沙蔥總黃酮提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化、抗菌作用

薩茹麗，木其爾，王翠芳，包玲玲，敖長(zhǎng)金,*，王思珍

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

沙蔥總黃酮提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化、抗菌作用

薩茹麗1，木其爾1，王翠芳1，包玲玲1，敖長(zhǎng)金1,*，王思珍2

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面方法對(duì)纖維素酶輔助提取沙蔥總黃酮的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)工藝條件為提取時(shí)間4 h、提取溫度39 ℃、體系pH 4.3，沙蔥總黃酮提取量為5.48 mg/g。通過(guò)體外抗氧化及抗菌實(shí)驗(yàn)得出，此條件下提取所得沙蔥總黃酮具有較好的總還原能力、體外清除DPPH自由基及清除羥自由基的能力，對(duì)沙門氏菌具有較好的抑制作用，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用較弱，對(duì)綠膿桿菌無(wú)抑制作用。

沙蔥；總黃酮；響應(yīng)面法；體外抗氧化；體外抗菌

沙蔥（Allium mongolicum Regel）為百合科蔥屬植物[1]，在蒙古語(yǔ)中稱之為“胡穆利”，學(xué)名“蒙古韭”，是廣泛生長(zhǎng)于荒漠草原上的野生植物，營(yíng)養(yǎng)成分豐富，所含氨基酸與微量元素種類齊全[2]。研究表明沙蔥及其提取物，如沙蔥多糖、沙蔥黃酮等在抗氧化[3-5]、抗菌及提高畜產(chǎn)品品質(zhì)[6-8]、改善家畜免疫機(jī)能[9-11]等方面具有較好的生物功效。但因傳統(tǒng)的沙蔥黃酮提取工藝黃酮得率較低，耗時(shí)較長(zhǎng)，不利于大規(guī)模的沙蔥黃酮的提取，所以本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化方案，對(duì)沙蔥總黃酮的纖維素酶酶解法提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)該工藝條件下提取所得沙蔥總黃酮的體外抗氧化以及抗菌作用進(jìn)行研究，旨在為沙蔥資源的全面開(kāi)發(fā)利用與生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與試劑

新鮮沙蔥樣品采自內(nèi)蒙古鄂爾多斯市鄂托克前旗天然牧場(chǎng)。將樣品洗凈，65 ℃烘干，粉碎，過(guò)80 目篩，按1∶10（g/mL）的比例加入石油醚進(jìn)行脫脂、脫色處理，揮干石油醚后得沙蔥粉末，干燥貯存?zhèn)溆肹12]。

菌種：大腸桿菌（ATCC-25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC-25923）、綠膿桿菌（27853）、沙門氏菌（50096），均由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)病原微生物實(shí)驗(yàn)室提供，使用前復(fù)蘇培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 貴州迪大科技有限責(zé)任公司；纖維素酶（cellulase R-10）、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國(guó)Sigma公司；清除羥自由基試劑盒 南京建成生物科技公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；Synergy H4多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰科技有限公司；恒溫水浴鍋 常州諾基儀器有限公司；冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Merck Milipore公司；恒溫培養(yǎng)箱 蘇州威爾公司。

1.3 方法

1.3.1 沙蔥提取物的制備

準(zhǔn)確稱取0.1 g沙蔥粉末置于15 mL試管中，參照文獻(xiàn)[13-14]中的實(shí)驗(yàn)方案并進(jìn)行優(yōu)化，按照料液比1∶50（g/mL）加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液，并加入纖維素酶3mg，調(diào)節(jié)體系pH 4.3，40℃反應(yīng)5h，反應(yīng)結(jié)束后將試管置于沸水中水浴10 min滅活酶后，將所得產(chǎn)物經(jīng)2 000 r/min離心10 min，收集上清液，冷凍干燥后得沙蔥提取物。

1.3.2 沙蔥總黃酮的鑒定

準(zhǔn)確稱取沙蔥提取物100 mg，蒸餾水定容至10 mL即得質(zhì)量濃度為10 mg/mL的沙蔥提取液。對(duì)沙蔥提取液進(jìn)行紫外光譜掃描，初步確定沙蔥提取液中是否存在黃酮類物質(zhì)的特有吸收峰，之后采用紫外線照射法、鹽酸鎂粉法、三氯化鐵法、氫氧化鈉法對(duì)沙蔥提取液中所含的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行特征鑒別，進(jìn)一步確定沙蔥提取液中所含黃酮類物質(zhì)的種類。

