• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    PCV2滅活疫苗對小鼠的免疫效果研究

    2014-03-09 06:10:21朱國坡李少麗邵攀峰王斌卿李新華
    現(xiàn)代畜牧獸醫(yī) 2014年10期
    關(guān)鍵詞:圓環(huán)活疫苗熒光

    朱國坡,李少麗,邵攀峰,王斌卿,李新華,2?

    (1.杭州薦量獸用生物制品有限公司,浙江 杭州 310018;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所,浙江 揚(yáng)州 225125)

    PCV2滅活疫苗對小鼠的免疫效果研究

    朱國坡1,李少麗1,邵攀峰1,王斌卿1,李新華1,2?

    (1.杭州薦量獸用生物制品有限公司,浙江 杭州 310018;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所,浙江 揚(yáng)州 225125)

    本研究首先用豬圓環(huán)病毒2型種毒攻擊Balb/c小鼠,通過病毒分離,找出可使全部小鼠感染的最低病毒含量,然后用該種毒攻擊免疫后的Balb/c小鼠,評價(jià)免疫保護(hù)情況。結(jié)果顯示,可使小鼠全部感染的種毒最低病毒含量為106.5TCID50/0.1 m L,當(dāng)疫苗病毒含量為105.5TCID50/0.1 m L時(shí)即可使7/10免疫小鼠得到保護(hù),達(dá)到了疫苗的免疫效果。該研究為現(xiàn)有疫苗的生產(chǎn)工藝改進(jìn)提供了重要的參考數(shù)據(jù)。

    豬圓環(huán)病毒2型;病毒分離;疫苗

    近年來,以豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)為主要病原引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(PDNS)、豬呼吸系統(tǒng)混合疾?。≒RDC)、豬繁殖障礙癥等綜合征候群給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,據(jù)報(bào)道,在歐洲該類病每年就可造成約6億歐元的損失[1-3]。目前,預(yù)防該類疾病的首選是應(yīng)用疫苗免疫接種。在我國,已有上市的商品化疫苗6種,其中勃林格殷格翰動(dòng)物保?。绹┯邢薰镜腜CV2亞單位疫苗的安全性及有效性都得到了試驗(yàn)肯定,然而該疫苗價(jià)格昂貴[4]。我國自主品牌疫苗均為全病毒滅活苗,由于病毒體外增殖能力差,抗原含量普遍不高,生產(chǎn)中批間質(zhì)量較難統(tǒng)一,免疫效果評價(jià)困難,生產(chǎn)工藝需要進(jìn)一步改進(jìn),疫苗質(zhì)量有很大的提升空間[5-6]。本研究依據(jù)現(xiàn)有疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),首先用自制的PCV2滅活疫苗免疫小鼠,然后攻毒并進(jìn)行病毒分離,探索合格疫苗的最低抗原含量,為疫苗生產(chǎn)工藝改進(jìn)提供數(shù)據(jù)參考。

    1 材料和方法

    1.1 主要材料和試劑PCV2滅活疫苗(O/W)、PCV2種毒(ZJ/C株)、PK15細(xì)胞均由杭州薦量獸用生物制品有限公司制備和保存;MEM營養(yǎng)液、胎牛血清購自Gibco公司;Balb/c雌性小鼠,SPF級,購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司;PCV2單克隆抗體購自浙江同點(diǎn)生物科技有限公司;FITC-羊抗鼠抗體購自美國KPL公司。

    1.2 PCV 22對小鼠的致病性取6~8周齡Balb/c小鼠40只隨即分成A、B、C、D共4組,每組10只。各組小鼠分別用病毒含量為105.5、106.0、106.5、107.0TCID50/0.1 mL的PCV2種毒攻擊,腹腔注射0.45 mL/只,另設(shè)10只小鼠作為不注射空白對照組。接種后21 d,撲殺所有小鼠,無菌采集所有小鼠脾臟進(jìn)行病毒分離,分離到病毒即判為病毒分離陽性。

