新化合物結(jié)構(gòu)蛻皮甾酮衍生物TAPA降糖作用與機制的初步研究

王曉琳，李宏偉，張 競，譚正懷（.重慶植恩藥業(yè)有限公司，重慶 400039；.四川省中醫(yī)藥科學院，成都

610042）

蛻皮甾酮是一類天然產(chǎn)物的統(tǒng)稱，最初在昆蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，是一種具有蛻皮活性的物質(zhì)，有促進細胞生長的作用。研究表明，蛻皮甾酮有多種藥理學作用，如調(diào)節(jié)合成代謝、胃保護、抗氧化、抑制代謝綜合征、保護心血管等[1]。相關(guān)研究表明，蛻皮甾酮具有胰島素增敏活性，可通過肝細胞發(fā)揮非胰島素依賴的降糖作用，但不能刺激胰島素分泌[2]；在胰島素抵抗細胞模型中能提高胰島素介導的葡萄糖攝取和利用能力，即增加胰島素的敏感性，并能明顯改善糖代謝[3]。后續(xù)研究還證實，蛻皮甾酮胰島素增敏作用靶點涉及多種與胰島素抵抗相關(guān)的蛋白和激酶[4]。

蛻皮甾酮雖然降糖效果明顯，但其水溶性差，常溫時幾乎不溶于水，體內(nèi)半衰期很短（僅40 min）。如果做成緩釋片，其半衰期雖然能達到18 h，但其生物利用度僅為7.8%[5]，不利于成藥。因此，筆者以蛻皮甾酮為基礎(chǔ)進行結(jié)構(gòu)修飾，篩選得到了一個水溶性好、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的新化合物結(jié)構(gòu)蛻皮甾酮衍生物（五元環(huán)磷酸內(nèi)酯衍生物）TAPA。TAPA或其鈉鹽的水中溶解度較蛻皮甾酮分別提高了10倍和50倍，在2×10－7～2×10－9mol/L濃度范圍內(nèi)可使肝癌細胞HepG2的葡萄糖消耗量增加500%以上，活性較蛻皮甾酮提高30倍以上[6]，這為其進一步開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。本文就TAPA對2型糖尿病模型大鼠的體內(nèi)降糖作用進行研究，進一步評估其成藥性，同時通過HepG2細胞模型考察TAPA對胰島素敏感性和釋放的影響，初步評估其作用機制。TAPA的化學結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 TAPA的化學結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structure of TAPA

1 材料

1.1 儀器

7600型全自動生化分析儀（日本Hitachi公司）；JPS-3+型手持式快速全血葡萄糖測試儀（北京怡成生物電子技術(shù)有限公司）；全自動酶標讀數(shù)儀（美國Biorad公司）。

1.2 藥品與試劑

TAPA（白色粉末，重慶植恩藥業(yè)有限公司自制，批號：100305，純度：98.5%）；羅格列酮鈉片（太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司，批號：10070165，規(guī)格：每片4.0 mg）；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；檸檬酸（成都科龍化工試劑廠，批號：20041102）；檸檬酸鈉（重慶東方試劑廠，批號：200309）；甘油三酯（TG）試劑盒、總膽固醇（TC）試劑盒（北京北華康泰臨床試劑有限公司，批號：006304、0709061）；膽固醇（安徽天啟化工科技有限公司出品，批號：20110106）；豬膽酸鈉（北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司生產(chǎn)，批號：20081006）；基因工程人胰島素（美國Lilly公司）；3H-d-葡萄糖（中國原子能研究院提供）；格列齊特片（哈藥集團制藥總廠制劑廠，批號：20130115，規(guī)格：每片80 mg）。

1.3 動物

Wistar大鼠，SPF級，♀，體質(zhì)量180～200 g，由四川省中醫(yī)藥科學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（川）2008-19。

1.4 細胞

HepG2細胞和胰島β細胞瘤細胞系3（βTC3）細胞株均由重慶醫(yī)科大學動物中心細胞培養(yǎng)室惠贈。

2 方法

2.1 TAPA對2型糖尿病模型大鼠的降糖作用

2.1.1 2型糖尿病模型大鼠的建立。取大鼠100只，隨機分為正常對照組（n＝10）和高脂組（n＝90）。高脂組給予高脂飼料（含豬油15 g、膽固醇4 g、膽鹽1 g、蛋黃粉5 g、基礎(chǔ)飼料75 g）8周，正常對照組大鼠給予等量基礎(chǔ)飼料。在給予高脂飼料28 d并禁食不禁水16 h后，測定其TG和TC，取血脂高于正常對照組平均值20%的大鼠用于建立2型糖尿病模型。將合格高脂大鼠在禁食不禁水24 h后腹腔注射給藥STZ 25 mg/kg 1次，在注射后72 h測定其血糖濃度，隨機血糖大于11 mmol/L的大鼠即為建模成功。