1.3.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)[13-14]方法。準(zhǔn)確稱取105 ℃烘干至質(zhì)量恒定的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品6.0 mg，用95%乙醇溶解，定容至10 mL，得0.6 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品原液。將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品原液稀釋成不同質(zhì)量濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液后，按照NaNO2-Al(NO3)3法進(jìn)行反應(yīng)（根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定NaNO2-Al(NO3)3法對(duì)沙蔥中黃酮類化合物的檢測(cè)準(zhǔn)確度較高，精密度與穩(wěn)定性均優(yōu)于其他黃酮類化合物的檢測(cè)方法），使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定反應(yīng)液在510 nm波長(zhǎng)處吸光度，并以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 沙蔥總黃酮提取量的計(jì)算

式中：C為測(cè)定液中總黃酮含量/（mg/mL）；N為稀釋倍數(shù)；V為樣品體積/mL；M為原料質(zhì)量/g。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

影響酶促反應(yīng)的關(guān)鍵因素是酶添加量、提取時(shí)間、提取溫度以及反應(yīng)體系pH值，因此在單因素試驗(yàn)中以體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液為提取溶劑，分別固定料液比1∶50（g/mL）、纖維素酶添加量4.5 mg/g、體系pH 4.4、提取溫度40 ℃、提取時(shí)間3 h，重點(diǎn)考察纖維素酶添加量、體系pH值、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)沙蔥總黃酮提取量的影響。

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，參照文獻(xiàn)[14-15]，依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇對(duì)沙蔥總黃酮提取量影響較顯著的單因素提取時(shí)間、提取溫度及體系pH值為因素，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析方案，試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 沙蔥總黃酮提取響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used in RSM for total flavonoids from Allium mongolicum Regel

1.3.7 沙蔥總黃酮體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.7.1 沙蔥總黃酮總還原能力測(cè)定

總還原能力以吸光度表示，按照本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的沙蔥總黃酮提取工藝提取沙蔥總黃酮原液，經(jīng)冷凍干燥后得沙蔥總黃酮，臨用前使用95%乙醇配制成實(shí)驗(yàn)所需質(zhì)量濃度，對(duì)照組使用相同質(zhì)量濃度的BHT。在試管中分別加入2.5 mL pH 6.6的磷酸鹽溶液，再加入0.01 g/mL的鐵氰化鉀溶液1 mL，混勻后加入不同質(zhì)量濃度的樣品溶液1 mL，充分搖勻后于50 ℃水浴靜置20 min，待冷卻后迅速加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL混勻，吸取2 mL于另一試管中，加入0.1 g/mL的三氯化鐵溶液1 mL混勻，靜置10 min后于700 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。

1.3.7.2 沙蔥總黃酮體外DPPH自由基清除能力測(cè)定

準(zhǔn)確稱取7.88 mg DPPH，用95%乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，得濃度為2×10－4mo1/L的DPPH原液，避光保存（0～4 ℃）。沙蔥總黃酮在實(shí)驗(yàn)前用95%乙醇配制成所需質(zhì)量濃度，對(duì)照組使用相同質(zhì)量濃度的BHT。分別取100 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液與2×10－4mol/L DPPH液100 μL于96 孔板中，中速混勻5 min，避光反應(yīng)30min后測(cè)定525nm波長(zhǎng)處吸光度（Ai）。與此同時(shí)分別測(cè)定100 μL 95%乙醇加100 μL DPPH后的吸光度（Ac）和100 μL待測(cè)液加100 μL 95%乙醇后的吸光度（Aj）。樣品對(duì)有機(jī)自由基的清除能力以清除率表示，清除率按式（2）計(jì)算：

1.3.7.3 羥自由基清除能力測(cè)定

按照南京建成生物科技公司試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.8 沙蔥總黃酮抑菌能力測(cè)定

抑菌圈直徑的測(cè)定與最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）的檢測(cè)試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[5]報(bào)道的方法進(jìn)行，沙蔥總黃酮的體外抑菌率實(shí)驗(yàn)方法參照許穎等[17]的方法進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)使用Excel 2010進(jìn)行初步整理分析，Design-Expert 8.04軟件進(jìn)行響應(yīng)面的設(shè)計(jì)與分析，SAS 9.0軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果以±s表示，n=5。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙蔥總黃酮的鑒定

圖1 紫外掃描結(jié)果Fig.1 UV absorption spectrum of total flavonoids from Allium mongolicum Regel