    1.3 豬圓環(huán)病毒22型滅活疫苗最小免疫劑量試驗(yàn)該方法參照“豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗(ZJ/C株)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中“小鼠免疫攻毒法”進(jìn)行[7]。取抗原 病 毒 含 量 分 別 為 105.0、 105.5、 106.15、 106.5TCID50/0.1 mL的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗分別腹腔注射免疫6~8周齡Balb/c小鼠各10只,每只0.2 mL,同時(shí)設(shè)10只不免疫小鼠作為對照。免疫后21 d,連同對照小鼠,用100%使小鼠致病的PCV2種毒攻擊,每只小鼠腹腔注射0.45 mL。攻毒后21 d,撲殺,取脾臟進(jìn)行病毒分離,分離到病毒即判為病毒分離陽性,分離不到病毒即為保護(hù)。

    1.4 病毒分離

    1.4.1 組織處理 取小鼠脾臟,按每0.05 g組織加入1 mL無菌的MEM無血清培養(yǎng)液后,研磨制備勻漿,反復(fù)凍融3次。組織勻漿以12 000 r/min離心10 min,收集上清,用0.22μm的一次性針頭濾器過濾除菌,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4.2 分離培養(yǎng) PK15細(xì)胞單層用0.02%EDTA-0.05%胰酶在37℃條件下消化6~10 min,用含8%胎牛血清的MEM細(xì)胞生長液制成濃度為2×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液,按照1.5 mL/孔將細(xì)胞懸液加入到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取小鼠脾臟組織懸液各0.15 mL,分別接種到以上細(xì)胞板中,輕輕震蕩混勻,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收獲細(xì)胞板,反復(fù)凍融3次,12 000 r/min離心10 min,取上清液作為第1代接種物。取第1代接種物按上述方法再盲傳1代,作為第2代接種物。

    1.4.3 檢測 將用含8%胎牛血清MEM營養(yǎng)液制備的2×105個(gè)/mL的PK15細(xì)胞懸液加入到96孔細(xì)胞板中,每孔100μL,然后取上述第2代接種物10μL同步接種于96孔板中,每個(gè)樣品2孔,同時(shí)設(shè)PCV2陽性對照和細(xì)胞空白對照各2孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h,棄細(xì)胞培養(yǎng)液,每孔加入100μL冷丙酮固定液,-20℃固定30 min,棄固定液,自然晾干備用。

    1.4.4 結(jié)果判定 參照Tischer等[8]、崔尚金等[9]方法進(jìn)行間接免疫熒光IFA鑒定,一抗為PCV2單克隆抗體,二抗為FITC-羊抗鼠熒光抗體。在倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。陽性對照孔應(yīng)出現(xiàn)綠色熒光,陰性對照孔應(yīng)無綠色熒光,樣品孔有綠色熒光細(xì)胞的判為陽性,無綠色熒光細(xì)胞的判為陰性。

    2 結(jié)果和分析

    2.1 PCV 22對小鼠的致病性通過病毒分離可以看到,小鼠樣品病毒分離陽性的在熒光顯微鏡下可見到翠綠色熒光,并且無干擾背景,而空白對照組未見熒光(見圖1)。其中,種毒病毒含量為105.5TCID50/0.1 mL時(shí)病毒分離陽性數(shù)為6/10,種毒病毒含量為106.0TCID50/0.1 mL時(shí)病毒分離陽性數(shù)為9/10,種毒病毒含量為106.5和107.0TCID50/ 0.1 mL時(shí)病毒分離陽性數(shù)均為10/10,空白對照組病毒分離陽性數(shù)為0/10(見圖2)。據(jù)此結(jié)果選擇10/10使小鼠致病最低病毒含量種毒的C組作為小鼠免疫攻毒用種毒,即106.5TCID50/0.1 mL。

    圖1 攻毒小鼠病毒分離間接免疫熒光檢測(×200)Fig.1 The viral isolation result of injected m ice by IFA(× 200)

