高效液相色譜法測(cè)定八珍益母丸中甘草酸銨的含量

錢鑫，黃婉鋒

·炮制制劑·

高效液相色譜法測(cè)定八珍益母丸中甘草酸銨的含量

錢鑫，黃婉鋒

目的：采用高效液相色譜法測(cè)定八珍益母丸中甘草酸銨的含量。方法：色譜條件：Kromasil C18柱（4.6×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.017mol．L-1磷酸（36︰64）；流速：1mL．min-1；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm。結(jié)果：甘草酸銨在進(jìn)樣量0.086～0.52μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r = 0.9998，回收率（n=6）為99.1%，RSD為1.81%。結(jié)論：本法準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，可用于測(cè)定八珍益母丸中甘草酸銨的含量。

八珍益母丸；甘草酸銨；高效液相色譜；含量測(cè)定

八珍益母丸是由益母草、黨參、白術(shù)、茯苓、甘草、當(dāng)歸、白芍、川芎、熟地黃等組成，具有補(bǔ)氣血，調(diào)月經(jīng)等作用，用于頭暈心慌，疲乏無(wú)力，月經(jīng)量少等癥[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，八珍益母丸能增加更年期雌性大鼠子宮指數(shù)、血清E2和P激素水平，預(yù)防及治療服用利培酮所致的閉經(jīng)，還有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛抗炎作用[2～4]。甘草酸銨為該中成藥中甘草的有效成分之一，具有一定的抗炎作用[5]。因此，本文采用高效液相色譜，通過(guò)方法學(xué)考察和3批樣品的含量測(cè)定，建立了本品中該有效成分的測(cè)定方法。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，重復(fù)性好，結(jié)果可靠，可用于八珍益母丸的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

U-3000高效液相色譜儀：LPG-3400SD四元泵，SR-3000在線脫氣機(jī)，VWD-3100紫外檢測(cè)器，CM-CHM-1數(shù)據(jù)處理工作站（美國(guó)Dionex公司）；AB265-S電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Kromasil C18柱（4.6×250mm，5μm）（瑞典Akzo Nobel公司，柱號(hào)：E32479）；甘草酸銨對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110731-201115，純度93.1%，供含量測(cè)定用）；八珍益母丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號(hào)：1035231、1035232、1035233）；乙腈、甲醇均為色譜純（廣州艾欣科學(xué)儀器有限公司）；磷酸等其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Kromasil C18柱（4.6×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.017 mol．L-1磷酸=36︰64；流速：1mL．min-1；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm。甘草酸銨對(duì)照品、供試品及陰性對(duì)照品溶液的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 甘草酸銨(1)對(duì)照品(A)，供試品(B)及陰性對(duì)照品溶液(C)的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance (A) of ammonium glycyrrhizinate (1), sample (B) and negative (C)

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取甘草酸銨對(duì)照品18.46mg，用甲醇-0.017mol．L-1磷酸溶液（13:7）溶解至10mL，再取1mL，以甲醇-0.017mol．L-1磷酸溶液（13:7）溶解至100mL，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取同一批號(hào)樣品60丸，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約6.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-0.017 mol．L-1磷酸溶液（13:7）50mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率33kHz）30min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇-0.017mol．L-1磷酸溶液（13:7）補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照品溶液的制備 取陰性樣品（除甘草外，其余按本品處方比例稱取適量，依照制備工藝制備成陰性模擬制劑）約6.0g，精密稱定，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量10μL，按照上述色譜條件進(jìn)樣。

2.3 線性關(guān)系考察

分別取對(duì)照品溶液5、10、15、20、25和30μL進(jìn)樣，平行3次，取平均值。結(jié)果表明，在0.086～0.52μg的范圍內(nèi)，甘草酸銨的進(jìn)樣量（X，μg）的對(duì)數(shù)值與峰面積（Y）的對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系，回歸方程：Y=13.839X+0.0178，r=0.9998。

2.4 精密度試驗(yàn)

