AM真菌和PGPR菌劑組合對低溫脅迫下黃瓜生長及防御酶活性的影響

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（1青島農(nóng)業(yè)大學(xué)菌根生物技術(shù)研究所，山東青島 266109；2青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山東青島 266109）

AM真菌和PGPR菌劑組合對低溫脅迫下黃瓜生長及防御酶活性的影響

韓亞楠1，2劉潤進(jìn)1李 敏1，2*

（1青島農(nóng)業(yè)大學(xué)菌根生物技術(shù)研究所，山東青島 266109；2青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山東青島 266109）

為了篩選適于黃瓜耐低溫的最佳叢枝菌根（AM）真菌和PGPR組合菌劑，研究了不同AM真菌、PGPR組合菌劑對低溫脅迫下黃瓜生長及防御酶活性的影響。結(jié)果表明低溫脅迫下，單接種AM真菌或是單接種PGPR的處理，其黃瓜生長量及SOD、POD和CAT活性均高于不接種對照，而MDA含量則顯著低于不接種對照。AM真菌接種處理中以接種地表球囊霉（Glomus versiforme）處理的黃瓜生長量較大、防御酶活性較高、細(xì)胞膜受傷害較小；PGPR接種處理中以接種多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）的處理黃瓜生長量較大、防御酶活性較高、細(xì)胞膜傷害較小。AM真菌和PGPR雙接種處理中，以地表球囊霉+多粘類芽孢桿菌處理生長量最大、防御酶活性最高、細(xì)胞膜傷害最輕?？梢钥紤]在今后溫室黃瓜種植中添加該組合菌劑促進(jìn)黃瓜生長，提高植株耐冷性。

低溫脅迫；AM真菌；PGPR；黃瓜；防御酶；丙二醛

黃瓜（Cucumis sativus L.）是典型喜溫蔬菜作物，不耐低溫，通常在10～13℃生理活動失調(diào)，停止生長發(fā)育，低于1℃則發(fā)生凍害（章鎮(zhèn)，2004）。北方地區(qū)冬春季經(jīng)常會出現(xiàn)極度寒冷天氣和連陰天現(xiàn)象是影響設(shè)施黃瓜生產(chǎn)的主要逆境，黃瓜的冷敏性已成為其正常生長的主要限制因子。近年來，黃瓜低溫冷害問題受到了廣泛關(guān)注，制定克服低溫與弱光等不良條件影響的技術(shù)措施已成為研究熱點(diǎn)。

叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）真菌是一類植物活體營養(yǎng)專性共生菌，接種AM真菌能夠促進(jìn)植物萌發(fā)、生根和生長，提高植物抗病性（李敏 等，2003；Diedhiou et al.，2003）和抗逆性（Vivas et al.，2003；楊瑞紅 等，2005），促進(jìn)作物生長，改善品質(zhì)（王曙光 等，2002）。

植物根圍促生細(xì)菌（plant growth-promotingrhizobacteria，PGPR）是指自由生活在土壤或附生于植物根圍的一類具有固氮、解磷、產(chǎn)生植物激素或分泌抗生素、促進(jìn)植物生長的有益細(xì)菌（Shafiq et al.，1999）。已從根圍細(xì)菌中鑒定出一些PGPR，主要包括假單胞菌屬（Pseudomonas）和芽孢桿菌屬（Bacillus）；其中熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）在很多植物的根圍和根面都占有絕對優(yōu)勢，其數(shù)量可占細(xì)菌總量的60%～93%。此外，醋桿菌屬（Acetobacter）、堿菌屬（Alcaligenes），節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、固氮菌屬（Azotobacter）等中的部分細(xì)菌也是比較常見的PGPR（Weller，1998）。PGPR對植物不僅沒有致病性，而且對植物具有防病作用和促生作用，作為生防菌廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。

關(guān)于接種AM真菌或接種PGPR促進(jìn)植物生長的研究已有不少，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)AM真菌和PGPR雙接種比單接種有更大的效益（龍偉文 等，2000），焦慧等（2010）發(fā)現(xiàn)番茄播種時(shí)接種AM真菌摩西球囊霉（Glomus mosseae）+移栽時(shí)接種芽孢桿菌（Bacillus sp.） 能夠顯著增加番茄植株節(jié)點(diǎn)數(shù)、株高、莖粗、地上部鮮質(zhì)量及地下部鮮質(zhì)量。由于AM真菌和PGPR種類繁多，AM真菌和PGPR之間相互影響的機(jī)制尚不清楚，因此關(guān)于AM真菌和PGPR菌劑組合研究甚少，本試驗(yàn)研究了低溫脅迫下接種AM真菌和PGPR對黃瓜生長及防御酶活性的影響，以期篩選出能夠使黃瓜耐低溫的優(yōu)良菌劑組合。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試黃瓜品種為津優(yōu)35號，將黃瓜種子用75%酒精消毒后浸種12 h，放在墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽，出芽后播種。