2.1.2 分組與給藥。將建模成功的2型糖尿病模型大鼠隨機分為5組，即模型組、TAPA-1組（1 mg/kg）、TAPA-5組（5 mg/kg）、TAPA-25組（25 mg/kg）以及羅格列酮組（2 mg/kg），每組10只，后4組即為給藥組。給藥組每日灌胃相應(yīng)藥物1次，連續(xù)4周。正常對照組和模型組大鼠灌胃等體積的蒸餾水。

2.1.3 檢測指標。給藥期間每周測定各組大鼠攝食量、體質(zhì)量、飲水量以及隨機血糖水平各1次。末次給藥后1 h測定各組大鼠口服糖耐量，即禁食不禁水4 h后，灌胃葡萄糖2 g/kg，并分別于灌胃葡萄糖后0、0.5、1、2 h（前期研究表明2 h內(nèi)血糖濃度已達峰值）剪尾采血，測定血糖濃度，計算其血糖-時間曲線下面積（AUC）。

2.2 TAPA對胰島素敏感性的影響

2.2.1 HepG2細胞胰島素抵抗模型的建立。采用高濃度胰島素誘導培養(yǎng)法復制HepG2細胞的胰島素抵抗模型[7]。將HepG2細胞懸液用含體積分數(shù)為2%小牛血清DMEM洗滌1次，然后按1×106個/孔接種于24孔培養(yǎng)板中，細胞貼壁后用不含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液洗滌2次，加入1 ml新配制的含有或不含有5×10－7mol/L人胰島素的培養(yǎng)液（不加胰島素者為對照）于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育16 h，用不含胰島素的培養(yǎng)液洗滌1次，共20 min。在含5×10－7mol/L胰島素培養(yǎng)液中孵育的HepG2細胞稱為模型細胞，不含胰島素培養(yǎng)液中孵育的稱為對照細胞，測定兩種細胞的胰島素敏感性。

2.2.2 分組與給藥。試驗分為6組，即空白模型組、空白對照組、TAPA-M組（培養(yǎng)液含1×10－5mol/L TAPA的模型細胞組）、TAPA-C組（培養(yǎng)液含1×10－5mol/L TAPA的對照細胞組）和羅格列酮-M組（培養(yǎng)液含1×10－5mol/L羅格列酮的模型細胞組）、羅格列酮-C組（培養(yǎng)液含1×10－5mol/L羅格列酮的對照細胞組）。

2.2.3 檢測指標。采用3H-d-葡萄糖摻入實驗（檢測細胞的葡萄糖摻入率）評價細胞的胰島素敏感性[3]。在兩種胰島素濃度（分別為1×10－9mol/L和1×10－7mol/L）下，測定“2.2.2”項下各組細胞的葡萄糖摻入率。

具體操作步驟：取分別按“2.2.2”項下分組加入不含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液（1 ml/孔），于37 ℃、5%CO2條件下預(yù)孵育0.5 h，加入3H-d-葡萄糖（1.3 μCi/ml）孵育2 h，加入冰冷的磷酸鹽緩沖液快速洗滌細胞以終止反應(yīng)。細胞用20%KOH 0.5 ml溶解后，轉(zhuǎn)移至玻璃試管中，取出100 μl細胞溶解液，采用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度，冷乙醇溶液洗滌2次，室溫下3 000 r/min（離心半徑15 cm）離心5 min后棄去上清液，將沉淀物（糖原）倒置沉積在直徑為2 cm的濾紙片上（反復沖洗），濾紙片用冷藏于4 ℃的冷乙醇攪拌洗滌4次，共3 h。將濾紙片烘干后置于10 ml閃爍液中測定放射性計數(shù)。根據(jù)3H-d-葡萄糖的比放射性、細胞融解液的蛋白質(zhì)濃度及糖原的放射性，可計算出3H-d-葡萄糖的摻入率，單位為mmol·g（Pro）/h。公式為：葡萄糖的摻入率＝糖原的放射性計數(shù)（cpm）/[3H-d-葡萄糖的比放射性（Bq/mmol）×細胞融解液的蛋白質(zhì)濃度（g/L）×細胞融解液體積（ml）×溫育時間（h）]。

2.3 胰島素釋放試驗

2.3.1 分組與給藥。試驗分為給藥組和空白對照組，給藥組包括3個TAPA組與格列齊特組，即TAPA-Ⅰ組（1×10－10mol/L）、TAPA-Ⅱ組（1×10－8mol/L）、TAPA-Ⅲ組（1×10－6mol/L）、格列齊特組（1×10－5mol/L）。

