正交試驗(yàn)優(yōu)選暑熱寧口服液揮發(fā)性活性物質(zhì)的提取工藝Δ

李鳳麗，李 進(jìn)，高文遠(yuǎn)，陳 濤#，王進(jìn)博（.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 009；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，天津 009；.天津大學(xué)生命科學(xué)院，天津 009）

暑熱寧口服液為天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床使用多年的醫(yī)院制劑，多用于治療兒童急性上呼吸道感染暑濕兼寒證，該方以葛根芩連湯、藿連湯與香薷飲三方化裁，由廣藿香、香薷、厚樸等13味中藥材提取制備而成。

研究資料表明，方中香薷、廣藿香、厚樸均含有揮發(fā)性活性物質(zhì)[1-4]，為保證復(fù)方藥效，擬將此類成分單獨(dú)提取處理后入藥。本研究采用水蒸氣蒸餾法提取香薷、廣藿香、厚樸混合蒸餾液[5-6]，并以香薷活性成分麝香草酚和香荊芥酚含量為考察指標(biāo)，以L9（34）正交設(shè)計(jì)優(yōu)選最佳提取工藝，最大程度提取暑熱寧口服液中的揮發(fā)性成分，為其作為新藥研究提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

7980A（FID）型氣相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；TCQ250型超聲波清洗器（北京醫(yī)療設(shè)備二廠）；JA2003型電子分析天平（上海精科天平廠）。

1.2 飲片

香薷（批號(hào)：C12080101）、厚樸（批號(hào)：E12080101）由河北康派中藥材有限公司提供；廣藿香（北京盛世龍藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1111124）。以上藥材均經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院陳濤教授鑒定為真品。

1.3 試劑

麝香草酚對(duì)照品（批號(hào)：100508-200902）、香荊芥酚對(duì)照品（批號(hào)：111691-200501）由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；正己烷為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：HP-5彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；柱升溫程序：起始溫度110 ℃，保持10 min，25 ℃/min的速度升溫至230 ℃，保持9.2 min；進(jìn)樣口溫度：220℃；FID檢測(cè)器溫度220 ℃；載氣：高純N2（＞99.99%）；柱流量1.0 ml/min；分流比：10∶1（V/V）；分流進(jìn)樣量：1μl。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取麝香草酚和香荊芥酚對(duì)照品適量，用正己烷制備成麝香草酚質(zhì)量濃度為0.52 mg/ml和香荊芥酚質(zhì)量濃度為0.29 mg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取正交試驗(yàn)優(yōu)選工藝下制備的蒸餾液10 ml，加入環(huán)己烷等體積萃取，萃取3次，每次30min，合并萃取液，自然揮干，正己烷溶解并定容于2 ml量瓶中，搖勻，作為供試品溶液。

2.1.4 陰性溶液的制備 根據(jù)處方精密稱取厚樸、廣藿香藥材適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 氣相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試液；C.陰性對(duì)照；D.空白對(duì)照Fig 1 GC chromatogramsA.mixed control；B.test solution；C.negative control；D.blank control

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 以正己烷為溶劑制成一系列不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度（x，ng/μl）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得麝香草酚和香荊芥酚回歸方程分別為y＝1748.1x+31.5（r＝0.999 92）、y＝1629.4x+16.5（r＝0.999 86）。結(jié)果表明，麝香草酚和香荊芥酚質(zhì)量濃度分別在0.080～2.603 mg/ml、0.045～1.455 mg/ml范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，連續(xù)6次。結(jié)果，麝香草酚和香荊芥酚的RSD分別為0.9%、1.0%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批樣品適量，共6份，分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，麝香草酚和香荊芥酚的RSD分別為1.2%、1.0%，表明方法重現(xiàn)性好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液適量，室溫放置，分別于0、2、4、6、12、24、48 h按“2.1.1”項(xiàng)下色譜添加進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，麝香草酚和香荊芥酚的RSD分別為0.3%、0.3%，表明溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 稱取同一樣品9份，每份5 ml，每3份為一組。每組3份樣品分別精密加入含麝香草酚1.526 8 mg/ml、香荊芥酚0.494 7mg/ml的對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5 ml。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，根據(jù)加入量計(jì)算回收率。結(jié)果，麝香草酚和香荊芥酚的加樣回收率分別為97.9%～101.5%、98.2%～102.4%，RSD分別為1.8%、2.1%。