    圖2 PCV2對Ba lb/c小鼠的致病性Fig.2 The pathogenicity of PCV2 on Balb/c m ice

    2

    2.2 豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗最小免疫劑量試驗(yàn)當(dāng)疫苗中抗原病毒含量為105.0TCID50/0.1 mL時(shí)可使小鼠5/10保護(hù),當(dāng)疫苗中抗原病毒含量為105.5TCID50/0.1 mL時(shí)可使小鼠7/10保護(hù),當(dāng)疫苗中抗原病毒含量為106.15TCID50/0.1 mL以上時(shí)可使小鼠10/ 10保護(hù),見表1。

    表1 豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗對小鼠的最小免疫劑量試驗(yàn)Table1 The m inimum immune dose of PCV2 inactivated vaccine on m ice

    3 討論

    評價(jià)動(dòng)物疫苗免疫效果的最直接方法是對試驗(yàn)動(dòng)物的免疫攻毒。由于豬圓環(huán)病毒病的發(fā)病率高達(dá)50%,陰性豬難以篩選[1],再者豬體試驗(yàn)費(fèi)用高,因此選用替代動(dòng)物來評價(jià)免疫效果是十分必要的。由于小鼠和豬的親緣關(guān)系較近,遺傳學(xué)背景清楚,具有價(jià)廉、試驗(yàn)周期短、易于飼養(yǎng)和操作等優(yōu)點(diǎn),許多疾病可以此為動(dòng)物模型進(jìn)行相關(guān)研究。國外,Kiupel等[10]、Quintana等[11]證實(shí)PCV2可以感染Balb/c小鼠,為后續(xù)研究提供了重要依據(jù)。我國現(xiàn)有PCV2疫苗的ZJ/C株和SH株的效果評價(jià)也已選用Balb/c小鼠作為替代動(dòng)物,其中SH株采用ELISA測抗體法,ZJ/C株采用分離病毒的方法。

    ELISA抗體檢測法由于方便、快捷省時(shí)、成本低廉被許多學(xué)者所采用。董信田等[12]通過ELISA方法檢測小鼠抗體,證實(shí)PCV2油佐劑和鋁膠佐劑滅活疫苗免疫小鼠后均能產(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答,并且油佐劑滅活疫苗免疫效果好于鋁膠佐劑滅活疫苗。王建龍等[13]用制備的PCV2 DNA疫苗免疫小鼠,發(fā)現(xiàn)免疫后第14天小鼠血清ELISA抗體水平達(dá)到峰值,加強(qiáng)免疫后抗體水平無顯著變化。而病毒分離方法結(jié)果判定更為直接,并且也最為準(zhǔn)確可靠。因此,本研究中也采用免疫攻毒后分離病毒的方法,通過間接免疫熒光法(IFA)檢測,熒光顯微鏡判定結(jié)果,不僅特異而且易于判定。通過致病性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可使小鼠10/10感染的最低病毒含量為106.5TCID50/0.1 mL。用該種毒攻擊PCV2滅活疫苗免疫后的小鼠,通過病毒分離發(fā)現(xiàn),當(dāng)疫苗抗原病毒含量為105.0TCID50/0.1 mL時(shí),可使小鼠5/10保護(hù),而當(dāng)疫苗抗原病毒含量為105.5TCID50/0.1 mL時(shí),即可使小鼠7/10保護(hù),達(dá)到疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求,說明所制備的疫苗具有較好的免疫效果,為疫苗生產(chǎn)工藝的改進(jìn)提供了重要的數(shù)據(jù)參考。

    [1]郎洪武,陳曉春,吳華偉,等.豬圓環(huán)病毒病及其生物制品學(xué)的研究進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2012,42(5):545-550.

    [2]SEGALES J.Update on post weaning mul ti-systemic wasting syndrome and porcine dermatitis and nephropathy syndrome diagnostics[J]. J Swine Heal th Prod,2002,10(6)∶277-281.