沙蔥提取液的紫外掃描結(jié)果見(jiàn)圖1，可知沙蔥提取液分別在250～280 nm及330～370 nm存在吸收峰，此結(jié)果符合黃酮類物質(zhì)在紫外吸收區(qū)域有兩個(gè)吸收峰的紫外吸收特征，判斷沙蔥提取液中含有黃酮類物質(zhì)。

表2 黃酮類化合物的顯色反結(jié)果Table 2 Color reactions for identification of the extracted flavonoids

由表2可知，沙蔥提取液經(jīng)多種黃酮類物質(zhì)的特異性顏色反應(yīng)后可以確定沙蔥提取液中含有黃酮類、黃酮醇類化合物，因此將沙蔥提取液命名為沙蔥總黃酮提取液。

2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，以510 nm波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，使用Excel軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，得出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=3.903 8x+0.351 5，方程的決定系數(shù)R2=0.999 8，可以用于沙蔥總黃酮提取液中總黃酮含量的計(jì)算。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 纖維素酶添加量對(duì)沙蔥總黃酮提取量的影響

圖2 纖維素酶添加量對(duì)沙蔥總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of enzyme loading on the extraction efficiency of total flavonoids from Allium mongolicum Regel

固定料液比1∶50（g/mL）、提取溫度40 ℃、反應(yīng)體系pH 4.4、提取時(shí)間2 h，選擇纖維素酶添加量分別為1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 mg/mL，進(jìn)行沙蔥總黃酮的提取。如圖2所示，隨著纖維素酶添加量的增加，沙蔥總黃酮提取量呈現(xiàn)逐漸升高后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，當(dāng)纖維素酶添加量為4.5 mg/mL時(shí)總黃酮提取量最高，由此來(lái)看，0.1 g沙蔥粉末添加4.5 mg/mL的纖維素酶時(shí)酶與底物的添加劑量達(dá)到最佳狀態(tài)，因此在后續(xù)試驗(yàn)中選擇纖維素酶添加量為4.5 mg/mL。

2.3.2 體系pH值對(duì)沙蔥總黃酮提取量的影響

圖3 體系pH值對(duì)沙蔥總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of hydrolysis pH on the extraction efficiency of total flavonoids from Allium mongolicum Regel

固定料液比1∶50（g/mL）、提取溫度40 ℃、纖維素酶添加量4.5 mg/mL、提取時(shí)間2 h，調(diào)節(jié)體系pH值分別為2.4、3.4、4.4、5.4、6.4，進(jìn)行沙蔥總黃酮的提取。如圖3所示，隨著體系pH值的增加，沙蔥總黃酮提取量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)體系pH 4.4時(shí)，沙蔥總黃酮提取量最大，非常顯著高于其他pH值條件下總黃酮提取量（P＜0.01），因此后續(xù)試驗(yàn)中選擇體系pH值為3.4、4.4、5.4作為響應(yīng)面優(yōu)化的中心試驗(yàn)值。

2.3.3 提取溫度對(duì)沙蔥總黃酮提取量的影響

圖4 提取溫度對(duì)沙蔥總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of temperature on the extraction efficiency of total flavonoids from Allium mongolicum Regel

固定料液比1∶50（g/mL）、體系pH 4.4、纖維素酶添加量4.5 mg/mL、提取時(shí)間2h，設(shè)置提取溫度分別為30、40、50、60、70 ℃，進(jìn)行沙蔥總黃酮的提取。如圖4所示，反應(yīng)溫度在30 ℃時(shí)的總黃酮提取量較低，同其他溫度組比較差異顯著（P＜0.05），隨著溫度的升高，總黃酮提取量呈現(xiàn)先升高后減小的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)反應(yīng)所得的沙蔥總黃酮提取量最高，非常顯著高于其他各組（P＜0.01），溫度上升至50 ℃以后總黃酮提取量變化不再明顯，同時(shí)顯著低于40 ℃時(shí)的總黃酮提取量，因此后續(xù)試驗(yàn)中選擇提取溫度為30、40、50 ℃為響應(yīng)面優(yōu)化的中心試驗(yàn)值。

2.3.4 提取時(shí)間對(duì)沙蔥總黃酮提取量的影響

圖5 提取時(shí)間對(duì)沙蔥總黃酮提取量的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on the extraction efficiency of total flavonoids from Allium mongolicum Regel

