湘葛一號莖葉中5 種異黃酮成分的高效液相色譜法定量分析

葉惠煊，李 芝，李小軍，黃瑋超，謝 霞，劉向前*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南省中藥現(xiàn)代化研究重點實驗室，湖南 長沙 410208）

湘葛一號莖葉中5 種異黃酮成分的高效液相色譜法定量分析

葉惠煊，李 芝，李小軍，黃瑋超，謝 霞，劉向前*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南省中藥現(xiàn)代化研究重點實驗室，湖南 長沙 410208）

建立高效液相色譜法同時測定湘葛一號地上部分中5 種異黃酮成分含量的方法。采用AT LICHROM C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-水為流動相進行梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長250 nm，柱溫30 ℃。葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素分別在5.00～50.00（r=0.999 4）、1.00～10.00（r=0.999 2）、3.64～36.40（r=0.999 9）、0.50～5.00 μg/mL（r=0.999 8）和0.10～1.00 μg/mL（r=0.999 4）范圍內(nèi)線性良好，檢測限分別為0.94、0.24、0.43、0.08 ng/L和0.05 ng/L，定量限分別為2.85、0.73、1.29、0.25 ng/L和0.15 ng/L。精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，平均回收率分別為100.11%（相對標準偏差（RSD）為1.39%）、99.54%（RSD為1.47%）、98.06%（RSD為0.32%）、101.52%（RSD為1.89%）和101.05%（RSD為0.32%）。該方法快速、準確，操作簡單，可用于湘葛一號地上部分5 種異黃酮成分含量的同時測定。

湘葛一號；高效液相色譜法；葛根素；大豆苷；染料木苷；大豆苷元；染料木素

葛根作為一種重要的藥食同源植物，富含葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素等異黃酮類化合物[1]，除具有解肌退熱、生津止渴、透疹、通經(jīng)活絡(luò)等藥用功效外[2]，還廣泛用作食品原料或添加劑[3]。湘葛一號（Hu’nanPueraria thomsonii Benth）[4]是我國第一個通過雜交選育的葛根新品種，產(chǎn)量高，性狀好，目前已在湖南多地大面積推廣栽培。

目前，國內(nèi)外學(xué)者對葛根的化學(xué)成分[5-9]及其藥理作用[10-14]已有比較多的報道，但對其廢棄的地上部分鮮有報道。大量的葛根地上部分被廢棄，破壞環(huán)境且造成極大的資源浪費，如何對葛根廢棄的地上部位的合理利用是我們需要思考的問題?，F(xiàn)今，已有對三七[15-16]、酸棗[17]、川芎[18]、當歸[19]等藥、食用資源的地上廢棄部分的化學(xué)成分進行了研究，并取得了一定的進展。為了綜合開發(fā)利用葛根資源，系統(tǒng)研究湘葛一號的使用價值，在本課題組研究基礎(chǔ)上[20]，本實驗進一步采用高效液相色譜法同時測定了不同采收期湘葛一號地上部分莖和葉中葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素5 種異黃酮類化合物，為充分利用湘葛一號地上部分提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

湘葛一號地上部分的莖和葉，于2011年5月至12月采至湖南省常德市湘葛一號種植基地，所有樣品粉碎過60 目篩后備用。

葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素（質(zhì)量分數(shù)≥98%，批號分別為110752-200511、111738-200501、111709-200501、111505-200402、111704-200501） 中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司；AUW220D分析天平 日本島津公司；FW177中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；予華HH-S型水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

色譜柱：AT LICHROM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（V/V），梯度洗脫；流速1 mL/min；檢測波長250 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。梯度洗脫程序見表1。在上述色譜條件下，各待測成分分離度良好，色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品（A）、湘葛一號莖（B）、湘葛一號葉（C）的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC of mixed reference substances (A), and isoflavones in stems (B) and leaves (C) of Pueraria thomsonii Benth

1.3.2 混合對照品溶液的制備

分別取葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素和染料木苷對照品適量，精密稱定，置于同一25 mL量瓶中，加入適量甲醇溶解并稀釋到刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.050 0、0.010 0、0.036 4、0.005 0、0.001 0 mg/mL的混合標準品溶液，備用。