    [3]GRAU-ROMA L,CRISCI E,SIBILA M,et al.A proposal on porcine circovirus type 2(PCV2)genotype def inition and their relation with postweaning mul tisystemic wasting syndrome occurrence[J].Vet Microbiol, 2008, 128(1/2)∶23-35.

    [4]郎洪武.豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的家蠶表達(dá)及亞單位疫苗在小鼠和仔豬的免疫效力試驗(yàn)[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,2013.

    [5] 李郁,魏建忠,蘇金存,等[P].中國專利:201010138882.X,2010-04-02.

    [6]鄧秋紅,鄭潔,劉延亭,等.國內(nèi)商品化豬圓環(huán)病毒疫苗的現(xiàn)狀及展望[J].中國獸藥雜志,2014,48(2):67-69.

    [7]農(nóng)業(yè)部公告第1893號.

    [8]Tischer I,Peters D,Rasch R,et al.Repl ication of porcine circovirus∶induction by glucosa mine and cel l dependence[J].Arch Virol, 1987,96∶39-57

    [9]崔尚金,金滟平,李曦,等.豬圓環(huán)病毒間接免疫熒光方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,29(1):63-66.

    [10]KIUPEL M,STEVENSON G W,CHOI J,et al.Viral repl ication and lesions in BALB/c mice experimental ly inoculated with porcine circovirus isolated f rom a pig with postweaning mul tisystemic wasting disease[J].Vet Pathol, 2001,38(1)∶74-82.

    [11]QUINTANA J,BALASCH M,SEGALES J M,et al. Experimental inoculation of porcine circoviruses type 1(PCV1)and type2(PCV2)in rabbits and mice[J].Vet Res,2002,33(3)∶229-237.

    [12]董信田,李玉峰,姜平,等.豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的制備與免疫效力研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,39(5):639-644.

    [13]王建龍,趙路易,張洪利,等.豬圓環(huán)病毒2型DNA疫苗對小鼠的買內(nèi)衣效果[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008,36(4):53-57.

    (編輯:張婷婷)

    Immuno-efficacy of inactivated PCV2 vaccine inm ice

    Zhu Guopo1,Li Shaol i1,Shao Panfeng1,Wang Binqing1,Li Xinhua1,2*
    (1.Hangzhou Jianl iang Veterinary Biological Preparations Co.Ltd.,Zhej iang Hangzhou 310018; 2.Poult ry Institute,Chinese Academy of Agricul tural Sciences,Zhejiang Yangzhou 225125)

    To evaluate the immune ef f icacy of porcine cirovirus type 2 vaccine,the viral isolation method was used to get the minimum content of PCV2 which can infect al l the Balb/c mice. Then,mice which had been immunized by inactivated vaccine were injected with this virus,and analyzed the protective ef fect.Resul ts showed that the minimum content of porcine circovirus type 2 can infect al l the Balb/c mice is 106.5TCID50/0.1 mL.The vaccine can protect the seven tenths of the mice with a viral content of 105.5TCID50/0.1 mL,and reach to the immune ef fect.The research could provide an impor tant reference data for improving the production process of existing vaccine.