2.3.2 檢測指標。將βTC3細胞接種于24孔板，生長3 d待細胞50%融合后，按“2.3.1”項下分組換上相應(yīng)的培養(yǎng)液，再孵育24 h，每孔取100 μl培液檢測胰島素含量。

2.4 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 降糖作用

3.1.1 建模結(jié)果。大鼠經(jīng)高脂喂食及STZ處理后，部分動物死亡，少數(shù)在處理結(jié)束后隨機血糖低于11 mmol/L，剩余53只大鼠隨機血糖高于11 mmol/L，為2型糖尿病大鼠造模成功，供試驗用。

3.1.2 各組大鼠攝食量、體質(zhì)量和飲水量的變化。高脂喂養(yǎng)大鼠在STZ誘導后，其攝食量、體質(zhì)量和飲水量與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。給藥組大鼠在給藥4周后，體質(zhì)量有所增加[給藥前（263.1±17.7）g，給藥28 d后（289.1±20.0）g]，但給藥組大鼠的攝食量、體質(zhì)量和飲水量與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3.1.3 各組大鼠血糖水平的變化。與正常對照組比較，模型組大鼠的血糖濃度明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，給藥組大鼠給藥4周后其血糖濃度均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。TAPA-25組大鼠在給藥后，血糖濃度與羅格列酮組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；且都在給藥1周后，血糖濃度就明顯下降，說明TAPA-25組降糖效果與羅格列酮組相當。TAPA-1組在給藥4周后血糖濃度明顯降低；TAPA-5組在給藥3周后血糖濃度明顯降低，并維持到給藥4周后；而TAPA-25組在給藥1周后血糖濃度就明顯降低，并維持到給藥4周后。4周后，TAPA各劑量組大鼠的血糖濃度間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。由此可見，TAPA的降糖效果與給藥劑量和時間呈正相關(guān)，劑量越高，其降糖作用越快速。各組大鼠的血糖濃度比較見表1。

表1 各組大鼠的血糖濃度比較（，n＝10）Tab 1 Comparison of blood glucose concentration of rats in each group（，n＝10）

表1 各組大鼠的血糖濃度比較（，n＝10）Tab 1 Comparison of blood glucose concentration of rats in each group（，n＝10）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05

3.1.4 各組大鼠糖耐量的變化。高脂大鼠在STZ誘導4周后，其糖耐量明顯降低，模型組與正常對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；給藥組大鼠的糖耐量均顯著改善（P＜0.05），給藥組間差異無統(tǒng)計學意義P＞0.05）。各組大鼠的糖耐量比較見表2。

表2 各組大鼠的糖耐量比較（，n＝10）Tab 2 Comparison of glucose tolerance of rats in each group（，n＝10）

表2 各組大鼠的糖耐量比較（，n＝10）Tab 2 Comparison of glucose tolerance of rats in each group（，n＝10）

與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

3.2 TAPA對胰島素敏感性的影響

胰島素抵抗HepG2空白模型細胞組的葡萄糖摻入率在不同濃度胰島素刺激下均低于空白對照細胞組（P＜0.01），說明模型細胞產(chǎn)生胰島素抵抗，建模成功；加入TAPA或羅格列酮的對照細胞組與未加入藥物的對照細胞組葡萄糖摻入率無顯著差異（P＞0.05），說明TAPA與羅格列酮均無刺激胰島素分泌作用，對正常對照細胞的葡萄糖摻入率無影響；而加入TAPA或羅格列酮的模型細胞組的葡萄糖摻入率較未加入藥物的模型細胞組顯著提高（P＜0.01），加入TAPA與加入羅格列酮的模型細胞組的葡萄糖摻入率無顯著差異（P＞0.05），說明TAPA與羅格列酮均有胰島素增敏作用，且二者作用強度相當。各組細胞的葡萄糖摻入率比較見表3。

3.3 TAPA對βTC3細胞胰島素釋放的影響

格列齊特為第二代磺脲類口服降糖藥，主要通過刺激胰島素分泌而發(fā)揮降糖作用。在葡萄糖濃度為11.1 mmol/L的條件下，與空白對照組比較，格列齊特有明顯的刺激βTC3細胞分泌胰島素的作用；1×10－10～1×10－6mol/L濃度范圍內(nèi)的TAPA對βTC3細胞的胰島素釋放無明顯影響，與空白對照組無明顯差異，說明TAPA無刺激胰島素分泌作用。各組細胞的胰島素釋放量比較見表4。