固定料液比1∶50（g/mL）、反應(yīng)體系pH 4.4、纖維素酶的添加量4.5 mg/mL、提取溫度40 ℃，設(shè)置提取時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h，進(jìn)行沙蔥總黃酮的提取。如圖5所示，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮提取量呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)3 h后，黃酮提取量變化不再明顯，同1、2 h時(shí)黃酮提取量比較差異非常顯著（P＜0.01），因此后續(xù)試驗(yàn)中選擇提取時(shí)間為2、3、4 h作為響應(yīng)面優(yōu)化的中心試驗(yàn)值。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶酶解提取沙蔥總黃酮工藝

響應(yīng)面分析方案及結(jié)果見(jiàn)表3。以沙蔥總黃酮提取量為響應(yīng)值，經(jīng)過(guò)回歸擬合后所得各個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)沙蔥總黃酮提取量的回歸方程為：

Y=5.38+0.29A－0.066B－0.17C－0.027AB+0.032AC+ 0.18BC－0.17A2－1.02B2－0.87C2

表3 沙蔥總黃酮響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and results of RSM for extraction of flavonoids from Allium mongolicum Regel

對(duì)回歸模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表4，該模型回歸顯著（P＜0.001），表明自變量與響應(yīng)值之間的模型關(guān)系顯著；失擬項(xiàng)（P=0.361 6）不顯著，說(shuō)明回歸方程與實(shí)際情況擬合良好；并且該模型決定系數(shù)R2=0.981 6，證明該模型能夠解釋98.16%的響應(yīng)值變化，可以用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)纖維素酶酶解提取沙蔥總黃酮的提取量。F值可以反映出各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)影響的重要性，由F值得到的因素貢獻(xiàn)率為：A＞C＞B，即提取時(shí)間＞體系pH值＞提取溫度。對(duì)模型各項(xiàng)進(jìn)行方差分析可知，模型中一次項(xiàng)A（提取時(shí)間）、交互項(xiàng)B2、C2對(duì)沙蔥總黃酮提取量的影響為非常顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)C（體系pH值）對(duì)沙蔥總黃酮提取量的影響為顯著（P＜0.05），一次項(xiàng)B（提取溫度）、交互項(xiàng)AB、AC、BC、A2對(duì)沙蔥總黃酮提取量的影響不顯著（P＞0.05），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 回歸模型方程的方差分析Table 4 Analysis of variance for the fitted regression model

為進(jìn)一步考察提取溫度、提取時(shí)間以及體系pH值對(duì)沙蔥總黃酮提取量的交互作用，對(duì)其等高線圖和響應(yīng)面圖進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6～8所示。

圖6 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of temperature and hydrolysis time on the extraction efficiency of total flavonoids from Allium mongolicum Regel

由圖6可知，當(dāng)固定體系pH值為4.4時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，沙蔥總黃酮提取量逐漸增加，達(dá)到3 h之后上升趨勢(shì)趨于平穩(wěn)；隨著提取溫度的逐漸升高沙蔥總黃酮提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在40 ℃左右沙蔥總黃酮提取量達(dá)到最大值。

圖7為固定提取溫度為40 ℃時(shí)，體系pH值與提取時(shí)間對(duì)沙蔥總黃酮提取量的影響。由圖7可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，沙蔥總黃酮提取量有逐漸增加的趨勢(shì)，達(dá)到3 h后此上升趨勢(shì)趨于平穩(wěn)。隨著體系pH值的增加沙蔥總黃酮提取量有增加的趨勢(shì)，在pH 4.4時(shí)沙蔥總黃酮提取量達(dá)到最大值，此后隨著pH值繼續(xù)增加沙蔥總黃酮提取量逐漸下降。

圖7 體系pH值和提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of hydrolysispH and time on the extraction efficiency of total flavonoids from Allium mongolicum Regel

圖8 體系pH值和提取溫度對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.8 Response surface and contour plots for the effect of temperature and hydrolysis pH on the extraction efficiency of flavonoids total flavonoids from Allium mongolicum Regel

圖8 表明，固定提取時(shí)間為3 h，隨著提取溫度的逐漸升高沙蔥總黃酮提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，提取溫度達(dá)到40 ℃時(shí)沙蔥總黃酮提取量達(dá)到最高值，之后開(kāi)始逐漸下降。隨著體系pH值的增加沙蔥總黃酮提取量有增加的趨勢(shì)，在pH 4.4左右沙蔥總黃酮提取量達(dá)到最大值，此后隨著pH值繼續(xù)增加沙蔥總黃酮提取量有下降的趨勢(shì)。

通過(guò)數(shù)據(jù)分析得到纖維素酶輔助提取沙蔥總黃酮的理論最佳工藝參數(shù)為提取時(shí)間4 h、提取溫度39.49 ℃、體系pH 4.3，此條件下預(yù)測(cè)沙蔥總黃酮最大提取量為5.51 mg/g。

