二区三区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 日韩av免费高清视频| 国产日韩欧美视频二区| 九草在线视频观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 人体艺术视频欧美日本| 久久综合国产亚洲精品| 人妻少妇偷人精品九色| 一本久久精品| 最近中文字幕2019免费版| 美女福利国产在线| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 新久久久久国产一级毛片| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲四区av| 岛国毛片在线播放| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 精品国产乱码久久久久久小说| 丝瓜视频免费看黄片| 色5月婷婷丁香| 搡老乐熟女国产| 午夜免费男女啪啪视频观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 欧美xxⅹ黑人| 久久精品久久精品一区二区三区| 人妻 亚洲 视频| 七月丁香在线播放| 久久久久久久大尺度免费视频| 日韩一本色道免费dvd| 日韩亚洲欧美综合| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 春色校园在线视频观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 欧美丝袜亚洲另类| 欧美精品一区二区免费开放| 国产视频内射| 欧美xxⅹ黑人| videossex国产| 一个人看视频在线观看www免费| 国产男女内射视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 免费人妻精品一区二区三区视频| 乱系列少妇在线播放| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲综合精品二区| 国产熟女欧美一区二区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| av在线app专区| 精品一区二区免费观看| 国产91av在线免费观看| 街头女战士在线观看网站| 丝袜脚勾引网站| 国产男女超爽视频在线观看| 久久久久久久精品精品| 久久婷婷青草| 亚洲精品色激情综合| 久久精品国产亚洲av天美| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 99久久精品国产国产毛片| 人妻夜夜爽99麻豆av| 成年人午夜在线观看视频| 三级国产精品欧美在线观看| 99久久综合免费| 伊人久久精品亚洲午夜| a级毛片免费高清观看在线播放| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 人人妻人人澡人人看| 中文字幕亚洲精品专区| 久久久久国产网址| 国产精品女同一区二区软件| 伦精品一区二区三区| 国产成人免费无遮挡视频| 中文天堂在线官网| 自线自在国产av| av免费在线看不卡| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产精品人妻久久久影院| 观看免费一级毛片| 色婷婷av一区二区三区视频| 中文字幕制服av| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲av综合色区一区| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产美女午夜福利| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲精品国产av成人精品| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产精品久久久久成人av| 日韩av在线免费看完整版不卡| 欧美3d第一页| 美女主播在线视频| 久久久久久人妻| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲精品456在线播放app| 国产黄频视频在线观看| 人妻系列 视频| 午夜日本视频在线| 国产成人aa在线观看| 日日啪夜夜撸| 免费看av在线观看网站| 中文欧美无线码| 成人二区视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产在线一区二区三区精| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 91精品伊人久久大香线蕉| 插逼视频在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 久久午夜福利片| 熟女电影av网| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲第一区二区三区不卡| 一本一本综合久久| 久久热精品热| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产精品国产三级专区第一集| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲美女视频黄频| 中文资源天堂在线| 美女内射精品一级片tv| 男女免费视频国产| 国产美女午夜福利| 国产精品偷伦视频观看了| 性色av一级| 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲精品国产av蜜桃| 精品国产乱码久久久久久小说| 欧美成人精品欧美一级黄| 美女主播在线视频| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲自偷自拍三级| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产成人一区二区在线| 我要看黄色一级片免费的| av播播在线观看一区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲久久久国产精品| 日本爱情动作片www.在线观看| 少妇高潮的动态图| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 男女边摸边吃奶| 免费看日本二区| 九色成人免费人妻av| 国产欧美亚洲国产| 一本大道久久a久久精品| 日韩一本色道免费dvd| 色视频www国产| 搡女人真爽免费视频火全软件| 精品人妻一区二区三区麻豆| 97超视频在线观看视频| 成年女人在线观看亚洲视频| 多毛熟女@视频| 国产毛片在线视频|