取甘草酸銨對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下條件重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算甘草酸銨峰面積的RSD（n=6）為1.53%。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)八珍益母丸（批號(hào)：1035232）粉末5份，按“2.2.2”項(xiàng)所述的方法操作，制成供試品溶液，每次進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品中甘草酸銨含量的平均值（n=5）為0.241mg．g-1；RSD為1.67%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取八珍益母丸（批號(hào)：1035232）粉末，精密稱定6.0g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，在0～12h內(nèi)每隔2h，每次進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算甘草酸銨峰面積的RSD為1.48%。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的八珍益母丸（批號(hào)：1035232，含甘草酸銨0.241mg．g-1）粉末6份，每份取約3.0g，精密稱定，分別精密加入甘草酸銨對(duì)照品溶液（0.738mg．mL-1）1mL，揮干溶劑，按“2.2.2”所述的方法操作，制得供試品溶液6份，每次進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 The result of recovery tests

2.8 樣品測(cè)定

對(duì)3批（批號(hào)：1035231、1035232、1035233）樣品進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)工作曲線法測(cè)定含量。結(jié)果3批樣品中甘草酸銨的含量（n=3）分別為0.238、0.241和0.246mg．g-1；RSD分別為：1.78%、1.81%和1.94%。

3 討論

3.1 提取條件的選擇

本文考察了提取溶劑，比較了水、甲醇和不同比例甲醇-0.017mol．L-1磷酸溶液，結(jié)果以甲醇-0.017mol．L-1磷酸溶液（13:7）提取效率最佳，水提取效率最低，故選擇甲醇-0.017mol．L-1磷酸溶液（13:7）作為提取溶劑。以甲醇-0.017mol．L-1磷酸溶液（13:7）為溶劑，分別用超聲、回流和索式提取三種方法提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)索氏提取所得的供試品溶液中甘草酸銨含量較低，因此選擇超聲提取作為提取方法，提取30min后，藥材殘?jiān)幸褵o(wú)檢出甘草酸銨。

3.2 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)考查了不同比例的乙腈-0.017mol．L-1磷酸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以乙腈-0.017mol．L-1磷酸=36︰64作為流動(dòng)相，分離度良好。

綜上可見(jiàn)，本文方法可以準(zhǔn)確、便捷地測(cè)定八珍益母丸中甘草酸銨的含量，重復(fù)性及回收率良好，結(jié)果可靠。為八珍益母丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了依據(jù)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典一部[S]. 北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010: 435.

[2] 王海峰, 張紅, 謝人明, 等. 八珍益母丸對(duì)更年期雌性大鼠卵巢、子宮及激素的影響[J]. 西北藥學(xué)雜志, 2012, 27(4): 344.

[3] 付曉陽(yáng), 瘳彩霞, 羅志明. 八珍益母丸防治利培酮所致閉經(jīng)的療效觀察[J]. 中醫(yī)藥臨床雜志, 2010, 22(4): 319.

[4] 何曉燕, 許紅麗, 孫忠麗. 八珍益母丸鎮(zhèn)痛抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2007, 18(4): 857.

[5] 黃能慧, 李誠(chéng)秀, 羅俊, 等. 甘草酸銨的抗炎作用[J]. 貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 1995, 20(1): 26.

（責(zé)任編輯: 胡慧玲）

Determination of Ammonium Glycyrrhizinate in Bazhen Yimu Pills by HPLC

QIAN Xin, HUANG Wan-feng// (Foshan Institute for Drug Control, Guangdong 528000, China)

Objective:To establish a HPLC method for the determination of ammonium glycyrrhizinate in Bazhen Yimu pills.Method:The chromatographic separation was performed on Kromasil C18column (4.6×250mm, 5μm). Mobile phase was acetonitrile-0.017 mol．L-1phosphoric acid (36:64). The fow rate was 1mL．min-1at 30 ℃ and the detection wavelength was 250 nm.Result:The results showed that the linearity for ammonium glycyrrhizinate was in a range of 0.086 μg～0.52 μg (r = 0.9998), and the average recovery and RSD were 99.1% and 1.81% respectively (n=6).Conclusion:The method is accurate, reliable and reproducible, can be used as a quality control method for ammonium glycyrrhizinate in Bazhen Yimu pills.

Bazhen Yimu pills; ammonium glycyrrhizinate; HPLC; determination

R 283.6

A

1674-926X(2014)01-006-02

廣東省佛山市藥品檢驗(yàn)所，廣東 佛山 528000

錢鑫，女，漢族，學(xué)士學(xué)位，藥師Tel: 0757-83338463 Email: diny_1985@126.com

2013-05-22