2.2 單因素試驗(yàn)[7]

2.2.1 提取蒸餾液體積考察 按處方量取香薷、厚樸、廣藿香3味藥材加10倍量水，分別提取生藥量的0.5、1.0、1.5、2.0、2.5倍蒸餾液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并按外標(biāo)法計(jì)算樣品中麝香草酚和香荊芥酚含量。提取蒸餾液體積倍數(shù)對(duì)麝香草酚和香荊芥酚含量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 提取蒸餾液體積倍數(shù)對(duì)麝香草酚和香荊芥酚含量的影響A.麝香草酚；B.香荊芥酚Fig 2 Effect of extraction distillation and liquid volume of thymol and cavacrol grass phenol contentA.thymol；B.carvacrol

2.2.2 浸泡時(shí)間考察 按處方量取香薷、厚樸、廣藿香3味藥材加10倍量水，分別提取生藥浸泡時(shí)間為0、3、6、12、24 h的蒸餾液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并按外標(biāo)法計(jì)算樣品中麝香草酚和香荊芥酚含量。浸泡時(shí)間對(duì)麝香草酚和香荊芥酚含量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 浸泡時(shí)間對(duì)麝香草酚和香荊芥酚含量的影響A.麝香草酚；B.香荊芥酚Fig 3 Effect of time of thymol and cavacrol grass phenol contentA.thymol；B.carvacrol

2.2.3 蒸流速度考察 按處方量取香薷、厚樸、廣藿香3味藥材加10倍量水，提取蒸餾液速度為30～40、50～60、70～80、90～100、110～120滴/min。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并按外標(biāo)法計(jì)算樣品中麝香草酚和香荊芥酚含量。蒸流速度對(duì)麝香草酚和香荊芥酚含量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 蒸餾速度對(duì)麝香草酚和香荊芥酚含量的影響A.麝香草酚；B.香荊芥酚Fig 4 Effect of distillation rate of thymol and cavacrol grass phenol contentA.thymol；B.carvacrol

2.3 正交試驗(yàn)[8-10]

根據(jù)單因素考察結(jié)果，以提取蒸餾液倍數(shù)（A）、浸泡時(shí)間（B）、蒸餾速度（C）為考察因素，分別以麝香草酚和香荊芥酚含量為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表1；正交試驗(yàn)、方差分析結(jié)果見(jiàn)表2～表5。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果（以麝香草酚為考察指標(biāo)）Tab 2 Results of orthogonal experiment（using thymol as index）

表3 方差分析結(jié)果（以麝香草酚為考察指標(biāo)）Tab 3 Analysis of variance（using thymol as index）

由表1～表5可知，對(duì)麝香草酚和香荊芥酚含量影響由強(qiáng)到弱順序均為A＞C＞B，即提取蒸餾液倍數(shù)影響最大。由于麝香草酚含量遠(yuǎn)高于香荊芥酚含量且相關(guān)資料表明麝香草酚藥效活性較明顯，因此首先考慮麝香草酚提取影響的因素，其次要考慮香荊芥酚提取的影響因素。綜合分析，最優(yōu)提取工藝為A2B2C1，即提取蒸餾液倍數(shù)為1.5倍，浸泡12 h，蒸餾速度30～40滴/min。為驗(yàn)證提取1.5倍蒸餾液后是否將有效活性物質(zhì)提取充分，筆者進(jìn)行了其與提取2倍量倍蒸餾液和3倍量倍蒸餾液有效活性物質(zhì)含量比較，發(fā)現(xiàn)三者所含有效活性物質(zhì)總量較接近。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果（以香荊芥酚為考察指標(biāo)）Tab 4 Results of orthogonal experiment（using carvacrol as index）

表5 方差分析結(jié)果（以香荊芥酚為考察指標(biāo)）Tab 5 Analysis of variance（using carvacrol as index）

2.4 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

按處方量取香薷、厚樸、廣藿香3味藥材，在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)所優(yōu)選的工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)定最佳工藝條件下的麝香草酚和香荊芥酚含量，可見(jiàn)該工藝穩(wěn)定可行。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab 6 Results of verification test