1.3.3 供試品溶液的制備

取湘葛一號莖粉末（201112 S）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積分數(shù)50%乙醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，80 ℃水浴加熱回流50 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用體積分數(shù)50%乙醇補足減少的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

精密量取混合對照品溶液各1、2、4、6、8、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，按1.3.1節(jié)色譜條件分別進樣10 μL。以峰面積為縱坐標，混合對照品質(zhì)量濃度為橫坐標進行線性回歸。按信噪比的3 倍和10 倍考察檢測限和定量限，結(jié)果見表2。

表2 5 種異黃酮成分的線性關(guān)系Table 2 Linear equations for five isoflavones

2.2 精密度實驗

取同一混合對照品溶液，連續(xù)進樣6 次，測定峰面積。計算得葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為0.11%、2.27%、2.63%、2.07%和0.67%，表明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性實驗

穩(wěn)定性實驗包括日內(nèi)穩(wěn)定性與日間穩(wěn)定性。取同一供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、8、12、24 h及2、3、4、5、6 d后進樣，計算得葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的峰面積RSD分別為0.87%、1.92%、0.72%、1.54%和2.56%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。計算得葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的峰面積RSD分別為0.55%、0.74%、0.87%、1.28%和2.65%，表明供試品溶液在6 d內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性實驗

取201112 S粉末6 份，按1.3.3節(jié)方法制備供試品溶液，分析計算得葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素峰面積的RSD分別為1.45%、1.63%、1.88%、0.64%和1.26%，表明本法重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收實驗

取201112 S粉末6 份，每份約1 g，精密稱定，分別精密加入適量的對照品混合溶液，按照1.3.3節(jié)方法制備供試品溶液，依次測定，分別計算各對照品的平均回收率。結(jié)果表明，葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的平均回收率分別為100.11%、99.54%、98.06%、101.52%和101.05%，RSD分別為1.39%、1.47%、0.32%、1.89%和0.32%。

2.6 樣品測定

分別精密吸取一年內(nèi)不同采收期湘葛一號不同部位供試品溶液10 μL，進樣測定。分別采用外標法計算葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量。具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 湘葛一號不同部位含量測定結(jié)果比較（n=3）Table 3 Comparison of isoflavone contents in stems and leaves of Pueraria thomsonii Benth (n=3) mg/g

3 討論與結(jié)論

在制備供試品溶液時，筆者考察了不同提取方法（超聲和回流），不同提取溶劑（甲醇、體積分數(shù)30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和95%乙醇），不同提取時間（30、40、50 min和60 min），不同提取溫度（40、50、60、70、80 ℃和90 ℃）等方法。結(jié)果表明，本實驗最佳提取條件為提取溶劑體積分數(shù)50%乙醇、提取溫度80 ℃、回流時間50 min。

對一年生不同采收期的湘葛一號莖的主要異黃酮成分含量的比較分析發(fā)現(xiàn)：葛根素含量12月＞11月＞9月＞5月＞10月＞7月＞8月＞6月；大豆苷含量12月＞5月＞11月＞9月＞8月＞10月＞7月＞6月；染料木苷含量12月＞9月＞11月＞8月＞10月＞5～7月；大豆苷元含量12月＞11月＞8月＞6月＞7月＞10月＞9月＞5月；染料木素含11月＞12月＞8月＞10月＞5月＞7月＞9月＞6月?？傮w看出，12月份的莖總異黃酮含量最高，6、7月份的含量相對較低。而5～12月份的湘葛一號葉中5 種異黃酮成分含量雖然均較低，但也呈現(xiàn)一定的動態(tài)變化，具體原因有待進一步研究。