表3 各組細胞的葡萄糖摻入率比較（，mmol·（gPro）/h，n＝10）Tab 3 Comparison of incorporation amount of glucose in each group cell（，mmol·（gPro）/h，n＝10）

表3 各組細胞的葡萄糖摻入率比較（，mmol·（gPro）/h，n＝10）Tab 3 Comparison of incorporation amount of glucose in each group cell（，mmol·（gPro）/h，n＝10）

與對照細胞比較：＊P＜0.01；與模型細胞比較：#P＜0.01vs.control cell：＊P＜0.01；vs.model cell：#P＜0.01

表4 各組細胞的胰島素釋放量比較（，n＝10）Tab 4 Comparison of insulin secretion in each group cell（，n＝10）

表4 各組細胞的胰島素釋放量比較（，n＝10）Tab 4 Comparison of insulin secretion in each group cell（，n＝10）

與空白對照組比較：＊P＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.01

4 討論

胰島素抵抗是2型糖尿病的重要病因和顯著特征，因此也是近年來國際上針對代謝相關(guān)疾病的研究熱點。胰島素抵抗不但是2型糖尿病的重要病理基礎(chǔ)，同時還與相關(guān)的并發(fā)癥有密切關(guān)系，所以針對胰島素抵抗的治療成為治療糖尿病的關(guān)鍵，并可起到“一石多鳥”之效：既可降低糖尿病患者的高血糖、保護胰島β細胞免受損害、延緩2型糖尿病的進展，又可在改善大血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展、降低其病死率方面起到積極作用[8]。針對胰島素抵抗的治療藥物主要為胰島素增敏劑，噻唑烷二酮類藥是一類新型的并較為公認的胰島素增敏劑，但該類藥因安全性問題已大部分退市，目前臨床上亟需開發(fā)更加安全、有效的胰島素增敏劑。

筆者前期研究表明，蛻皮甾酮具有胰島素增敏作用，且與噻唑烷二酮類藥具有不同的作用機制。TAPA是在蛻皮甾酮的基礎(chǔ)上進行結(jié)構(gòu)修飾所得，因此首先考慮TAPA可能具有與蛻皮甾酮相同的作用效果與機制。為此，前期采用HepG2細胞檢測了TAPA對葡萄糖消耗量的影響。本研究進一步從體內(nèi)研究TAPA對2型糖尿病大鼠的血糖水平、糖耐量的影響，同時對TAPA的作用機制在細胞水平作了初步探討。以上實驗均以研究組前期對蛻皮甾酮的系列研究作為基礎(chǔ)，且《化合物經(jīng)口急性毒性分級標準》顯示TAPA屬于1～2級（無毒～實際無毒），以此確定的實驗方案、檢測指標以及給藥劑量[9-10]。

本研究結(jié)果表明，給藥4周，TAPA可降低2型糖尿病大鼠的血糖水平，其中TAPA-25組的降糖效果與2 mg/kg胰島素增敏劑羅格列酮組相當，同時TAPA各劑量組以及羅格列酮組均能改善2型糖尿病模型大鼠的糖耐量，各給藥組間結(jié)果相當。因此，初步體內(nèi)試驗證明，在蛻皮甾酮結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上修飾得到的TAPA能降低糖尿病關(guān)鍵指標——血糖濃度和升高糖耐量。其次，通過細胞水平的機制研究表明，TAPA可增加胰島素抵抗模型HepG2細胞的葡萄糖消耗量[6]以及提高HepG2細胞的葡萄糖摻入率，并且在相同的藥物濃度1×10－5mol/L條件下，效果與胰島素增敏劑羅格列酮相當。同時，通過對βTC3細胞的胰島素釋放試驗證明，在葡萄糖濃度為11.1 mmol/L的條件下，1×10－10～1×10－6mol/L濃度范圍內(nèi)的TAPA對βTC3細胞的胰島素釋放沒有明顯的影響，說明TAPA不具有刺激胰島素分泌的作用。

綜上，在蛻皮甾酮結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上修飾得到的TAPA可顯著降低2型糖尿病模型大鼠的血糖濃度，升高糖耐量；經(jīng)細胞水平研究證實，TAPA可提高胰島素抵抗細胞模型HepG2細胞的葡萄糖消耗量及摻入率，但無促進胰島素分泌作用。提示TAPA的降糖作用可能與原型蛻皮甾酮一致，與羅格列酮同屬胰島素增敏劑，通過改善胰島素的敏感性達到體內(nèi)降糖作用。后期亟需開展多模型動物實驗，以進一步驗證其體內(nèi)的藥效和安全性，并對其作用機制進行深入研究，以期將TAPA開發(fā)成具有全新作用機制、更加安全有效的胰島素增敏劑。

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