    Porcine circovirus type 2;Viral isolation;Vaccine

    S858.28

    :B

    :1672-9692(2014)10-0033-04

    2014-08-05

    朱國坡(1980-),男,碩士,獸醫(yī)師,主要從事動(dòng)物疫苗研發(fā)方面工作。

    猜你喜歡
    圓環(huán)活疫苗熒光
    新冠病毒滅活疫苗誕生記
    加權(quán)全能量最小的圓環(huán)形變
    干式熒光發(fā)光法在HBV感染診療中應(yīng)用價(jià)值
    豬圓環(huán)病毒病的發(fā)生、診斷和防治
    一例鴨圓環(huán)病毒病的診斷
    圓環(huán)上的覆蓋曲面不等式及其應(yīng)用
    高熒光量子產(chǎn)率BODIPY衍生物的熒光性能研究
    鴨黃病毒滅活疫苗的制備與免疫效力研究
    滴鼻免疫布氏菌活疫苗保護(hù)效果的研究
    番鴨呼腸孤病毒活疫苗的推廣應(yīng)用
    亚洲av电影在线观看一区二区三区| 97在线视频观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 大话2 男鬼变身卡| 9191精品国产免费久久| 99热网站在线观看| freevideosex欧美| 国产极品天堂在线| 亚洲第一区二区三区不卡| a级片在线免费高清观看视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 热99久久久久精品小说推荐| 精品视频人人做人人爽| h视频一区二区三区| 美女视频免费永久观看网站| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲av免费高清在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 日本wwww免费看| 一区在线观看完整版| 免费高清在线观看视频在线观看| 色网站视频免费| 国产成人一区二区在线| 蜜桃在线观看..| 成年动漫av网址| 波多野结衣av一区二区av| 乱人伦中国视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 黄色毛片三级朝国网站| 日韩av免费高清视频| 十分钟在线观看高清视频www| 最新中文字幕久久久久| freevideosex欧美| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久久久久久久久人人人人人人| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲精品国产av成人精品| www.熟女人妻精品国产| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| av.在线天堂| 亚洲精品一二三| 欧美黄色片欧美黄色片| 青春草视频在线免费观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 深夜精品福利| 久久这里有精品视频免费| 午夜福利一区二区在线看| 欧美激情 高清一区二区三区| 不卡视频在线观看欧美| 国产xxxxx性猛交| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产精品久久久久久av不卡| 9191精品国产免费久久| 亚洲精品国产av成人精品| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲综合精品二区| 看免费av毛片| 青青草视频在线视频观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 高清不卡的av网站| 午夜福利影视在线免费观看| 热re99久久国产66热| 一区二区三区乱码不卡18| 春色校园在线视频观看| 99久国产av精品国产电影| 美女国产高潮福利片在线看| 国产精品久久久久久精品古装| 国产 精品1| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 日韩欧美一区视频在线观看| 午夜福利乱码中文字幕| 欧美老熟妇乱子伦牲交| videos熟女内射| 久久久久久久大尺度免费视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 91成人精品电影| 午夜福利乱码中文字幕| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产一区二区激情短视频 | 国产女主播在线喷水免费视频网站| 香蕉国产在线看| 性少妇av在线| 久久午夜综合久久蜜桃| 黄色怎么调成土黄色| 美女福利国产在线| 9热在线视频观看99| 狂野欧美激情性bbbbbb| 香蕉精品网在线| 精品亚洲成a人片在线观看| 久热这里只有精品99| 国产成人精品在线电影| 亚洲第一区二区三区不卡| 男女下面插进去视频免费观看| 只有这里有精品99| 国产精品国产三级专区第一集| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 建设人人有责人人尽责人人享有的| 高清在线视频一区二区三区| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 亚洲综合色惰| 国产男人的电影天堂91| 精品少妇久久久久久888优播| 9191精品国产免费久久| 我要看黄色一级片免费的| 少妇 在线观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲精品国产av成人精品| 妹子高潮喷水视频| 亚洲三级黄色毛片| 精品酒店卫生间| 国产熟女欧美一区二区| 午夜福利网站1000一区二区三区| 黄片无遮挡物在线观看| av网站在线播放免费| 色视频在线一区二区三区| 欧美人与性动交α欧美软件| 久久精品夜色国产| 亚洲av综合色区一区| 亚洲第一av免费看| 国产伦理片在线播放av一区| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲一区二区三区欧美精品| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 中文字幕av电影在线播放| 五月天丁香电影| 欧美 日韩 精品 