2.5 最佳提取工藝參數(shù)的驗(yàn)證

實(shí)際應(yīng)用中對(duì)纖維素酶輔助提取沙蔥總黃酮的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，取提取溫度為39 ℃，之后對(duì)同一批沙蔥粉末進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（n=5）。調(diào)整后沙蔥總黃酮提取量為（5.48±0.02）mg/g，接近于理論提取量5.51 mg/g，說(shuō)明該提取工藝可操作性強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定可靠2.6 沙蔥總黃酮體外抗氧化活性

2.6.1 沙蔥總黃酮總還原能力

圖9 沙蔥總黃酮總還原能力Fig.9 Total reducing capacity of total flavonoids from Allium mongolicum Regel

由圖9可知，隨著沙蔥總黃酮質(zhì)量濃度的增加，沙蔥總黃酮的總還原能力呈逐漸增加趨勢(shì)，但相同質(zhì)量濃度條件下，沙蔥總黃酮的總還原能力均顯著低于BHT對(duì)照組（P＜0.01）。

2.6.2 沙蔥總黃酮體外DPPH自由基清除率

圖10 沙蔥總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.10 Scavenging ability against DPPH radicals of total flavonoids from Allium mongolicum Regel

利用DPPH溶液的特征吸收峰，用酶標(biāo)儀測(cè)定加入沙蔥總黃酮后DPPH溶液在525 nm波長(zhǎng)處的吸光度，吸光度的下降程度表示其對(duì)DPPH自由基的清除能力[14]。如圖10所示，沙蔥總黃酮體外對(duì)DPPH自由基的清除能力隨著質(zhì)量濃度的升高而逐漸增大，但相同質(zhì)量濃度條件下沙蔥總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力同BHT對(duì)照組比較降低程度非常顯著（P＜0.01）。

圖11 沙蔥總黃酮對(duì)羥自由基的清除率Fig.11 Scavenging ability against hydroxyl radicals of total flavonoids from Allium mongolicum Regel

2.6.3 沙蔥總黃酮體外清除羥自由基能力由圖11可以看出，不同質(zhì)量濃度的沙蔥總黃酮對(duì)羥自由基的清除率均大于60%，且隨著沙蔥總黃酮質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)羥自由基的清除率有增加的趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05），在相同劑量條件下，沙蔥總黃酮對(duì)羥自由基的清除能力均低于BHT對(duì)照組，且差異非常顯著（P＜0.01）。

2.7 沙蔥總黃酮體外抑菌活性

2.7.1 沙蔥總黃酮抑菌圈直徑與MIC

表5 沙蔥總黃酮抑菌圈直徑以及MICTable 5 Antibacterial activity of total flavonoids from Allium mongolicum Regel in vitro

抑菌圈直徑的大小可表示其抑菌能力的強(qiáng)弱，直徑越大抑菌能力越強(qiáng)。由表5可知，當(dāng)添加的沙蔥總黃酮質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)對(duì)沙門氏菌的抑制能力比大腸桿菌、金黃色葡萄球菌強(qiáng)，抑菌圈直徑為9.5 mm，屬于低度敏感，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制能力均屬于不敏感，對(duì)綠膿桿菌無(wú)抑制作用。本實(shí)驗(yàn)還就沙蔥總黃酮對(duì)各供試菌種的MIC進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示，沙蔥總黃酮體外對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為5 mg/mL，對(duì)沙門氏菌的MIC為2.5 mg/mL。

2.7.2 沙蔥總黃酮抑菌率

使用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽法測(cè)定沙蔥總黃酮體外對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌以及沙門氏菌的抑制率，如圖12所示，將細(xì)菌數(shù)定值在1×104個(gè)/mL時(shí)，隨著沙蔥總黃酮質(zhì)量濃度的升高，其對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的抑制作用均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，相同質(zhì)量濃度條件下對(duì)沙門氏傷寒菌的抑制作用均強(qiáng)于其他3種菌，且差異非常顯著（P＜0.01）。低質(zhì)量濃度（12.5、25 μg/mL）時(shí)沙蔥總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用強(qiáng)于對(duì)大腸桿菌的抑制作用，差異顯著（P＜0.01），質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)沙蔥總黃酮對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用接近，質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)沙蔥總黃酮對(duì)大腸桿菌的抑制作用強(qiáng)于對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用，差異非常顯著（P＜0.01），各質(zhì)量濃度沙蔥總黃酮對(duì)綠膿桿菌均無(wú)顯著抑制作用。

