正交試驗優(yōu)選十一方藥酒的超聲提取工藝Δ

陳曉明，莫小林，韋振源，龔敏陽，陳 朝（廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，南寧 530023）

十一方藥酒（批準文號：桂藥制字Z01060025）為我院制劑室的自制品種，由三七、重樓、大黃、紅花、煅自然銅、乳香、秦艽、沒藥、續(xù)斷、制馬錢子等中藥組成，臨床用于治療跌打扭傷，各種骨折、骨傷、風濕骨痛等癥，療效顯著。目前，較常用的酒劑制備方法為浸漬法、滲漉法、回流提取法或其他適宜方法[1]。近年來，越來越多的學者利用超聲波技術提取中藥制劑[2-5]，該法具有處理時間短、提取效率高、操作簡便等優(yōu)點[6]。本研究采用單因素試驗初步考察了超聲波法提取十一方藥酒的工藝參數，并以白酒體積分數、白酒用量、提取時間與提取次數為考察因素，以十一方藥酒總固體量、人參皂苷Rg1與大黃酚含量為指標，采用正交試驗法考察超聲波提取十一方藥酒的方法，以為十一方藥酒的制備工藝選擇提供科研依據。

1 材料

1.1 儀器

DCU-20A5型高效液相色譜儀、SPD-20A型紫外檢測儀（日本島津公司）；GH-252型電子分析天平（廣州市艾安得儀器有限公司）；CD-UPT-II-10L型超純水制造系統(tǒng)（成都超純科技有限公司）；KQ3200E型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

人參皂苷Rg1對照品（批號：110703-201027）、大黃酚對照品（批號：110796-201118）均購自中國食品藥品檢定研究院；十一方藥酒（廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑室，批號：20130507、20130523、20130611，規(guī)格：100 ml/瓶）；乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 人參皂苷Rg1含量的測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：WondaSil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.05%磷酸水溶液（22∶78，V/V）；檢測波長：205 nm；流速：1.0 ml/min；進樣量：20 μl；柱溫：30 ℃。在此條件下人參皂苷Rg1可與其他峰完全分離，保留時間約為22.6 min，理論板數不低于5 000。

2.1.2 溶液的制備（1）對照品溶液的制備。精密稱取2.0 mg人參皂苷Rg1對照品，置10 ml量瓶中，加甲醇制成每1 ml含0.20 mg人參皂苷Rg1的對照品溶液。（2）供試品溶液的制備。精密吸取3.0 ml十一方藥酒，水浴蒸干至無醇味，加15 ml水溶解，濾過，濾液用乙醚萃取2次，每次10 ml，棄去乙醚液，水溶液用水飽和的正丁醇萃取3次，每次8 ml，合并正丁醇液，超聲處理30 min，用5%NaOH溶液洗滌2次，每次10 ml，合并正丁醇液，水浴蒸干，殘渣用甲醇溶解于25 ml量瓶中，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 標準曲線的制備 精密吸取人參皂苷Rg1對照品溶液0.4、1.0、1.8、2.6、3.4 ml，置10 ml量瓶中，用甲醇定容，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，連續(xù)進樣3次。以人參皂苷Rg1質量濃度（x）為橫坐標，峰面積積分值（y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y＝1 390.2x+831.7（r＝0.99 80）。結果表明，人參皂苷Rg1質量濃度在8.0～68.0μg/ml范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.2 大黃酚含量的測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：WondaSil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（84 ∶16，V/V）；檢測波長254 nm；流速：1.0 ml/min；進樣量：20 μl；柱溫：30 ℃。在此條件下大黃酚可與其他峰完全分離，保留時間約為13.7 min，理論板數不低于6 000。