国产| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产免费现黄频在线看| 国产精品国产三级专区第一集| 少妇人妻 视频| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲成人手机| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 国产午夜精品一二区理论片| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 在线天堂最新版资源| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲综合精品二区| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产精品蜜桃在线观看| 国产成人精品一,二区| 亚洲久久久国产精品| 国产成人精品久久久久久| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲伊人久久精品综合| 精品久久蜜臀av无| 成人影院久久| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 国产亚洲一区二区精品| av在线app专区| a级片在线免费高清观看视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产极品天堂在线| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲精品国产一区二区精华液| 大片免费播放器 马上看| 国产精品99久久99久久久不卡 | 少妇 在线观看| 一级爰片在线观看| 国产在线视频一区二区| 日韩人妻精品一区2区三区| 精品一区二区免费观看| 国产精品女同一区二区软件| 丝袜美足系列| a 毛片基地| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲,欧美精品.| 免费观看在线日韩| 中文字幕人妻熟女乱码| 丰满乱子伦码专区| 亚洲欧美一区二区三区久久| 人妻系列 视频| 十八禁高潮呻吟视频| 久久久a久久爽久久v久久| 99re6热这里在线精品视频| 波野结衣二区三区在线| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲国产精品一区三区| 久久韩国三级中文字幕| 丰满饥渴人妻一区二区三| tube8黄色片| 黄片小视频在线播放| 久久狼人影院| 波野结衣二区三区在线| 伦精品一区二区三区| 黄频高清免费视频| 69精品国产乱码久久久| 中文字幕最新亚洲高清| 美女国产高潮福利片在线看| videos熟女内射| 欧美+日韩+精品| 男的添女的下面高潮视频| 美女国产视频在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 一级黄片播放器| 欧美97在线视频| 亚洲精品美女久久av网站| 美女大奶头黄色视频| 日韩大片免费观看网站| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 深夜精品福利| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲av男天堂| 一二三四中文在线观看免费高清| 婷婷色av中文字幕| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 免费高清在线观看日韩| 美女主播在线视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲精品乱久久久久久| 嫩草影院入口| 婷婷成人精品国产| 18禁国产床啪视频网站| a级毛片在线看网站| 欧美精品国产亚洲| 又黄又粗又硬又大视频| 老汉色∧v一级毛片| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲国产av影院在线观看| 综合色丁香网| 韩国av在线不卡| 考比视频在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 日韩精品有码人妻一区| 国产人伦9x9x在线观看 | 女性生殖器流出的白浆| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲精品国产色婷婷电影| av女优亚洲男人天堂| 免费少妇av软件| 高清黄色对白视频在线免费看| 最近最新中文字幕免费大全7| 91在线精品国自产拍蜜月| 丰满饥渴人妻一区二区三| 欧美变态另类bdsm刘玥| 成年美女黄网站色视频大全免费| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 成人漫画全彩无遮挡| 久久久久国产精品人妻一区二区| 美女午夜性视频免费| 欧美日韩综合久久久久久| 日本色播在线视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 人妻人人澡人人爽人人| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产探花极品一区二区| 午夜福利网站1000一区二区三区| 26uuu在线亚洲综合色| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲一区中文字幕在线| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产免费现黄频在线看| 亚洲天堂av无毛| 亚洲,一卡二卡三卡| 婷婷成人精品国产| 黄片小视频在线播放| 亚洲精品视频女| 青青草视频在线视频观看| 美女国产高潮福利片在线看| 一个人免费看片子| 叶爱在线成人免费视频播放| 日韩精品有码人妻一区| 人人澡人人妻人| 国产成人aa在线观看| 久久狼人影院| 老鸭窝网址在线观看| 国产男人的电影天堂91| 在线 av 中文字幕| 涩涩av久久男人的天堂| 美女高潮到喷水免费观看| 美女主播在线视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 在线 av 中文字幕| 男女无遮挡免费网站观看| 中文天堂在线官网| 国产精品免费大片| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产精品久久久久成人av| 