供試AM真菌菌劑有地表球囊霉（Glomus versiforme，Gv）、摩西球囊霉（G. mosseae，Gm）兩種，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)菌根生物技術(shù)研究所提供。菌種是經(jīng)三葉草在滅菌沙土中擴(kuò)繁4～5個月，以菌根化根段、土壤中的菌絲體和根圍土壤組成的接種混合物。

供試PGPR有蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus，BC）、多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa，PP）兩種。把菌株轉(zhuǎn)移到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基上，28℃下振蕩培養(yǎng)30 h。PGPR懸浮液均稀釋到濃度為3×108cfu·mL-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2013年8月6日至11月3日在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)日光溫室和人工氣候箱進(jìn)行。試驗(yàn)用基質(zhì)為土∶沙∶蛭石∶草炭=2 V∶1 V∶1 V∶1 V，基質(zhì)用高壓滅菌鍋121℃滅菌1 h，滅菌后裝入用酒精消毒的16 cm×22 cm花盆中。經(jīng)預(yù)備試驗(yàn)后，根據(jù)黃瓜植株生長狀況篩選出優(yōu)勢菌種為Gm、Gv、PP、BC、Gv+BC、Gv+PP、Gm+PP。試驗(yàn)設(shè)不接種對照（CK）和7個菌劑處理，分別為Gm、Gv、BC、PP、Gv+BC、Gv+PP、Gm+PP，隨機(jī)排列，每個處理3次重復(fù)。種子發(fā)芽后播種，播種前將5 000接種勢單位（IPU）AM真菌接種物加入花盆（Liu ＆Luo，1994），對照則加入等量的滅菌混合接種物和接種物濾液，每盆播2 粒。保持晝溫 27～30℃、夜溫 16～18℃，出苗后每盆留1株苗，待幼苗子葉出土后每2 d澆1次水，黃瓜生長至三葉一心時(shí)灌根接種PGPR懸浮液，每株接10 mL。接種PGPR 20 d后將所有處理移至人工氣候箱（光暗各12 h，光照強(qiáng)度為 150 μmol·m-2·s-1）內(nèi)進(jìn)行15℃/10℃（晝/夜）低溫處理，低溫處理6 d后取樣。黃瓜生長期間適當(dāng)補(bǔ)充Hoagland營養(yǎng)液，其他常規(guī)管理。

1.3 測定指標(biāo)

取樣后采用常規(guī)方法測定地上部、地下部鮮質(zhì)量、植株高度、莖粗、根長。

采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定丙二醛（MDA）的含量，采用氮藍(lán)四唑法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性，采用紫外吸收法測定過氧化氫酶（CAT）活性（劉萍和李明軍，2008）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2003軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用DPS7.05軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行LSD顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AM真菌與PGPR菌劑組合對低溫脅迫下黃瓜生長量的影響

由表1可以看出，低溫處理后，單接種AM真菌的各項(xiàng)指標(biāo)都顯著高于不接種的對照，其中接種Gv處理的各項(xiàng)指標(biāo)較好，地上部鮮質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、株高、莖粗和根長分別比對照增加299.3%、773.0%、526.2%、100.0%和122.9%，并顯著高于接種Gm的處理；在單接種PGPR的處理中，接種PP處理的各項(xiàng)指標(biāo)除地上部鮮質(zhì)量外均顯著高于對照，地上部鮮質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、株高、莖粗、根長分別比對照增加67.4%、143.2%、113.9%、25.7%和47.6%，接種BC處理的各項(xiàng)指標(biāo)除根長外與對照差異不顯著；單獨(dú)接種AM真菌處理的各項(xiàng)指標(biāo)要優(yōu)于單獨(dú)接種PGPR的處理；AM真菌與PGPR菌劑組合處理中，Gv+PP處理的各項(xiàng)生長指標(biāo)最高，地上部鮮質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、株高、莖粗、根長分別比對照增加390.7%、881.1%、660.0%、119.0%、176.5%。