圖12 沙蔥總黃酮體外抑菌作用Fig.12 Growth inhibitory effect of total flavonoids from Allium mongolicum Regel in vitro against four bacteria

3 討 論

3.1 酶解法提取沙蔥黃酮工藝

纖維素酶酶解法是目前廣泛用于植物有效成分提取工藝的一種方法。其反應(yīng)原理是纖維素酶作為輔助提取劑，可直接使植物細(xì)胞壁酶解，導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)部有效成分直接暴露到提取介質(zhì)中，從而得到植物有效活性成分[18]。纖維素酶酶解提取方法雖然對(duì)反應(yīng)條件要求較高，但也因其反應(yīng)條件溫和，除去對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行直接的酶解以外對(duì)其內(nèi)部其他部位無(wú)任何損傷，所以能夠完好地保護(hù)植物有效成分在植物體內(nèi)的生化結(jié)構(gòu)，保證提取所得產(chǎn)物天然生物活性的完好。研究[19-21]表明用此方法可提取獲得含量較高且生物活性完整的天然植物活性成分。除此之外結(jié)合響應(yīng)面分析方法對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，較傳統(tǒng)的正交試驗(yàn)所得提取工藝參數(shù)更準(zhǔn)確，且能夠更加全面地反應(yīng)各個(gè)單因素對(duì)提取量的影響效果。許多學(xué)者均使用響應(yīng)面法優(yōu)化植物有效成分的提取工藝得到了較為準(zhǔn)確的工藝參數(shù)[13-16]，如侯學(xué)敏等[14]利用響應(yīng)面法優(yōu)化薄荷葉總黃酮提取工藝的同時(shí)得到了抗氧化活性較好的黃酮提取物。因此本實(shí)驗(yàn)中選用纖維素酶對(duì)沙蔥植物細(xì)胞壁進(jìn)行破碎，并用響應(yīng)面法優(yōu)化確定沙蔥總黃酮的提取工藝參數(shù)為在1.0 g沙蔥粉中加入4.5 mg/mL纖維素酶，39 ℃條件下保持pH值為4.3提取4 h，提取量可達(dá)到5.48 mg/g，與趙春艷[8]報(bào)道3.6 mg/g相比較總黃酮提取量顯著提高。原因可能是因?yàn)辄S酮類化合物的提取量與植物種類以及提取方法、檢測(cè)手法等密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)中所用原料為新鮮沙蔥脫脂粉末后經(jīng)過(guò)生物酶破壁，使包裹在植物細(xì)胞內(nèi)的黃酮類物質(zhì)得到完全的釋放從而有效地提高了沙蔥黃酮提取量，與此同時(shí)使用響應(yīng)面法進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上更加全面的進(jìn)行分析與組合，從而確定了提取量較高的提取工藝。

3.2 沙蔥黃酮體外抗氧化活性

自由基是機(jī)體組織細(xì)胞正常生理代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一種含有一個(gè)不成對(duì)電子的原子團(tuán)。適量的自由基在機(jī)體中會(huì)起到免疫信號(hào)傳導(dǎo)的作用，但自由基的量超過(guò)其最佳閾值后會(huì)給機(jī)體帶來(lái)許多不良反應(yīng)，可導(dǎo)致細(xì)胞、蛋白以及核酸的氧化損傷。如若不能及時(shí)有效地控制自由基的濃度，清除機(jī)體內(nèi)自由基，則會(huì)使機(jī)體氧化應(yīng)激機(jī)制啟動(dòng)，嚴(yán)重者導(dǎo)致各個(gè)系統(tǒng)的生理功能紊亂、癌變等。許多研究證明導(dǎo)致人類癌癥、糖尿病、老年癡呆以及帕金森等疾病以及衰老死亡生理過(guò)程的罪魁禍?zhǔn)拙褪腔钚匝踝杂苫鵞22-23]。而黃酮類化合物具有較強(qiáng)的抗氧化清除有機(jī)自由基的能力，這與其特殊的結(jié)構(gòu)有一定關(guān)系。黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)中具有多酚羥基以及C2、C3之間的雙鍵和C4酮羰基等結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)均具有較好的供氫和供電子能力，將氫或電子供給機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的自由基后顯著降低自動(dòng)氧化鏈反應(yīng)的速率，從而有效清除有機(jī)自由基，抑制機(jī)體氧化反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)證明使用纖維素酶輔助提取所得的沙蔥總黃酮具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性與陳明珠[24]、石青浩[25]等研究報(bào)道一致。