由于湘葛一號的植物學(xué)特性[21]，其蘆頭（塊根近莖部位約三分之一處）纖維較高，粉性少，在采收時都要將其削除，造成大量的浪費。故本實驗還進一步對9月份湘葛一號蘆頭進行檢測（表3），實驗發(fā)現(xiàn)蘆頭中除染料木素未檢測到外，其余4 種異黃酮成分含量均較高。值得注意的是，其葛根素、大豆苷和大豆苷元的含量顯著高于同時期的莖和葉部，極具綜合利用價值，故今后課題組將對不同產(chǎn)地、不同采收期湘葛一號蘆頭作為研究重點。

本實驗方法建立的同時測定湘葛一號地上部分異黃酮成分含量檢測方法快速、簡便、靈敏度高，可用于湘葛一號廢棄部位的含量控制。湘葛一號的莖葉中，尤其是莖中含有相對較高的異黃酮類成分，完全能夠變廢為寶，作為提取分離這些有效成分的新資源。

[1] 劉喜舞, 戴玲, 葉惠煊, 等. HPLC法同時測定中國、泰國葛根中異黃酮的含量[J]. 中國藥師, 2013, 16(5): 668-670.

[2] 尤春雪, 張振秋, 李峰, 等. HPLC波長切換技術(shù)對葛根中8 種成分的測定及指紋圖譜研究[J]. 中草藥, 2013, 44(5): 616-621.

[3] 王星敏, 殷鐘意, 鄭旭煦, 等. 微生物酶解破壁提制葛根黃酮的工藝[J].食品科學(xué), 2011, 32(2): 28-31.

[4] 葉惠煊, 劉向前, 劉恒言, 等. 湘葛一號總黃酮與氣候因子的灰色關(guān)聯(lián)度分析[J]. 西北藥學(xué)雜志, 2013, 28(5): 443-447.

[5] WU Yanfang, WANG Xinsheng, FAN Enguo. Optimisation of ultrasound-assisted extraction of puerarin and total isoflavones from puerariae lobatae radix (Pueraria lobata (Wild.) Ohwi) with response surface methodology[J]. Phytochemical Analysis, 2012, 23(5): 513-519.

[6] ZHAO Chenxi, CHAN H Y, YUAN Dalin, et al. Rapid simultaneous determination of major isoflavones of Pueraria lobata and discriminative analysis of its geographical origins by principal component analysis[J]. Phytochemical Analysis, 2011, 22(6): 503-508. [7] YUSAKUL G, PUTALUN W, UDOMSIN O, et al. Comparative analysis of the chemical constituents of two varieties of Pueraria candollei[J]. Fitoterapia, 2011, 82(2): 203-207.

[8] SATOKO S, TAKUYA K, TSUTOMU I, et al. Quantitative analysis of miroestrol and kwakhurin for standardization of Thai miracle herb‘Kwao Keur’ (Pueraria mirif i ca) and establishment of simple isolation procedure for highly estrogenic miroestrol and deoxymiroestrol[J]. Natural Product Research, 2013, 27(4/5): 371-378.

[9] SAGE R, COINER H, WAY D, et al. Kudzu [Pueraria montana (Lour.) Merr. Variety lobata]: a new source of carbohydrate for bioethanol production[J]. Biomass Bioenergy, 2009, 33: 57-61.

[10] BOONCHIRD C, MAHAPANICHKUL T, CHERDSHEWASART W. Differential binding with ERá and ERa of the phytoestrogen-rich plant Pueraria mirifica[J]. Brazilian Journal of Medical Biological Research, 2010, 43(2): 195-200.

[11] LATIPORN U, THAWEESAK J, WARAPORN P, et al. Down regulation of gene related sex hormone synthesis pathway in mouse testes by miroestrol and deoxymiroestrol[J]. Fitoterapia, 2011, 82(8): 1185-1189.

[12] 肖冰心, 王倩, 樊利青, 等. 葛根黃酮提高桑白皮降糖活性及其機制研究[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2013, 19(3): 179-183.

[13] NIU Ling, LI Dongye, XIA Yong, et al. Effect of puerarin on the myocardial perfusion and ventricular wall motion in patients with acute coronary syndrome[J]. Journal of Geriatric Cardiology, 2008, 5(2): 50-53.