2.2.2 溶液的制備（1）對照品溶液的制備。精密稱取大黃酚對照品0.205 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇制成每1 ml含20.5 μg大黃酚的對照品溶液；（2）供試品溶液的制備。精密吸取3.0 ml十一方藥酒，水浴蒸干至無醇味，加入20 ml 10%鹽酸溶液，超聲處理30 min，用氯仿溶液萃取3次，每次10 ml，合并氯仿溶液，加2%碳酸鈉溶液洗滌，棄去碳酸鈉液層，氯仿層用20 ml水洗滌，棄去水層，氯仿層水浴揮干，用甲醇定容于10 ml量瓶中，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 標準曲線的制備 精密吸取0.1、0.3、0.8、1.4、2.0 ml大黃酚對照品溶液，置5 ml量瓶中，用甲醇定容，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以大黃酚質量濃度（x）為橫坐標，峰面積積分值（y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y＝77 726x+7 175.1（r＝0.999 9）。結果表明，大黃酚質量濃度在0.41～8.20 μg/ml范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.3 總固體量的測定

精密量取各樣品溶液50 ml，置已干燥至恒質量的蒸發(fā)皿中，水浴上蒸干，于105 ℃干燥3 h，移至干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定質量，計算總固體量[7]。

2.4 超聲波提取條件對提取效果的影響

2.4.1 浸泡時間考察 在一定條件下，先將十一方藥酒原料藥材用溶劑浸泡不同時間后超聲波（150 W，40 kHz）提取，分別測定人參皂苷Rg1、大黃酚含量與總固體量。藥材浸泡2 h所測得人參皂苷Rg1含量、大黃酚含量與總固體量均最高；3 h后隨浸泡時間的延長，各含量有所下降。結果表明，在超聲波提取前選擇浸泡2 h即可。不同浸泡時間對十一方藥酒提取效果的影響見表1。

2.4.2 藥材粉碎度考察 在成藥的制備過程中，中藥有效成分的浸出常常與擴散面積（粉碎度）和擴散時間有關[8]。在超聲波提取前先將十一方藥酒原料藥材粉碎成不同的粒度，分別測定不同粉碎度下超聲波提取后藥酒中人參皂苷Rg1、大黃酚含量與總固體量。藥材粉碎成最粗粉時人參皂苷Rg1、大黃酚含量最高，總固體量接近高值。結果表明，超聲波提取前藥材粉碎成最粗粉（10目）為宜。不同粉碎度對十一方藥酒提取效果的影響見表2。

表2 不同粉碎度對十一方藥酒提取效果的影響Tab 2 Effect of different grinding degree on the extraction of Shiyifang vinum

2.4.3 白酒體積分數考察 在一定條件下，分別用45%、50%、60%、70%白酒超聲波提取樣品。在其他條件不變的情況下，50%白酒提取得到的各成分含量均最高，60%與70%白酒提取得到的各成分含量有所下降。結果表明，白酒體積分數以50%為宜。不同體積分數白酒對十一方藥酒提取效果的影響見表3。

表3 不同白酒體積分數對十一方藥酒提取效果的影響Tab 3 Effect of different liquor concentration on the extraction of Shiyifang vinum

2.4.4 料液比考察 十一方藥酒不同料液比測定人參皂苷Rg1、大黃酚含量與總固體量。料液比在1 ∶5（g/ml）時，人參皂苷Rg1含量、大黃酚含量與總固體量均最高，當料液比超過1∶5（g/ml）時，各成分含量有所下降。結果表明，選擇料液比1 ∶5（g/ml）較為合適。不同料液比對十一方藥酒提取效果的影響見表4。

表4 不同料液比對十一方藥酒提取效果的影響Tab 4 Effect of different solid-liquid ratio on the extraction of Shiyifang vinum

2.4.5 超聲提取時間考察 在一定條件下，分別對十一方藥酒進行45、60、75、90 min的超聲提取。結果表明，在60 min時，人參皂苷Rg1、大黃酚的含量及總固體量為最高，超聲時間延長其含量反而有所降低。不同超聲提取時間對十方藥酒提取效果的影響見表5。

2.4.6 提取次數考察 在一定條件下，測定十一方藥酒不同提取次數人參皂苷Rg1、大黃酚的含量與總固體量。結果表明，超聲波提取1次時人參皂苷Rg1、大黃酚的含量為最高，總固體量與提取2次接近。說明超聲波提取1次已基本提取完全，從經濟、時間、效率等綜合考慮，選擇提取次數為1次較為合適。不同提取次數對十一方藥酒提取效果的影響見表6。