表1 不同菌劑組合對低溫脅迫下黃瓜生長量的影響

2.2 AM真菌與PGPR菌劑組合對低溫脅迫下黃瓜防御酶活性的影響

2.2.1 AM真菌與PGPR菌劑組合對低溫脅迫下黃瓜葉片SOD、POD、CAT活性的影響 由圖1可知，低溫處理后，各接種處理植株葉片的SOD、POD活性都顯著高于不接種的對照，除了BC接種處理外，其他接種處理植株葉片CAT活性也都顯著高于不接種的對照；在單接種AM真菌的處理中，接種Gv處理的SOD、POD、CAT活性較高；在單接種PGPR的處理中，接種PP處理的SOD、POD、CAT活性較高；單獨(dú)接種AM真菌的處理的SOD、POD、CAT活性（Gm處理的POD活性除外）要高于單獨(dú)接種PGPR的處理，同時(shí)接種AM真菌和PGPR的處理比單接種AM真菌或PGPR處理的SOD、CAT活性高，其中接種組合菌劑Gv+PP的葉片SOD、POD、CAT活性最高。

圖1 不同菌劑組合對低溫脅迫下黃瓜葉片SOD、POD、CAT活性的影響

2.2.2 AM真菌與PGPR菌劑組合對低溫脅迫下黃瓜葉片MDA含量的影響 由圖2可知，低溫處理后，各接種處理植株葉片的MDA含量都顯著低于不接種的對照；單接種AM真菌的處理中，接種Gv處理的MDA含量較低；單接種PGPR的處理中，接種PP處理的MDA含量較低； Gv+PP處理的葉片MDA含量最低，顯著低于單接種AM真菌或PGPR處理。

圖2 不同菌劑組合對低溫脅迫下黃瓜葉片MDA含量的影響

3 結(jié)論與討論

一些研究已經(jīng)證實(shí)了AM真菌與PGPR雙接種能夠促進(jìn)植物生長，例如，AM真菌G. fasculatum與固氮螺菌Azospirillum brasilense雙接種對紫花苜蓿生長及氮的吸收都具有促進(jìn)作用（Biró et a1.，2000）；對玉米接種摩西球囊霉和重氮營養(yǎng)醋桿菌Pal5可極顯著地提高菌根侵染率，促進(jìn)玉米生長，增加產(chǎn)量（宣梅 等，2004）。相似研究已有不少，但在低溫脅迫下，AM真菌與PGPR組合對黃瓜生長及防御酶活性有何影響少有人研究，而哪種菌劑組合能夠使在低溫脅迫下處理的黃瓜植株達(dá)到最佳生長狀況更是研究甚少。本試驗(yàn)中，不同菌劑處理的黃瓜植株的生長量差異較大，其中，接種Gv+PP的植株各項(xiàng)生長指標(biāo)最高。可以看出，AM真菌和PGPR都顯著地發(fā)揮了其促生作用，但是不同組合促生效果不同，這可能是與AM真菌和PGPR之間相互促進(jìn)、相互抑制或互不影響有關(guān)（Biró et al.，2000；Mamatha et al.，2002；Duponnois &Plenchette，2003）。

單獨(dú)接種兩種PGPR均促進(jìn)了黃瓜生長，原因是多方面的。多粘類芽孢桿菌能產(chǎn)生肽類、蛋白質(zhì)類、核苷類、酚類等多種抗菌物質(zhì)，能防治多種植物病害（李蜀 等，2007），并能通過固氮和溶磷作用為宿主植物提供營養(yǎng)成分（陳志誼，2001），還能產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，如酶、植物激素及絮凝劑等（Richardson et al.，2009）。蔡學(xué)清等（2005）研究表明，枯草芽孢桿菌BS-2 對辣椒苗有明顯的促生作用，同時(shí)，該菌株還可誘導(dǎo)辣椒體內(nèi)吲哚乙酸等促進(jìn)植物生長的激素含量提高，并降低脫落酸等抑制植物生長激素的形成。Tang（1996） 利用高壓液相色譜分析了7株蠟狀芽孢桿菌增產(chǎn)菌的發(fā)酵液中的植物生長激素類物質(zhì)，分析表明玉米素、赤霉素和吲哚乙酸普遍存在于所有菌株中，吲哚乙酸含量穩(wěn)定且較高，證明增產(chǎn)菌促進(jìn)植物生長發(fā)育的主要原因之一是其產(chǎn)生的植物激素。