3.3 沙蔥黃酮抗菌活性

黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)屬于酚類衍生物，而酚類物質(zhì)可以使生物細(xì)胞壁及細(xì)胞膜破碎，細(xì)胞內(nèi)容物擴(kuò)散、細(xì)胞膜通透性改變、細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)與信息的傳遞失衡而起到抑制微生物生長(zhǎng)的作用[26]。因此研究者預(yù)測(cè)黃酮類物質(zhì)也具有類似的抑制微生物生長(zhǎng)的抗菌作用，研究表明黃酮類物質(zhì)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌以及霉菌、真菌等具有一定的抑制作用[27-29]。但其抑菌作用與黃酮類物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中有無(wú)電荷密度較高的部位有關(guān)，與其整個(gè)分子結(jié)構(gòu)中電荷分布有關(guān)[22]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)酶解法提取的沙蔥總黃酮對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均有一定的抑制作用，其中對(duì)沙門氏傷寒菌的抑制作用最強(qiáng)，與張生潭[30]、王文[31]等研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

本研究經(jīng)過(guò)單因素試驗(yàn)確定對(duì)纖維素酶輔助提取沙蔥總黃酮影響較重要的3個(gè)因素為提取時(shí)間、提取溫度和體系pH值，在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶輔助提取沙蔥總黃酮最佳工藝參數(shù)，結(jié)合實(shí)際情況，將工藝參數(shù)調(diào)整為提取時(shí)間4 h、提取溫度39 ℃、體系pH 4.3，在此條件下沙蔥總黃酮的提取量為5.48 mg/g，接近理論最佳提取工藝提取量5.51 mg/g，顯著高于趙春艷[8]研究報(bào)道所得沙蔥總黃酮提取量，所得產(chǎn)物與其所得沙蔥黃酮產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相同[12]，且此法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠，可以用于沙蔥總黃酮的制備。此外本研究還發(fā)現(xiàn)沙蔥總黃酮具有一定的體外抗氧化活性，對(duì)沙門氏菌的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用較弱，對(duì)綠膿桿菌無(wú)抑制作用。

[1] 敖長(zhǎng)金. 沙蔥化學(xué)成分及其生物學(xué)功能研究進(jìn)展[J]. 飼料工業(yè), 2010(18): 5-9.

[2] 巴俊杰, 張春麗, 高建萍, 等. 沙蔥營(yíng)養(yǎng)成分分析[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 23(4): 114-115.

[3] 薩茹麗, 楊斌, 敖長(zhǎng)金. 沙蔥有效提取物對(duì)肉仔雞免疫機(jī)能影響的研究[J]. 飼料工業(yè), 2009, 30(10): 28-41.

[4] 宋巴達(dá)瑪. 沙蔥多糖對(duì)肉羊免疫機(jī)能和抗氧化作用的影響[D]. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010: 5-7.

[5] 烏仁張嘎. 沙蔥揮發(fā)油的提取, 成分鑒定及其體外抑菌效果的研究[D]. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011: 18-20.

[6] 扈瑞平. 沙蔥多糖的分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定及其生物學(xué)活性的研究[D]. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010: 4-5.

[7] 趙麗華. 沙蔥和油料籽實(shí)對(duì)羊肉理化指標(biāo)及食用品質(zhì)的影響[D]. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005: 3-4.

[8] 趙春艷. 沙蔥中黃酮類化合物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其對(duì)小鼠免疫及免疫抗氧化機(jī)能影響的研究[D]. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008: 10-28.

[9] 繆亞娟. 沙蔥異黃酮含量測(cè)定及其對(duì)機(jī)體抗氧化與非特異性免疫影響的研究[D]. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009: 5-6.

[10] 哈斯額爾敦, 敖長(zhǎng)金, 張巧娥, 等. 沙蔥水溶性提取物對(duì)綿羊瘤胃發(fā)酵功能(體外)的影響[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2007, 28(11): 114-116.

[11] 王麗思, 敖長(zhǎng)金, 張興夫. 沙蔥多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的激活作用[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2010, 37(4): 50-52.

[12] 薩茹麗. 沙蔥黃酮提取工藝優(yōu)化、結(jié)構(gòu)鑒定及其相關(guān)生物活性研究[D]. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014: 18-23.

[13] 扶慶權(quán), 侯佩, 陳能. 響應(yīng)面法優(yōu)化蘆蒿葉總黃酮的提取工藝[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(4): 94-98.

[14] 侯學(xué)敏, 李林霞, 張直峰, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化薄荷葉總黃酮提取工藝及抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(6): 124-128.