表5 不同超聲提取時間對十一方藥酒提取效果的影響Tab 5 Effect of different extraction time on the extraction of Shiyifang vinum

表6 不同提取次數對十一方藥酒提取效果的影響Tab 6 Effect of different extraction times on the extraction of Shiyifang vinum

根據單因素試驗結果可知，單因素試驗的優(yōu)化條件為藥材粉碎成最粗粉（10目），浸泡2 h，白酒體積分數為50%，料液比為1∶5（g/ml），提取時間為60 min，提取次數為1次。

2.5 正交試驗優(yōu)選超聲提取最佳工藝條件

在單因素試驗基礎上，以人參皂苷Rg1、大黃酚含量與總固體量為考察指標，白酒體積分數（A）、料液比（B）、提取時間（C）、提取次數（D）為考察因素，每個因素選取3個水平，采用L9（34）正交表進行試驗。中藥有效成分是中藥復方發(fā)揮治療作用的物質基礎[9]，而總固體量影響制劑澄清度和成品穩(wěn)定性。故選擇人參皂苷Rg1、大黃酚作為評價指標權重系數均為0.4，總固體量作為評價指標權重系數為0.2，得到綜合評分。因素水平見表7；正交試驗結果見表8；方差分析結果見表9。

表7 因素與水平Tab 7 Factors and levels

表8 正交試驗結果Tab 8 Results of orthogonal experiment

表9 方差分析結果Tab 9 Results of variance analysis

由表8、表9可知，影響十一方藥酒超聲波提取效果的因素順序為A＞C＞D＞B，即白酒體積分數＞提取時間＞提取次數＞料液比。其中，因素A對試驗結果有非常顯著性影響；因素C對試驗結果有顯著性影響。結合溶劑回收、節(jié)約時間等因素，最終確定超聲波提取最優(yōu)工藝條件為A2B2C3D1，即料液比（1 ∶5）g/ml，50%白酒超聲波提取1次，時間為75 min，這與前述單因素試驗結果比較基本一致。

2.6 工藝驗證試驗

按超聲波提取最佳工藝條件重復試驗3次，測定人參皂苷Rg1、大黃酚含量與總固體量。使用最佳驗證工藝參數，人參皂苷Rg1含量平均為0.445 mg/ml，RSD＝0.70%；大黃酚含量平均為22.10 μg/ml，RSD＝1.53%；總固體量均值為1.604 7 g，RSD＝0.71%。以上數據接近正交試驗結果的最高值，說明正交試驗結果可靠。

3 討論

我院十一方藥酒的制備方法為浸漬法，即將組方藥物粉碎成粗粉，用50 ℃白酒密閉浸泡6個月，定期攪拌，濾過，灌裝，用于院內臨床使用，并獲得了醫(yī)院制劑批準文號（桂藥制字Z01060025）。該法具有生產周期長，溶劑揮發(fā)較多，藥液損耗大等缺點。方中三七、大黃為君藥，三七有效成分為皂苷類，其中以人參皂苷Rg1等成分含量最高[10]。大黃具有清熱瀉下、抗菌、行淤化積、消炎止血、抗腫瘤等功效[11]。筆者已對浸漬法和回流法提取十一方藥酒中人參皂苷Rg1的含量進行了測定[12-13]并與超聲波提取進行比較。結果，超聲波提取十一方藥酒中的人參皂苷Rg1的含量較回流法高，較浸漬法高出2倍，且不需加熱，減少了揮發(fā)性成分的損耗，提取時間也大大減少，只需75 min。

在超聲提取時，為了避免白酒損失，用具塞三角燒瓶進行提取。測定人參皂苷Rg1時分別對乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液[14]、甲醇-水[15]等不同流動相及流動相的不同比例進行了考察，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.05%磷酸水溶液（22 ∶78，V/V）作流動相時人參皂苷Rg1分離效果最好。在人參皂苷Rg1供試品溶液的制備中，還考察了不用堿洗、不同堿洗和堿洗濃度和次數，結果發(fā)現(xiàn)5%NaOH溶液洗2次，人參皂苷Rg1分離效果最好和含量最高。

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