試驗(yàn)中單獨(dú)接種兩種AM真菌均不同程度地促進(jìn)了黃瓜植株生長，其促進(jìn)效果高于接種PGPR的。AM真菌能促進(jìn)生長在于能夠擴(kuò)大植物根系的吸收面積、增加植物對磷及其他多種礦質(zhì)元素的吸收和利用、改善植株?duì)I養(yǎng)狀況（Manjula et al.，2005；劉潔 等，2011；李少朋 等，2013）、改變植物內(nèi)源激素的平衡狀況（劉潤進(jìn) 等，2000）、促進(jìn)光合作用，提高葉綠素含量（杜照奎和何躍軍，2011）。本試驗(yàn)結(jié)果表明AM真菌促生效果高于PGPR，前人的研究也得到過類似結(jié)論，秦芳玲等（2000）在土培及沙培條件下接種巨大芽孢桿菌及AM真菌，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)接種巨大芽孢桿菌對紅三葉草生長及磷營養(yǎng)狀況影響不大，而單獨(dú)接種摩西球囊霉則顯著促進(jìn)紅三葉草生長和對磷的吸收，而雙接種兩者則表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用。

本試驗(yàn)中，低溫脅迫下單接種AM真菌、單接種PGPR和雙接種的處理SOD、POD和CAT活性均高于不接種的對照，說明接種處理提高了植株酶活性，增強(qiáng)了對活性氧的清除能力，從而增強(qiáng)了植株抵抗低溫逆境的能力。本試驗(yàn)中，低溫脅迫下各接種處理MDA含量均低于不接種的對照，表明接種后植物對低溫逆境的抗性增強(qiáng)，減小了膜傷害，其中雙接種處理Gv+PP植株MDA含量最低，顯著低于其他處理，其膜傷害最輕。

在本試驗(yàn)中，綜合植物生長量和防御酶活性，認(rèn)為兩種PGPR中多粘類芽孢桿菌促生效果較好、使得黃瓜對低溫脅迫抗性較強(qiáng)；兩種AM真菌中地表球囊霉促生效果較好、使得黃瓜對低溫脅迫抗性較強(qiáng)；在組合菌劑中，最佳組合是地表球囊霉+多粘類芽孢桿菌，其黃瓜生長量及防御酶活性都最高。總之，接種AM真菌和/或PGPR能削弱冷脅迫對SOD、CAT和POD活性的抑制和膜的傷害，從而提高黃瓜苗的耐冷性。可以考慮在今后黃瓜種植中添加組合菌劑促進(jìn)黃瓜生長，提高耐冷性。

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Effects of Arbuscular Mycorrhizal Fungi and PGPR Combination Agents on Growth and Defense Enzyme Activity of Cucumber under Low Temperature Stress

HAN Ya-nan1，2，LIU Run-jing1，LI Min1，2*

（1Mycorrhizal Biotechnology Institue of Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，Shandong，China；2Horticulture College of Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，Shandong，China）

In order to select the best combination of arbuscular mycorrhizal（AM） fungi and plant growthpromoting rhizobacteria（PGPR） for cucumber （Cucumis sativus）to resist low-temperature damages，we studied the effects of different combinations on growth and defense enzymes in greenhouse under low temperature stress conditions. The results showed that the growth of cucumber and SOD，POD，CAT activities were higher than that of the non-vaccinated control，while MDA content was significantly lower than that of the controls，when inoculation with AM fungi or PGPR under low temperature treatments. Between the AM fungi inoculation treatments，Glomus versiforme had better positive effect on growth，defensive enzyme activities，and decreased the cell membrane damage. Between the PGPR inoculation treatments，Paenibacillus polymyxa had better growth and higher defensive enzyme activities，with less cell membrane damage. Among the inoculation treatments with AM fungi and PGPR ，inoculation treatment with both Glomus versiforme and Paenibacillas polymyxa had the best growth，highest defensive enzyme activities，minimum cell membrane damage. Hence，we would suggest to add this combination in greenhouse cucumber production to promote cucumber growth and improve plant cold resistance.

Low temperature stress；AM fungi；PGPR；Cucumber；Defense enzymes；MDA

韓亞楠，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜栽培生理，E-mail：hanyananhaoren@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：李敏，博士，教授，專業(yè)方向：蔬菜栽培生理，E-mail：ml0519@163.com

2014-04-26；接受日期：2014-05-20

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2014BAD05B03），山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2013GNC11014），青島市基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（13-1-4-143-jch）