[15] 呂長(zhǎng)鑫, 李萌萌, 徐曉明, 等. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化纖維素酶提取紫蘇多糖工藝[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(2): 6-10.

[16] 董旭, 杜先鋒. 響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶提取山核桃蒲多酚類物質(zhì)[J].食品科學(xué), 2013, 34(4): 109-113.

[17] 許穎, 李德超, 孫劍. 金銀花醇提液對(duì)根管糞腸球菌生物膜作用體外研究[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2010, 33(6): 49-50.

[18] 楊曉鳳. 酶法提取老鷹茶中黃酮類化合物[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2011, 24(6): 2368-2371.

[19] 公衍玲, 金宏, 黃山, 等. 酶法提取荊芥總黃酮的研究[J]. 中國(guó)林副特產(chǎn), 2011(4): 13-16.

[20] 徐清萍, 安廣杰, 常法玲, 等. 酶法提取懷菊花總黃酮工藝研究[J].鄭州輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2010, 25(5): 31-35.

[21] BOULANOUAR B, ABDELAZIZ G, AZZA S, et al. Antioxidant activities of eight Algerian plant extracts and two essential oils[J]. Industrial Crops and Products, 2013, 46(4): 85-96.

[22] 唐浩國(guó). 黃酮類化合物研究[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2009: 23-274.

[23] 閆琳娜. 松針落葉總黃酮的提取、純化及抗氧化性能分析[D]. 長(zhǎng)春: 吉林大學(xué), 2009: 5-12.

[24] 陳明珠, 申艷艷, 趙越, 等. 槐角黃酮的體外抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(4): 94-96.

[25] 石青浩, 李榮, 姜子濤. 食用鼠曲草黃酮的提取及體外抗氧化性研究[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2013, 32(3): 307-312.

[26] GOULD G W. New methods of food preservation[M]. New York: Aspen Publisher, 1999: 79-83.

[27] 劉平, 陳光輝, 鄧淑華, 等. 金蓮花總黃酮抗菌作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2013, 19(6): 207-209.

[28] 陳曉偉, 韋媛媛, 周吳平, 等. 一點(diǎn)紅總黃酮分離及抗菌研究[J]. 食品科技, 2009, 34(1): 163-165.

[29] 邵明昱. 葫蘆巴種子總黃酮提取分離、抑菌及抗氧化活性的研究[D].烏魯木齊: 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012: 3-12.

[30] 張生潭, 王兆玉, 蘭新宇, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化麻瘋樹(shù)葉總黃酮提取工藝及其抗菌活性研究[J]. 中藥材, 2013, 6(2): 308-311.

[31] 王文, 陶蕾, 趙強(qiáng), 等. 唐古特白刺中黃酮類化合物正交提取工藝與體外抗菌活性研究[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志, 2011(6): 5-8.

Total Flavonoids from Allium mongolicum Regel: Optimization of Extraction Process and Antioxidant and Antibacterial Effects in vitro

SA Ru-li1, MU Qi-er1, WANG Cui-fang1, BAO Ling-ling1, AO Chang-jin1,*, WANG Si-zhen2
(1. College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China; 2. College of Animal Science and Technology, Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao 028000, China)

This report describes the selection and optimization of experimental conditions for cellulase-assisted extraction of total flavonoids from Allium mongolicum Regel using a combination of single factor experiment and response surface methodology. It was demonstrated that the optimal extraction parameters were determined to be hydrolysis at 39 ℃ for 4 h with an initial solvent pH of 4.3, leading to an extraction yield of 5.48 mg/g. Further this study found that the extracted flavonoids had good total reduction capability and scavenging activities against DPPH and hydroxyl radicals, and exhibited strong inhibition against Salmonella. However, the inhibitory effect against E. coli and Staphylococcus aureus was weak, and no inhibition against Pseudomonas aeruginosa was observed.

Allium mongolicum Regel; flavonoids; response surface methodology; antioxidant activity in vitro; antibacterial activity in vitro

S816.9

A

1002-6630（2014）24-0001-08

10.7506/spkx1002-6630-201424001

2014-04-29

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31260558；31160474）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD10B04）

薩茹麗（1986—），女，博士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物營(yíng)養(yǎng)與畜產(chǎn)品品質(zhì)。E-mail：qisaruli@126.com

*通信作者：敖長(zhǎng)金（1962—），男，教授，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物營(yíng)養(yǎng)與畜產(chǎn)品品質(zhì)。E-mail：changjinao@aliyun.com