[14] CHANG Yi, HEIEH C Y, PENG Z A, et al. Neuroprotective mechanisms of puerarin in middle cerebral artery occlusion-induced brain infarction in rats[J]. Journal of Biomedical Science, 2009, 16(9): 9-21.

[15] 韓凌, 張翼菲, 趙余慶. 三七地上部分現(xiàn)代藥學(xué)與生物活性研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2007(6): 19-21.

[16] 韓穎, 胡筱敏, 姜彬慧, 等. Fusarium sacchari對三七莖葉中有效成分生物轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2007, 18(12): 2801-2806.

[17] GUO Sheng, DUAN Jinao, TANG Yuping, et al. Triterpenoids from the fruits of Ziziphus jujube var. spinosa[J]. Biochemical Systematics and Ecology, 2011, 39(4): 880-882.

[18] 任東春, 楊念云, 錢士輝, 等. 川芎地上部分化學(xué)成分研究[J]. 中國中藥雜志, 2007, 32(14): 1418-1420.

[19] YANG N Y, ZHOU G S. Two new α-pinene derivatives from Angelica sinensis and their anticoagulative activities[J]. Fitoterapia, 2011, 82(4): 692-695.

[20] 葉惠煊, 譚舟, 劉向前, 等. 濕法消解-原子熒光光譜法測定湘葛一號中的砷汞鉛[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(4): 151-154.

[21] 曾躍輝, 熊力夫, 蔡壯夫, 等. 湘葛一號的選育及豐產(chǎn)栽培技術(shù)研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007(3): 83-85.

Simultaneous Determination of Five Isoflavones in Stems and Leaves of Pueraria thomsonii Benth ‘Xiangge No.1’ by HPLC

YE Hui-xuan, LI Zhi, LI Xiao-jun, HUANG Wei-chao, XIE Xia, LIU Xiang-qian*
(Modernization Laboratory of Traditional Chinese Medicine and Drug, College of Pharmacy, Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410208, China)

An HPLC method was presented for the simultaneous determination of five isoflavones simultaneously in the aerial (leaves and stems) parts of Pueraria thomsonii Benth ‘Xiangege No.1’. The chromatography was performed on an AT LICHROM C18column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) with a mobile phase of methanol-water by gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min, and the detection wavelength was set at 250 nm and the column temperature at 30 ℃. The calibration curves for puerarin, daidzin, genistin, daidzein and genistein were linear in the range of 5.00-50.00 (r = 0.999 4), 1.00-10.00 (r = 0.999 2), 3.64-36.40 (r = 0.999 9), 0.50-5.00 (r = 0.999 8) and 0.10-1.00 μg/mL (r = 0.999 4), respectively. The LODs were 0.94, 0.24, 0.43, 0.08 and 0.05 ng/L, and the LOQs were 2.85, 0.73, 1.29, 0.25 and 0.15 ng/L. The method had good precision, stability and reproducibility, and the mean recoveries for puerarin, daidzin, genistin, daidzein and genistein were 100.11% (RSD = 1.39%), 99.54% (RSD = 1.47%), 98.06% (RSD = 0.32%), 101.52% (RSD = 1.89%) and 101.05% (RSD = 0.32%), respectively. In conclusion, this study has proposed a rapid, accurate and simple method which allows the simultaneous determination of five isoflavones in the aerial parts of Pueraria thomsonii Benth.

Hu’nan Pueraria thomsonii Benth; high performance liquid chromatography; puerarin; daidzin; genistin; daidzein; genistein

R284.1

A

1002-6630（2014）14-0141-04

10.7506/spkx1002-6630-201414027

2014-01-13

湖南省自然科學(xué)基金重點項目（11JJ2042）；長沙市科技局科技計劃重點項目（K1207010-21）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥物分析學(xué)“十二五”校級重點學(xué)科建設(shè)項目（2012-2）

葉惠煊（1988—），男，碩士研究生，研究方向為中藥質(zhì)量控制及其活性成分。E-mail：yehuixuan@qq.com

*通信作者：劉向前（1967—），男，教授，博士，研究方向為中藥質(zhì)量控制及其活性成分。E-mail：lxq0001cn@163.com