男女午夜视频在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 美女国产视频在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| 丝袜喷水一区| 制服丝袜香蕉在线| 午夜激情久久久久久久| 国产片特级美女逼逼视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产免费福利视频在线观看| 一区二区av电影网| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 如何舔出高潮| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产极品粉嫩免费观看在线| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲综合精品二区| 久久久国产欧美日韩av| 国产精品国产av在线观看| 久久久亚洲精品成人影院| 国产片内射在线| 国产精品久久久久久精品古装| 午夜福利在线免费观看网站| 超色免费av| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产成人精品福利久久| 1024香蕉在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 久久久国产精品麻豆| 一区二区av电影网| 人妻人人澡人人爽人人| 精品视频人人做人人爽| 1024视频免费在线观看| 青青草视频在线视频观看| 香蕉精品网在线| 成人亚洲精品一区在线观看| 视频区图区小说| av卡一久久| 精品亚洲成国产av| 亚洲一码二码三码区别大吗| av网站在线播放免费| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久鲁丝午夜福利片| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲欧美清纯卡通| 日韩精品免费视频一区二区三区| freevideosex欧美| 高清不卡的av网站| 日本91视频免费播放| 国产成人精品久久久久久| 欧美少妇被猛烈插入视频| 在线观看www视频免费| 性高湖久久久久久久久免费观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 欧美日韩精品网址| 亚洲第一青青草原| 日韩中字成人| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲成人一二三区av| 久久女婷五月综合色啪小说| 日日撸夜夜添| a 毛片基地| 国产欧美亚洲国产| 日本wwww免费看| 2021少妇久久久久久久久久久| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产黄频视频在线观看| 国精品久久久久久国模美| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 电影成人av| 看免费av毛片| 午夜福利视频在线观看免费| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 人人澡人人妻人| 老女人水多毛片| 香蕉国产在线看| 午夜福利影视在线免费观看| h视频一区二区三区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 成年女人在线观看亚洲视频| 欧美精品一区二区免费开放| 午夜福利影视在线免费观看| 一区福利在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 午夜老司机福利剧场| 欧美变态另类bdsm刘玥| 成人手机av| 日韩免费高清中文字幕av| 成人午夜精彩视频在线观看| 99热国产这里只有精品6| 美女国产高潮福利片在线看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 久久久久久伊人网av| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产精品.久久久| 国产男女内射视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产人伦9x9x在线观看 | 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 中文字幕av电影在线播放| 美女中出高潮动态图| 69精品国产乱码久久久| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲人成网站在线观看播放| 人人妻人人澡人人看| 国产成人aa在线观看| 国产av精品麻豆| 亚洲情色 制服丝袜| 欧美av亚洲av综合av国产av | 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产1区2区3区精品| 国产免费又黄又爽又色| 国产 一区精品| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲四区av| av网站在线播放免费| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲久久久国产精品| 青春草国产在线视频| 一级爰片在线观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 高清黄色对白视频在线免费看| 成人国产av品久久久| 制服诱惑二区| 日韩av免费高清视频| 精品第一国产精品| 日韩一区二区三区影片| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 日本欧美国产在线视频| 久久久久久久久久久久大奶| 日韩 亚洲 欧美在线| 免费观看av网站的网址| 一区二区三区四区激情视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产精品免费大片| 欧美在线黄色| 国产精品免费大片| 国产不卡av网站在线观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 热re99久久精品国产66热6| 人成视频在线观看免费观看| 老司机亚洲免费影院| 女人久久www免费人成看片| 