3 討論

本試驗(yàn)根據(jù)預(yù)試驗(yàn)與資料查詢直接采用生藥量10倍量水提取蒸餾液，加水量過(guò)少對(duì)藥材浸透效果差，不易于有效物質(zhì)提??；加水量過(guò)多，耗費(fèi)能源，增加成本。同時(shí)，由于影響該試驗(yàn)主要因素較多，所以不將加水量定為考察因素，而將提取蒸餾液倍數(shù)、浸泡時(shí)間、蒸餾速度作為主要考察對(duì)象進(jìn)行研究。

香薷、厚樸、廣藿香3味藥材均含有揮發(fā)性活性物質(zhì)，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其他藥材有效物質(zhì)含量及穩(wěn)定性均較低于香薷中麝香草酚和香荊芥酚，為保證該工藝的合理性，本試驗(yàn)以麝香草酚和香荊芥酚兩個(gè)指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)最佳工藝，結(jié)果穩(wěn)定可行。

預(yù)試驗(yàn)進(jìn)行了香薷、厚樸、廣藿香3味中藥材提取揮發(fā)油和提取蒸餾液比較。二者有效物質(zhì)含量基本相近，由于提取物要溶于水溶液，而暑熱寧口服液又為兒童用藥，不允許添加乙醇等潛溶劑，所以選擇提取蒸餾液較為合理。

在供試品溶液的制備上，采用了環(huán)丙烷、三氯甲烷、乙醚、正己烷、石油醚（30～60 ℃）、石油醚（60～90 ℃）、甲苯、乙酸乙酯萃取[11-12]，同時(shí)對(duì)萃取時(shí)間和萃取溶劑體積進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以環(huán)丙烷等體積萃取3次，每次30 min，萃取效果最佳。

[1]劉瑩，李喜鳳，劉艾林，等.秦海林細(xì)皺香薷葉的化學(xué)成分研究中[J].中草藥，2009，40（9）：1 356.

[2]程雪寧，張宏武，楊立偉，等.藥用廣藿香揮發(fā)油提取物專屬性鑒別方法研究[J].中國(guó)中藥雜志，2010，35（17）：2 270.

[3]舒任庚，胡浩武，張普照，等.不同采收期江香薷揮發(fā)油成分GC-MS分析[J].藥物分析雜志，2010，30（3）：443.

[4]黃瀾，黃麗.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定保濟(jì)丸中厚樸酚和厚樸酚木香烴內(nèi)酯及去氫木香內(nèi)酯的含量[J].藥物分析雜志，2012，32（3）：396.

[5]李玲玲.厚樸揮發(fā)油化學(xué)成分研究[J].中草藥，2001，32（8）：686.

[6]黃家衛(wèi)，盛振華，吳巧鳳.香薷揮發(fā)油的提取工藝研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2010，25（12）：2 136.

[7]袁德彬，張宏，廖穎，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選黑骨藤的超聲提取工藝研究[J].中草藥，2012，43（8）：1 543.

[8]張愛(ài)麗，畢宇安，張慶芬，等.金振口服液矯味工藝研究[J].中草藥，2013，44（5）：562.

[9]閔建華，曹旻旻，韋冬菊，等.微波輔助提取紅景天苷的工藝研究[J].中草藥，2012，43（8）：1 536.

[10]徐忠坤，郭傳寶，殷洪梅，等.正交試驗(yàn)優(yōu)化羌黃祛痹顆粒處方藥材醇提工藝[J].中草藥，2012，43（9）：1 764.

[11]Deng CH，Song GX，Hu YM，et al.Analysis of the volatile constituents of Schisandr a chinesis（Turz.）bail by gaschrom atography-mass spectrometry，using headspace solid-phasemicroext raction[J].Chromatographia，2003，58（5/6）：289.

[12]Deng CH，Song GX，Zheng XH，et al.Analysis of the volatile constituents of Apium graveolens L and Oenanthe L by gas chromatography-mass spectrometry，using headspace solid-phasemicroextraction [J].Chromatographia，2003，57（11/12）：805.