亚洲精品aⅴ在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 日日啪夜夜爽| 国产免费现黄频在线看| 少妇人妻 视频| av国产久精品久网站免费入址| av线在线观看网站| 国产av码专区亚洲av| av又黄又爽大尺度在线免费看| 99久国产av精品国产电影| 久久狼人影院| 亚洲美女黄色视频免费看| 99久久综合免费| 久久精品国产亚洲av天美| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产男人的电影天堂91| 又黄又粗又硬又大视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲av免费高清在线观看| 伊人亚洲综合成人网| 人妻系列 视频| 制服诱惑二区| 国产在线一区二区三区精| 爱豆传媒免费全集在线观看| 午夜福利乱码中文字幕| 人人澡人人妻人| 国产成人精品福利久久| 人妻人人澡人人爽人人| 精品人妻偷拍中文字幕| 另类精品久久| 日本wwww免费看| 一个人免费看片子| 国产视频首页在线观看| 久久久久国产网址| 国产成人a∨麻豆精品| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产精品无大码| 自线自在国产av| 99久久中文字幕三级久久日本| 美女中出高潮动态图| 国产精品一区二区在线不卡| 国产成人精品福利久久| 99久国产av精品国产电影| 视频在线观看一区二区三区| 久久久久久久大尺度免费视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲中文av在线| 99久久精品国产国产毛片| 精品人妻偷拍中文字幕| 欧美日韩亚洲高清精品| 日日撸夜夜添| 日韩欧美一区视频在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲精品视频女| 三上悠亚av全集在线观看| 少妇的丰满在线观看| 午夜福利乱码中文字幕| 亚洲色图综合在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 九色亚洲精品在线播放| 日本午夜av视频| 新久久久久国产一级毛片| www.精华液| 亚洲久久久国产精品| 亚洲国产最新在线播放| 1024视频免费在线观看| 国产爽快片一区二区三区| 精品久久蜜臀av无| 黄片小视频在线播放| 久久国产亚洲av麻豆专区| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 麻豆乱淫一区二区| 最新中文字幕久久久久| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 人成视频在线观看免费观看| 美女视频免费永久观看网站| 国产成人精品在线电影| 欧美97在线视频| 一区在线观看完整版| 国产精品熟女久久久久浪| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 日韩制服骚丝袜av| 欧美精品亚洲一区二区| 看十八女毛片水多多多| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲三级黄色毛片| 26uuu在线亚洲综合色| 九色亚洲精品在线播放| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 两个人免费观看高清视频| 亚洲综合色惰| 欧美日韩亚洲高清精品| 最新的欧美精品一区二区| 热99国产精品久久久久久7| 老司机影院毛片| 国精品久久久久久国模美| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日韩三级伦理在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 男女免费视频国产| 在线观看www视频免费| av免费在线看不卡| 久久亚洲国产成人精品v| 咕卡用的链子| 1024视频免费在线观看| 黄色 视频免费看| 久久免费观看电影| 啦啦啦视频在线资源免费观看| h视频一区二区三区| 中文字幕色久视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 日本欧美国产在线视频| 午夜福利,免费看| www.精华液| 精品人妻一区二区三区麻豆| 免费高清在线观看日韩| 午夜激情久久久久久久| 飞空精品影院首页| 国产黄色免费在线视频| 一区二区三区乱码不卡18| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 永久免费av网站大全| 亚洲精品av麻豆狂野| 蜜桃在线观看..| 在线观看三级黄色| 久久久a久久爽久久v久久| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久国内精品自在自线图片| 看十八女毛片水多多多| 校园人妻丝袜中文字幕| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 久久国产亚洲av麻豆专区| 99国产精品免费福利视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 婷婷色麻豆天堂久久| 久久精品国产亚洲av天美| 国产精品一区二区在线不卡| 免费观看av网站的网址| 少妇 在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久久欧美国产精品| 一本久久精品| 欧美精品一区二区免费开放| 青春草视频在线免费观看| 国产成人免费无遮挡视频| 美女大奶头黄色视频| 久久久久久人妻| 国产片内射在线| 99国产精品免费福利视频| 久久久久精品性色| 国产一区二区在线观看av| 亚洲第一青青草原| 免费观看无遮挡的男女| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 乱人伦中国视频| 国产精品一区二区在线不卡| 日本-黄色视频高清免费观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 色哟哟·www| 欧美最新免费一区二区三区| 国产乱来视频区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 看免费成人av毛片| 水蜜桃什么品种好| 色吧在线观看|